代謝相關(guān)脂肪性肝病血清生物標志物研究進展

劉雪冰 丁潔霞 金潔 范震 朱婧

隨著現(xiàn)代人生活方式、飲食習(xí)慣的改變，代謝相關(guān)脂肪性肝疾病（metabolic associated fatty liver disease，MAFLD）的發(fā)病率日益升高［1］，按照疾病進程可將MAFLD分為代謝相關(guān)性脂肪肝（metabolic associated fatty liver disease，MAFLD）和代謝相關(guān)性脂肪性肝炎（metabolic associated fatty liver disease，MASH），前者通常是良性病變，但后者可能進展為肝纖維化、肝硬化、肝衰竭甚至肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC），嚴重危害身體健康。目前全球有約25%的人患有MAFLD，在我國MAFLD患病率已達29.2%［2］，MAFLD逐步成為我國慢性肝病的主要原因。由于MAFLD起病隱匿，缺乏典型特征，且臨床表現(xiàn)、疾病進展、預(yù)后差異很大，易造成臨床干預(yù)不及時，導(dǎo)致不良預(yù)后［3］。因此，準確診斷MAFLD患者的脂肪變、炎癥和纖維化程度，識別進展性肝纖維化和MASH對于確定治療時機、方法以及判斷預(yù)后具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)較多血清標志物與MAFLD疾病進程密切相關(guān)，成為診斷MAFLD并預(yù)測其進展的重要方法之一［4］。本文旨在闡述可能用于診斷和評估MAFLD的血清標志物，為MAFLD的無創(chuàng)檢驗提供指導(dǎo)。

1 細胞角蛋白-18（cytokeratin 18，CK-18）

CK-18被認為是目前MASH診斷和分級的最有價值的血清標志物之一。其是一種中間絲蛋白，在肝臟蛋白中占5%［5］，作為肝細胞膜中的一種重要骨架蛋白，CK-18能夠保護肝細胞抵抗壓力，起到維持肝細胞形態(tài)的作用。在肝臟凋亡過程中，CK-18由天冬氨酸蛋白水解酶在Asp 396位點裂解為M30和M65兩個片段［6］。因此當MASH肝細胞發(fā)生凋亡時，血清中CK-18及其裂解產(chǎn)物M30和M65的水平也隨之升高。KAWANAKA等［5］研究發(fā)現(xiàn)，當CK-18＞ 375 U/L時，其診斷MASH的AUC為0.79，敏感性81.5%，特異性65%；FELDSTEIN等［7］研究表明，在診斷MASH時，基于CK-18（AUC 0.83）的預(yù)測明顯優(yōu)于AST（AUC 0.64）、ALT（AUC 0.58）和γ-GT（AUC 0.57），可作為MASH的獨立預(yù)測因子，該報道指出，CK-18血漿水平每增加50 U/L，發(fā)生MASH的可能性就增加30%；此外，MASH患者中出現(xiàn)肝臟纖維化進展的血清CK-18片段水平明顯高于未發(fā)生纖維化的患者；HE等［8］在2017年發(fā)表一項Meta分析，認為當CK-18的m30片段截斷值為121.6～380.2 U/L時，其相應(yīng)的敏感度為0.60～0.95，特異度為0.60～0.97，AUC為0.66～0.93；CK-18的m65片段截斷值為243.8～790 U/L時，其相應(yīng)的敏感度為0.62～1，特異度為0.65～0.89，AUROC為0.71～0.93。上述研究表明，CK-18可作為檢測MASH的一種獨立血清標志物，并具有較高的敏感度及特異度。但HE等［8］也提出，多種血清標志物聯(lián)合使用構(gòu)成的評價體系（如MACK-3，包括 AST、HOMA和CK18）比單獨使用CK-18更能提高其診斷MASH的準確性。

