抑制Polo樣蛋白激酶1聯(lián)合細胞因子誘導的殺傷細胞對三陰性乳腺癌殺傷效應的機制初探

勵 超 錢 飚 魯洪豐 李旭軍

中國科學院大學寧波華美醫(yī)院乳腺外科，浙江寧波 315000

三陰性乳腺癌（triple–negative breast cancer，TNBC）是女性最常見的惡性腫瘤之一，作為復雜的疾病類型，其表現(xiàn)出明顯的腫瘤間和腫瘤內(nèi)異質(zhì)性[1,2]。研究表明，晚期乳腺癌通常可轉移到骨、肝、肺和腦等遠處器官[3]，優(yōu)化當前乳腺癌的臨床治療方法以尋找新型診療方案仍是目前的研究熱點。Polo樣蛋白激酶1（Polo–like kinase1，PLK1）是PLK 家族成員之一，是一類廣泛存在于真核細胞中的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。現(xiàn)已知PLK1 在大多數(shù)腫瘤中高度表達，如骨肉瘤、非小細胞肺癌和乳腺癌等，并與患者的腫瘤細胞增殖和預后密切相關[4-6]。此外，通過抑制PLK1 免受蛋白酶體降解能夠促進乳腺癌細胞增殖，提示PLK1 可能是治療乳腺癌的潛在靶點[7]。目前，隨著對腫瘤發(fā)生發(fā)展機制和現(xiàn)代生物技術的深入探索，自體免疫細胞療法對腫瘤治療發(fā)揮重要作用，其中，細胞因子誘導的殺傷細胞（cytokine–induced killer cell，CIK 細胞）是用于免疫治療的常見免疫效應細胞，可介導腫瘤細胞凋亡或導致細胞死亡，并分泌相關細胞因子以促進抗腫瘤作用，具有殺瘤活性高和識別能力強等優(yōu)點[8]。鑒于此，本研究旨在探究抑制PLK1 表達聯(lián)合CIK 細胞作用下對乳腺癌細胞的影響，以期為該疾病的治療提供新選擇。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF 級BALB/c 裸鼠40 只，雌性，4～6 周齡，體質(zhì)量18～20g，飼養(yǎng)室溫度22～24℃、相對濕度（50±5）%且每日光照/黑暗交替12h，飼養(yǎng)環(huán)境經(jīng)嚴格滅菌處理，期間自由飲水與攝食，適應性飼喂1 周后開始實驗。本研究獲得醫(yī)院動物倫理委員會審批通過（批件號：SL–NBEY–KY–2022–045–03）。

1.1.2 細胞 TNBC細胞株MDA–MB–231購于美國典型培養(yǎng)物保藏中心。

1.1.3 主要試劑 PLK1 抑制劑BI–2536 購于美國Selleck 公司，γ 干擾素（interferon–γ，IFN–γ）購于美國PeproTech 公司，白細胞介素–2（interleukin 2，IL–2）購于北京四環(huán)生物制藥有限公司，CD3McAb購于美國Corning 公司，MTT 試劑盒和蘇木精–伊紅染色（hematoxylin and eosin staining，HE 染色）試劑盒購于北京索萊寶生物科技有限公司，Annexin V–FITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒購于南京諾唯贊生物科技股份有限公司，PVDF 膜購于美國Millipore公司，蛋白裂解液、BCA 蛋白檢測試劑盒及ECL 增強化學發(fā)光液購于上海碧云天生物研究所，免疫組織化學染色（DAB 顯色）試劑盒購于北京百奧萊博科技有限公司，PerCP–CD3、FITC–CD4、APC–CD8、FITC–CD56 抗體及兔抗人Ki–67 多克隆、兔抗人胱天蛋白酶（caspase）–3、兔抗人caspase–9、兔抗人GAPDH 多克隆抗體購于英國Abcam 公司。