2 成纖維細胞生長因子21（fibroblast growth factor-21，F(xiàn)GF-21）

FGF-21存在于多種器官和組織中，如肝臟、胰腺、脂肪、肌肉等。FGF-21是一種內(nèi)分泌信使，通過激活膽汁酸-法尼類X受體（FXR）軸來控制限速酶CYP7A1的表達，后者是肝臟中膽汁酸經(jīng)典合成途徑的限速酶，因此FGF21被認為是調(diào)節(jié)膽汁酸/膽固醇合成的關(guān)鍵因素，能夠起到減少肝臟脂肪積累、降低炎癥及纖維化水平、從而逆轉(zhuǎn)肝臟脂肪變性的功能［9］。HE等［8］認為，其診斷評分、診斷比值比、敏感度和特異性分別為1.74（95%CI 1.22～2.26）、5.70（95%CI 3.38～9.62）、0.62（95%CI 0.50～0.73）和0.78（95%CI 0.70～0.84）；BARB等在一項包含187個病例的橫斷面研究中發(fā)現(xiàn)：血漿FGF-21濃度的升高與胰島素抵抗及MASH的嚴重程度密切相關(guān)，且隨肝臟炎癥壞死的嚴重程度而增加（P=0.02），在纖維化的過程中最為顯著，但不隨脂肪變性而變化［10］。

3 血清鐵蛋白（serum ferritin，SF）

人體內(nèi)的鐵主要由二價鐵及三價鐵組成，鐵蛋白可結(jié)合三價鐵并大量存在于肝臟中，使肝臟成為體內(nèi)最大的儲鐵器官。對肝細胞和肝組織的許多體外和體內(nèi)研究表明，肝鐵負荷的增加可引起氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致鐵代謝失衡及肝細胞損傷，鐵蛋白釋放入血使得血清鐵蛋白含量增高。因此，SF一定程度上能夠反映肝細胞壞死的嚴重程度［11］。KOWDLEY等［12］在一項628例經(jīng)活檢證實的MAFLD且伴高鐵蛋白血癥的隊列中發(fā)現(xiàn)，血清鐵蛋白＞1.5倍正常上限值（ULN）的患者具有更為顯著的MAFLD組織學(xué)特征，并與肝臟晚期肝纖維化及MAFLD活動分數(shù)成正相關(guān)，從而指出血清鐵蛋白升高是MAFLD患者組織學(xué)嚴重程度和晚期纖維化的獨立預(yù)測因子，可用于識別患有MASH和具有晚期纖維化風(fēng)險的MAFLD患者；BUZZETTI等［13］在一篇納入468名經(jīng)活檢證實為MAFLD的隊列研究發(fā)現(xiàn)，鐵蛋白水平隨著肝纖維化的惡化而增加，但不是晚期纖維化的獨立預(yù)測因子。GOH等［14］在一項納入405名活檢證實MAFLD的患者的研究中發(fā)現(xiàn)，血清鐵蛋白水平升高與MASH的存在呈正相關(guān)，但他同時也指出，單獨使用鐵蛋白診斷MASH的準確性有限，將其納入脂肪性肝炎預(yù)測評分（NPS）可以有效提高MASH診斷的準確性。

4 血紅素氧合酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）

HO-1又被稱作熱休克蛋白32（HSP32），是一種重要的氧化應(yīng)激蛋白，可由多種氧化劑誘導(dǎo)，在心臟、肺臟、肝臟、脾臟等器官都有分布，是將血紅素分解為膽綠素、一氧化碳（CO）和游離二價鐵這一過程的起始酶和限速酶。多項研究表明，HO-1可以通過分解血紅素產(chǎn)生的CO及游離二價鐵降低細胞生長抑制，減少細胞凋亡。此外，HO-1也可以降低炎癥因子表達（如TNF-α），從而起到抗氧化應(yīng)激、抗炎從而保護肝細胞的作用［15］。MALAGUARNERA等在一項納入了60名病例的研究中發(fā)現(xiàn)，MASH患者的HO-1表達與MASH的程度呈正相關(guān)，反映了疾病的嚴重程度。同時也指出，HO-1與鐵蛋白水平、脂質(zhì)過氧化物之間也有著顯著相關(guān)性［16］；苑喜微等在一項共納入441例病例的回顧性研究中發(fā)現(xiàn)，血漿HO-1水平隨MAFLD發(fā)病及進展依次遞增，可作為影響MAFLD進展的獨立因素（OR值1.363，P＜0.05），基于ROC曲線（AUC 0.962）分析其靈敏度為85.10%，特異度為92.9%，并指出，MASH中HO-1升高可能是機體的一種自我保護機制［17］。綜上所述，HO-1可以減少肝脂肪變性，降低炎癥因子表達，保護肝細胞的作用，作為負調(diào)控因子間接反映MASH的嚴重程度。當前有多種基于強化HO-1表達用以治療MASH的藥物正在研究中。

5 血小板反應(yīng)蛋白2（thrombospondin-2，THBS2/TSP2）

血小板反應(yīng)蛋白家族是一種細胞外基質(zhì)（ECM）中具有多結(jié)構(gòu)域的分泌型Ca2+相關(guān)糖蛋白，包括THBS1、THBS2、THBS3、THBS4和THBS5，它們能夠直接或間接與多種細胞因子、生長因子、細胞受體、蛋白酶和細胞外基質(zhì)等相互作用，從而調(diào)節(jié)不同類型細胞對環(huán)境刺激的活性，誘導(dǎo)細胞黏附、運動和分化［18］。其中，由THBS2基因編碼的THBS2/TSP2主要在成纖維細胞中表達，能夠促進膠原蛋白及纖維蛋白的形成、骨骼生長、維持血管密度、止血和細胞黏附特性等，在傷口修復(fù)和組織重塑過程中起作用［19］。CALABRO等［20］研究表明，在THBS基因敲除的小鼠皮膚組織中，纖維膠原蛋白、結(jié)構(gòu)蛋白、ECM相關(guān)蛋白水平均出現(xiàn)了一定程度的降低。TAKEFUMI KIMURA等在一項納入130個病例的回顧性橫斷面研究中發(fā)現(xiàn)，血清TSP2水平與MAFLD病理特征分級具有顯著相關(guān)性，如脂肪變性（r=0.23，P=0.008）、小葉炎癥（r=0.37，P＜0.001）、氣球變性（r=0.56，P＜0.001）和纖維化（r=0.53，P＜0.001）呈正相關(guān)，在氣球變性和纖維化過程中最為顯著；KIMURA等發(fā)現(xiàn)，在氣球變性中，TSP2的AUC為0.78，界值（cutoff）為14.4 ng/mL，相應(yīng)的敏感度為72%，特異度為75%，陽性預(yù)測值為41%，陰性預(yù)測值為92%；在肝纖維化中，TSP2的診斷相關(guān)指標隨分期改變而不同，當TSP2界值在17.9～28.2 ng/mL之間時，相應(yīng)AUC為0.73～0.82，敏感性為85～93%，特異性為35%～65%，陽性預(yù)測值為36～89%，陰性預(yù)測值為69%～97%。對比MAFLD的5個常規(guī)參數(shù)-CK-18 M30、血清透明質(zhì)酸（HA）、IV型膠原蛋白7S（IV-C7S）、APRI評分和FIB-4評分，THBS2在預(yù)測氣球變性方面表現(xiàn)出的相關(guān)性最高（r=0.56），其次為脂肪變性和小葉炎癥［19］。綜上，鑒于THBS2在肝細胞氣球變性和纖維化中的顯著相關(guān)性，可將其認為是具有良好前景的診斷MASH非侵入性指標之一。

6 IV型膠原蛋白（IV collagen protein，IV-C）

IV-C是形成基底膜的細胞外基質(zhì)（ECM）的一部分，由三個片段組成：N端7S片段、中心三螺旋片段和C端NC1片段。有研究表明，在肝纖維化過程中，肝星狀細胞被激活后轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞，分泌促纖維化因子和過量的細胞外基質(zhì)（ECM）蛋白，IV型膠原蛋白及其片段作為ECM組成部分與纖維化的進展密切相關(guān)，其血清水平能夠有效反映肝纖維化的嚴重程度［21］。MASAYUKI等在一項納入184例患者的回顧性研究中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)活檢診斷為MASH的患者血清IV-C7S高于MAFL患者［21］。STEFANO等［22］在一項納入126例經(jīng)活檢證實為MAFLD患者的回顧性研究中發(fā)現(xiàn)，IV-C在診斷顯著纖維化（F2-F4）和晚期纖維化（F3-F4）的準確度均高于透明質(zhì)酸（HA）、原膠原蛋白III型（PCIII）、層粘連蛋白（LN）和膽堿甘氨酸（CG），IV-C高于30ng/mL的患者相比低于此值的患者進展為顯著纖維化（F2-F4）的風(fēng)險高5.57倍，發(fā)生晚期纖維化（F3-F4）的風(fēng)險高7.61倍。此外，也有不少研究人員以IV-C7S片段為檢測指標評估MASH程度。TAKESHI在一項納入156例患者的回顧性研究中發(fā)現(xiàn)，IV-C7S可作為MASH（AUC0.825，敏感度26.8%，特異度31.4%）和MASH相關(guān)纖維化（AUC0.895，敏感度95.2%，特異度96.3%）的有效預(yù)測因子，并指出相比炎癥和脂肪變性，IV-C 4S對肝纖維化的預(yù)測準確性更高［23］。因此，IV-C及IV-C7S片段對纖維化程度的預(yù)測準確性尤其靈敏，可有效反映MASH的疾病進展。