1.2 方法

1.2.1 CIK 細胞的培養(yǎng)、擴增及鑒定 收集健康志愿者（倫理號：SX–NBEY–TY–2022–122–12）外周靜脈血30ml 置于肝素抗凝管，F(xiàn)icoll 密度梯度離心法分離外周血單個核細胞，置于37℃、5% CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)，收集細胞，加入含1000U/ml INF–γ 與20%人血清白蛋白的無血清培養(yǎng)基，在孵箱內(nèi)培養(yǎng)。24h后加入400U/ml IL–2 和50 ng/ml CD3McAb 繼續(xù)培養(yǎng)，每隔2d 換液1 次，同時補足1000 U/ml IL–2。分別取分離的外周血單個核細胞和誘導培養(yǎng)第12 天的CIK 細胞，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）洗滌，以1000 轉/min 離心5min，調(diào)整細胞濃度為5×106個/ml，取100μl 細胞懸液置于干凈離心管，分別加入PerCP 熒光標記的CD3、FITC熒光標記的CD4、APC 熒光標記的CD8、FITC 熒光標記的CD56 抗體，充分混勻后，4℃避光靜置30min，PBS 洗滌2 遍，加入4%多聚甲醛固定液重懸沉淀，應用流式細胞儀檢測分析。

1.2.2 MTT法 將MDA–MB–231細胞添加至含10%胎牛血清和1%青–鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)貼壁后，常規(guī)傳代培養(yǎng)。通過BI–2536、CIK 細胞及BI–2536 聯(lián)合CIK 細胞處理MDA–MB–231 細胞后，檢測各處理組細胞存活率。①BI–2536 對MDA–MB–231 細胞存活率的影響：將對數(shù)生長期的MDA–MB–231 細胞用0.25%胰酶消化，制備成單細胞懸液，以1×103個/孔的密度植入96 孔培養(yǎng)板，在孵箱培養(yǎng)24h 后，分別換用含1、2.5、5、10、20μmol/L BI–2536 的培養(yǎng)基培養(yǎng)48h 后，每孔加入20μl MTT（5mg/ml）繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄原液，加入150μl DMSO 至細胞孔，充分振蕩，待孔內(nèi)藍紫色結晶全部溶解后，采用酶標儀檢測各細胞孔A490值，計算各組細胞存活率。②CIK 細胞對MDA–MB–231細胞存活率的影響：將消化后的MDA–MB–231 細胞調(diào)整密度至1×104個/ml 作為靶細胞，將CIK 細胞調(diào)整細胞密度至5×105個/ml 作為效應細胞；依次按照5∶1、10∶1、20∶1、40∶1 的效靶比例將CIK 細胞與MDA–MB–231 細胞共植入96 孔培養(yǎng)板，將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)48h 后，根據(jù)MTT 法檢測各細胞孔A490值，計算各組細胞存活率。③BI–2536 聯(lián)合CIK 細胞對MDA–MB–231 細胞存活率的影響：將消化后的MDA–MB–231 細胞以1×103個/孔的密度植入96 孔培養(yǎng)板，設置對照組、BI–2536 組（5μmol/L BI–2536 處理MDA–MB–231 細胞48h）、CIK組（效靶比為10∶1的CIK細胞處理MDA–MB–231細胞48h）、BI–2536+CIK 組（5μmol/L BI–2536 與效靶比為10∶1的CIK細胞共同處理MDA–MB–231細胞48h），處理完成后，根據(jù)MTT 法檢測各細胞孔A490值，計算各組細胞存活率。

1.2.3 流式細胞術 取1.2.2 ③處理后的各組MDA–MB–231 細胞，PBS 洗滌，0.25%胰酶消化，PBS 再洗滌后，使用染料結合緩沖液重懸制備成單細胞懸液，調(diào)整細胞密度為2×105個/ml，取100μl 細胞懸液移入干凈離心管，依次加入5μl Annexin V–FITC 和5μl PI，渦旋混勻，室溫避光孵育10min 后，通過流式細胞儀上機檢測各組細胞凋亡水平。

1.2.4 蛋白質(zhì)印跡法 通過蛋白裂解液提取各組MDA–MB–231 細胞的總蛋白，BCA 法蛋白定量后，加入SDS 上樣緩沖液，沸水浴處理5min，制備12% SDS–PAGE 凝膠，將蛋白樣品加入凝膠孔內(nèi)，電泳分離蛋白，以220mA、120min 轉膜條件電轉印至PVDF 膜，并置于5%脫脂奶粉中室溫封閉1h。分別加入稀釋的一抗caspase–3（1∶1000）和caspase–9（1∶1000），4℃孵育過夜；次日，TBST 室溫洗膜，再加入稀釋的對應二抗（1∶5000），室溫孵育1h，TBST 洗膜，將膜采用ECL 增強化學發(fā)光顯影，暗室曝光，以GAPDH 作為內(nèi)參，利用ImageJ 1.8.0 軟件計算各蛋白相對表達水平。

1.2.5 裸鼠移植瘤模型的建立與分組處理 將正常培養(yǎng)的MDA–MB–231 細胞密度調(diào)整為1×108個/ml，將BALB/c 裸鼠右下腹部消毒，通過微量注射器取200μl 細胞懸液推注于裸鼠右側腋窩處，夾緊針孔以防滲漏。接種后，每日觀察裸鼠生長狀態(tài)與腫瘤長出情況。待瘤體生長達到約100mm3時，選擇32 只瘤體大小與形態(tài)較為一致的裸鼠，按數(shù)字表法隨機分成4組，每組8 只。①對照組：與給藥組等容積的生理鹽水灌胃，尾靜脈注射200μl 生理鹽水；②BI–2536 組：以10mg/kg BI–2536（溶于含30%PEG–400、0.5%Tween–80和5%丙烯的生理鹽水）灌胃，每2d 一次；③CIK 組：取200μl CIK 細胞（1×106個/ml）進行尾靜脈注射，一周2 次；④BI–2536+CIK 組：以10mg/kg BI–2536灌胃，每2d 一次，并取200μl CIK 細胞（1×106個/ml）進行尾靜脈注射，一周2 次。持續(xù)觀察各組裸鼠腫瘤生長，用游標卡尺測量瘤體，每隔2d 測量一次；21d后處死所有裸鼠，無菌環(huán)境下解剖取出瘤體，清洗干凈后電子天平稱重，將一部分組織固定在10%福爾馬林中，一部分置于液氮迅速冷凍后保存于-80℃冰箱。

1.2.6 HE染色 取10%福爾馬林中固定好的裸鼠移植瘤組織，常規(guī)脫水透明，制備成石蠟塊，在切片機上連續(xù)切成4μm 的組織切片，將其以二甲苯脫蠟與梯度酒精脫水處理后，置于Harris 蘇木精中染色5min，流水沖洗干凈，在切片上滴入1%鹽酸/乙醇分化數(shù)秒，沖洗干凈后，加入伊紅染色3min，再經(jīng)過脫水、透明處理，中性樹膠封固，在光學顯微鏡下觀察各腫瘤組織內(nèi)腫瘤細胞生長狀況，并攝取圖像。

1.2.7 免疫組織化學染色 將制備的腫瘤組織切片在烤箱高溫處理1h，常規(guī)脫蠟水化，滴加檸檬酸鈉加熱修復抗原，0.3%過氧化氫液室溫孵育10min，PBS 沖洗浸泡，組化筆畫圈標記，10%山羊血清室溫封閉，分別滴加稀釋后的兔抗人Ki–67 多克隆抗體（1∶100）、兔抗人caspase–3 多克隆抗體（1∶200）和兔抗人caspase–9 多克隆抗體（1∶200），4℃冰箱內(nèi)孵育過夜；次日，棄原液，PBS 沖洗后，圈內(nèi)滴加稀釋后的對應二抗（1∶5000），室溫繼續(xù)孵育1h。再次洗滌切片后，利用DAB 進行顯色，流水沖洗，蘇木精復染，常規(guī)脫水透明，中性樹膠封固，通過光學顯微鏡觀察組織內(nèi)細胞著色情況并拍攝圖像，胞質(zhì)、胞核染為棕色至棕褐色為陽性，隨機選擇5 個視野，通過ImageJ 1.8.0 軟件分析蛋白陽性染色面積，以陽性染色面積與總面積之比表示各蛋白的陽性表達率。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 23.0 軟件分析處理實驗數(shù)據(jù)，GraphPad Prism 8.30 繪制統(tǒng)計圖。計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，所有實驗至少進行3 次。采用單因素方差分析進行多組重復測量數(shù)據(jù)比較，LSD–t檢驗進行組內(nèi)兩兩數(shù)據(jù)比較。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 CIK 細胞鑒定