7 脂聯(lián)素（Adiponectin）

脂聯(lián)素是一種脂肪細胞因子（包括脂聯(lián)素、TNF-α，瘦素和抵抗素），能夠通過結(jié)合其受體AdipoR1和AdipoR2激活A(yù)MPK途徑和PPARα途徑，抵抗炎癥反應(yīng)、促進葡萄糖攝取并增強脂肪氧化，減少脂質(zhì)合成，從而降低脂肪浸潤，改善胰島素抵抗，促進MASH恢復(fù)，改善肝纖維化［24］。在MAFLD患者中，脂聯(lián)素的濃度降低，引起脂肪因子失衡導(dǎo)致疾病的進展。KAMADA等［25］在脂聯(lián)素基因敲除（KO）的MASH小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，KO小鼠的肝臟脂肪變性程度比野生組（WT）小鼠更明顯，14只KO小鼠中有6只進展為肝硬化和肝腫瘤，而15只WT小鼠僅表現(xiàn)為單純性脂肪變性，表明低脂聯(lián)素血癥可能是MASH相關(guān)肝腫瘤形成的危險因素。陳麗麗等［26］在一項納入82例患者的回顧性研究中發(fā)現(xiàn)，重度MASH患者的血清APN水平均顯著低于輕度組和中度組（P＜0.05）。多項研究發(fā)現(xiàn)，APN的水平與MAFLD病情嚴重程度呈負相關(guān)，表明脂聯(lián)素及其激動劑有可能成為治療MAFLD的新藥物，但脂肪因子作用機理復(fù)雜仍需進一步研究，目前尚不能作為診斷MAFLD的獨立預(yù)測因子。

8 角鯊烯環(huán)氧化酶（squalene epoxidase，SQLE）

膽固醇是MASH發(fā)生過程中的主要脂毒性分子，SQLE是其生物合成的限速酶，能通過與碳酸酐酶III（CA3）結(jié)合驅(qū)動脂肪生成，增加肝細胞中膽固醇和膽固醇酯的積累，在MASH及相關(guān)的肝癌（MAFLD-HCC）的發(fā)展中發(fā)揮作用。LIU等［27］在一項針SQLE在MASH中功能作用、分子機制和臨床影響的研究發(fā)現(xiàn)，SQLE及CA3在脂肪變性及MASH中都出現(xiàn)過度表達，與單獨測定血清SQLE（AUROC 0.816；95%CI，0.758～0.873）及CA3（AUROC 0.899，0852～0.946）相比，兩者相結(jié)合用于診斷MAFLD和MASH的AUROC更高，為0.927（95%CI，0.890～0.964）。SQLE可通過與CA3的相互作用引發(fā)自發(fā)性脂肪生成，激活炎癥信號，導(dǎo)致MASH。在小鼠模型中，SQLE抑制劑（如特比萘芬）及CA抑制劑（如乙酰唑胺）聯(lián)合靶向治療可以逆轉(zhuǎn)肝損傷和氧化應(yīng)激過程。因此，SQLE通過誘導(dǎo)膽固醇生物合成和SQLE/CA3 軸介導(dǎo)的脂肪生成來驅(qū)動MASH的發(fā)生和進展。血清SQLE和CA3是MASH患者無創(chuàng)診斷的新型生物標志物。針對SQLE和CA3的聯(lián)合靶向治療對MASH有益。

近年來，研究發(fā)現(xiàn)多種血清生物標志物用于MAFLD的診斷和病情評估，具有無創(chuàng)、操作簡易、重復(fù)性高、可量化等優(yōu)點，且在MAFLD的隨訪中具有較大的發(fā)展前景。眾多學(xué)者認為，在檢測血清生物標志物的基礎(chǔ)上，將多種臨床指標結(jié)合用于評估MAFLD疾病進程逐漸成為一種行之有效且準確率高的方法，能夠在臨床應(yīng)用中提高診斷MAFLD的準確率，做到早期診斷，早期治療，減少不良預(yù)后的發(fā)生。