與誘導前比較，CIK 細胞經(jīng)過14d 體外誘導擴增后，CIK 細胞亞群中CD3+CD8+和CD3+CD56+細胞比例均顯著增加（P<0.05），而CD3+CD4+細胞比例顯著減少（P<0.05），見圖1。

圖1 流式細胞術檢測CD3+CD8+、CD3+CD56+ 及CD3+CD4+細胞比例

2.2 抑制PLK1 及CIK 細胞對TNBC 細胞的增殖抑制

與對照組比較，隨著藥物濃度的增加，細胞存活率明顯下降，呈劑量依賴性，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見圖2A。不同效靶比的CIK 細胞作用于MDA–MB–231 細胞后，細胞存活率隨著效靶比的增加而降低，呈效靶比依賴性，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見圖2B。

圖2 MTT 法檢測各組MDA–MB–231 細胞存活率

2.3 抑制PLK1 聯(lián)合CIK 細胞對TNBC 細胞的增殖抑制作用

與對照組比較，BI–2536 組和CIK 組的MDA–MB–231 細胞存活率均顯著下降（P<0.05）；而與BI–2536 組和CIK 組比較，BI–2536+CIK 組的細胞存活率進一步顯著下降（P<0.05），見圖3。

圖3 MTT 法檢測各組的MDA–MB–231 細胞存活率

2.4 抑制PLK1 聯(lián)合CIK 細胞對TNBC 細胞凋亡的影響

BI–2536 組和CIK 組的MDA–MB–231 細胞凋亡率均顯著高于對照組（P<0.05）；BI–2536+CIK 組的細胞凋亡率顯著高于BI–2536 組和CIK 組（P<0.05），見圖4。

圖4 流式細胞術檢測各組的MDA–MB–231 細胞凋亡率

2.5 抑制PLK1 聯(lián)合CIK 細胞對TNBC 細胞中caspase–3 與caspase–9 蛋白表達的影響

與對照組比較，BI–2536 組和CIK 組的MDA–MB–231 細胞中caspase–3、caspase–9 蛋白活性均顯著增加（P<0.05）；與BI–2536 組和CIK 組比較，BI–2536+CIK 組細胞中caspase–3、caspase–9 蛋白活性均進一步顯著增加（P<0.05），見圖5。

圖5 蛋白質(zhì)印跡法檢測各組中的MDA–MB–231 細胞中的caspase–3 與caspase–9 蛋白水平

2.6 抑制PLK1 聯(lián)合CIK 細胞對TNBC 裸鼠移植瘤生長的影響

在第6、9、12、15、18、21 天時，BI–2536 組和 CIK 組裸鼠腫瘤組織體積顯著小于對照組（P<0.05），而相較于 BI–2536 組和 CIK 組，BI–2536+CIK 組裸鼠腫瘤組織體積進一步顯著縮小（P<0.05），見圖6A。與對照組比較，BI–2536 組和 CIK 組裸鼠腫瘤質(zhì)量顯著減少（P<0.05），BI–2536+CIK 組的腫瘤組織質(zhì)量顯著小于BI–2536組和CIK 組（P<0.05），見圖6B、圖6C。

圖6 各組裸鼠腫瘤組織體積與質(zhì)量測定

2.7 抑制PLK1 聯(lián)合CIK 細胞對TNBC 裸鼠腫瘤組織內(nèi)細胞生長的影響

通過HE 染色觀察到對照組裸鼠腫瘤組織內(nèi)染色均勻，細胞排列密集，生長狀態(tài)良好；相較于對照組，BI–2536 組和CIK 組裸鼠腫瘤組織內(nèi)細胞排列較為稀疏，數(shù)目明顯減少；而與BI–2536 組和CIK組比較，BI–2536+CIK 組裸鼠腫瘤組織內(nèi)細胞進一步減少，且形態(tài)不規(guī)則，見圖7。

圖7 各組大鼠腫瘤組織內(nèi)細胞生長（HE 染色，×100）

Ki–67 蛋白陽性表達主要位于細胞核，caspase–3和caspase–9 蛋白陽性表達主要位于細胞質(zhì)，部分定位于細胞核，呈彌漫分布。與對照組比較，BI–2536組和CIK 組裸鼠腫瘤組織內(nèi)Ki–67 陽性率顯著減少（P<0.05），caspase–3 陽性率和caspase–9 陽性率均顯著增加（P<0.05）；而與BI–2536 組和CIK 組比較，BI–2536+CIK 組裸鼠腫瘤組織內(nèi)Ki–67 陽性率顯著減少（P<0.05），caspase–3 陽性率和caspase–9陽性率則均顯著增加（P<0.05），見圖8。

圖8 各組腫瘤組織內(nèi)Ki–67、caspase–3 及caspase–9 表達

3 討論

乳腺癌作為一種高度異質(zhì)性的疾病，不同患者的臨床治療和預后差異較大。基于基因活性檢測已確定10 余個不同的疾病亞型，TNBC 是一種特定的乳腺癌亞型，不表達雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）和人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor 2，HER2），臨床特征表現(xiàn)為侵襲性強、轉移潛能高、易復發(fā)和預后差[9]。由于TNBC 缺乏ER、PR 和HER2表達，對內(nèi)分泌治療不敏感且缺乏有效的治療靶點，目前尚無標準化的TNBC 治療方案。因此，開發(fā)新型TNBC 治療策略迫在眉睫。

PLK1包含保守的N末端激酶催化域和Polo–box結構域，參與磷酸化的激活與亞細胞定位調(diào)節(jié)。PLK1幾乎調(diào)節(jié)細胞分裂的各個階段，此外，其還在調(diào)節(jié)微管動力學、染色體動力學、p53 活性、DNA 復制和損傷修復等方面發(fā)揮重要作用。目前，已揭示PLK1 在多種腫瘤中存在過表達現(xiàn)象，其表達水平與細胞增殖、轉移和不良預后有關[4-6,10]。Maire 等[11]研究發(fā)現(xiàn)TNBC 中PLK1 的表達水平高于乳腺癌A型、B 型和HER2 過表達型，提示PLK1 是TNBC的潛在治療靶點；Ren 等[12]研究表明PLK1 能促進TNBC 腫瘤細胞的增殖、侵襲、遷移和克隆形成，是TNBC 發(fā)生過程中的關鍵Hub 基因，推動乳腺癌惡性進展。鑒于此，研究者認為以PLK1 作為治療靶點開發(fā)藥物對個體化 TNBC 治療具有很大前景。BI–2536 是PLK1 的ATP 結合域抑制劑，可在低納摩爾濃度下與PLK1 的激酶域結合并抑制其活性，使腫瘤細胞有絲分裂和周期進程異常，進而抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展[13]。本研究結果顯示，經(jīng)過不同劑量BI–2536 處理MDA–MB–231 細胞后，隨著藥物濃度的增加，細胞存活率明顯下降；此外，BI–2536作用于移植瘤裸鼠后其腫瘤體積和質(zhì)量均減小，腫瘤組織內(nèi)細胞生長與增殖均受抑制，由此說明BI–2536 對體內(nèi)外乳腺癌腫瘤細胞生長均表現(xiàn)出抑制作用。

CIK 細胞是從人外周血單核細胞中收獲的異質(zhì)免疫效應細胞，經(jīng)幾種細胞因子誘導而來，對腫瘤細胞顯示出廣泛的主要組織相容性復合體非限制性殺瘤活性，能夠通過釋放穿孔素、顆粒酶B、細胞溶解素等殺傷腫瘤細胞[8]。與其他免疫細胞相比，CIK細胞具有增殖能力強、抗腫瘤譜廣及抗腫瘤活性強等特點。然而，CIK 在治療TNBC 中仍面臨諸多問題，由于TNBC 惡性程度高且轉移快速，部分患者在確診時已處于晚期，此時患者的免疫功能較低，激活抗腫瘤免疫反應的能力差，且由于腫瘤組織已建立免疫抑制環(huán)境，使得CIK 細胞難以發(fā)揮作用[14]。近年來，一些基礎研究和臨床研究都強調(diào)CIK 細胞與其他化療藥物、靶向藥物或免疫療法相結合，能夠獲得有效而持久的抗腫瘤效果。Chen 等[15]研究表明，卡培他濱節(jié)拍化療聯(lián)合自體CIK 細胞免疫療法對治療復發(fā)轉移性TNBC 有效，可提高患者的免疫功能和生活質(zhì)量，并延長無進展生存期；Li 等[16]研究揭示CIK 細胞免疫治療與TNBC 預后之間的關系，表明CIK 細胞免疫治療可提高TNBC 患者常規(guī)化療的效果，且不良反應較少；孔娟等[17]研究說明CIK細胞聯(lián)合腫瘤靶向藥物西妥昔單抗對表皮生長因子受體陽性的野生型結直腸癌細胞與突變型結直腸癌細胞均顯示出較強的殺傷效應。本研究中，通過將CIK 細胞與PLK1 抑制劑BI–2536 聯(lián)合作用于體外MDA–MB–231 細胞后發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合作用下的腫瘤細胞活性更低，細胞凋亡率更高，體內(nèi)乳腺癌裸鼠移植瘤實驗結果也顯示出CIK 細胞聯(lián)合BI–2536 作用下的瘤體生長進一步減緩，抑瘤作用更強。由此推測，CIK 細胞聯(lián)合PLK1 抑制劑BI–2536 可增強對腫瘤細胞的殺傷作用。

Caspase 是一個進化保守的半胱氨酸蛋白酶家族，主要參與細胞死亡和炎性反應，是由大小不一的氨基末端結構域和約20kDa、10kDa 的大、小催化亞基所組成的蛋白酶結構域，共包含15 個家族成員，其中caspase–3 是一種典型的凋亡執(zhí)行者，在被啟動子caspase–9 激活后裂解細胞內(nèi)多個具有關鍵功能的蛋白質(zhì)，從而導致細胞凋亡。目前，許多抗癌療法，包括細胞毒性藥物、放射療法或免疫療法，都能夠通過激活caspase–3 來誘導腫瘤細胞凋亡或死亡[18,19]。本研究結果顯示，經(jīng)CIK 細胞聯(lián)合BI–2536 處理的MDA–MB–231 細胞中caspase–3、caspase–9 蛋白活性均增加，同時，乳腺癌移植瘤裸鼠腫瘤組織內(nèi)也表現(xiàn)出caspase–3、caspase–9 蛋白表達增加的現(xiàn)象，提示CIK 細胞聯(lián)合BI–2536 可通過進一步誘導caspase 依賴性途徑促進腫瘤細胞凋亡，進而發(fā)揮抑制腫瘤發(fā)展的作用。

綜上，使用PLK1 抑制劑BI–2536 聯(lián)合CIK 細胞能夠在體內(nèi)和體外增強對TNBC 腫瘤細胞的殺傷作用，該作用機制可能與進一步激活caspase 依賴性途徑相關。靶向抑制PLK1 與CIK 細胞的聯(lián)合應用有可能成為一種新型有效的抗腫瘤治療方案用于TNBC 的臨床應用中。