紫杉醇脂質體對肺動脈高壓大鼠肺血管重構的干預作用

陳 明 張 苗 王思凝 施 淼 許先榮

1.浙江省立同德醫院呼吸與危重癥醫學科，浙江杭州 310012；2.浙江省立同德醫院綜合內科，浙江杭州 310012；3.浙江省立同德醫院婦科，浙江杭州 310012

肺動脈高壓是一組由不同病因及發病機制導致的以肺血管結構或功能改變、肺動脈阻力增加，表現為肺動脈壓力升高并呈進行性發展，最終導致右心室功能障礙、衰竭的疾病[1]。其發病機制復雜，是多種因素共同作用的結果，其中肺血管的收縮、重構是導致肺動脈高壓的重要環節[2]。紫杉醇制劑目前除廣泛應用于腫瘤的治療外，其在改善血管重構、抑制新生血管生成、延緩血管再狹窄等方面有獨特優勢，已被用于防治心血管疾病，如冠狀動脈術后再狹窄及藥物涂層支架等[3]，但目前對肺血管增殖性疾病領域的研究相對較少，本研究擬通過一次性腹腔注射野百合堿（monocrotaline，MCT）建立大鼠肺動脈高壓模型，觀察紫杉醇脂質體對大鼠肺血管重構的影響，以期為肺動脈高壓治療提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

健康清潔級雄性Sprague–Dawley 大鼠30 只，平均體質量（200±20）g，由浙江省中醫藥研究院實驗動物中心提供[許可證號：SYXK（浙）2019–0010]。野百合堿（貨號：C101555，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；紫杉醇脂質體（批準文號：國藥準字H20030357，生產單位：南京綠葉制藥有限公司，規格：30mg）；生物信號采集處理系統（MedLab–U/ 4C501H，南京美易科技有限公司）；數字切片掃描儀（NanoZoomer S360）、光學顯微鏡（Leica DMLB，德國Leica 公司）。

1.2 肺動脈高壓模型的建立與分組

將30 只大鼠適應性喂養1 周后，按隨機數字表法將其分為正常對照組（正常組）、野百合堿模型組（MCT 組）和紫杉醇脂質體組（治療組），每組各10 只；除正常組外，其余兩組大鼠予配置好的1% MCT 溶液按照60mg/kg 腹腔注射1 次，制作肺動脈高壓模型，正常組大鼠予一次性腹腔注射等量的生理鹽水。

1.3 藥物干預

治療組：造模第21 天起予紫杉醇脂質體7.24mg/kg尾靜脈注射，每3d 注射一次，至35d 測壓、取標本處死。正常組與MCT 組：造模第21 天起尾靜脈注射與治療組等量生理鹽水，每3d 注射一次，至35d測壓、取標本處死。上述三組大鼠注射劑量以5d 為1 個周期隨體質量變化而作出調整，干預時間35d。

1.4 右心室收縮壓測定及標本采集

于MCT 注射第35 天，參考相關文獻及前期實驗的基礎上測量大鼠的右心室收縮壓（right ventricular systolic pressure，RVSP）。大鼠以10%水合氯醛按350mg/kg 腹腔注射麻醉，固定于固定器上。在大鼠頸部偏右側做一切口，暴露并游離右頸外靜脈和右頸總靜脈，以眼科剪斜行剪開頸總靜脈血管直徑的1/3，將導管在此切口處插入血管，并向心臟方向緩慢遞送導管，根據生理信號采集處理系統軟件界面所顯示的壓力波形曲線、壓力值和導管進入的長度來判斷導管口所處的位置[4]。為提高操作可行性和穩定性，右心導管僅進入右心室，測定RVSP，并以此代表肺動脈壓力[5]。

開胸取出心臟，冰鹽水沖洗，沿房室溝剪去左、右心房及大血管根部，沿室間隔剪下右心室，用濾紙吸去水分，用電子天平分別稱量右心室（right ventri cular，RV）、左心室＋室間隔（left vent ricular ＋septum，LV＋S）的重量，最后計算右心室肥厚指數（right ventricular hypertrophy index，RVHI）。RVHI＝RV/（LV＋S）×100%，以此作為評價右心室肥厚的指標。

1.5 肺血管組織病理測定

1.5.1 病理組織取材 取各組大鼠左下肺組織，浸泡于10%福爾馬林溶液中固定48h，脫水、透明、石蠟包埋，依次經蘇木精–伊紅染色（hematoxylin and eosin staining，HE 染色）和免疫組織化學染色，隨后制作數字切片，通過NDP.view 軟件查看、導出待分析的病理切片。

1.5.2 肺動脈中膜厚度百分比及血管壁面積指數測定 采用肺動脈中膜厚度百分比及血管壁面積指數對肺動脈重構進行評估。每組大鼠選取3 張肺組織HE 染色切片，隨機選取6 條血管（50～150μm），采用ImageJ 軟件測量血管內徑、血管外徑、血管腔內面積和血管總面積。肺動脈中膜厚度百分比=（血管外徑-血管內徑）/血管外徑×100%，反映肺動脈管壁的增殖程度；血管壁面積指數=（血管總面積-血管腔內面積）/血管總面積×100%，反映肺動脈管腔的狹窄程度[6]。

1.5.3 肺組織免疫組織化學測定 用免疫組織化學染色的方法檢測肺組織中增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）、α–平滑肌肌動蛋白（α–smooth muscle actin，α–SMA）表達量。PCNA增殖度計算：石蠟切塊免疫組織化學染色后，每組大鼠選取3 張肺組織切片，選取6 條血管（50～150μm），計數血管壁及周圍所有細胞數及PCNA染色陽性（棕色）細胞數。PCNA 增殖度=PCNA 染色陽性細胞數/總細胞數×l00%[7]。α–SMA 的表達量計算：分別測量血管總面積及血管壁平滑肌染成棕色部分的陽性面積。以陽性面積/血管總面積反映表達量程度。

1.6 統計學方法

使用SPSS 26.0 統計軟件對數據進行分析。計量資料以均數±標準差（x s± ）表示，多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD–t法。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組大鼠的一般情況比較

正常組大鼠實驗期間精神狀態、進食和飲水情況正常，皮毛光澤發亮，行為活躍，反應靈敏，大小便正常；MCT 組大鼠實驗前期精神狀態、進食和飲水情況正常，第3 周開始，精神較差，進食較前減少，飲水尚可，反應尚靈敏，皮毛光澤但抓取時易脫落；治療組大鼠實驗期間精神狀態、飲水情況正常，皮毛光澤但抓取時易脫落，行為較活躍，反應靈敏，大小便正常。

2.2 三組大鼠的RVSP 及RVHI 比較

第35 天，MCT 組大鼠的RVSP 顯著高于正常組（P<0.01），提示病理模型復制成功；治療組大鼠的RVSP 顯著低于MCT 組（P<0.05）。第35 天，MCT組和治療組大鼠的RVHI 顯著高于正常組（P<0.01）；治療組大鼠的RVHI 顯著低于MCT 組（P<0.01），見表1。

表1 三組大鼠的RVSP 及RVHI 比較（）

表1 三組大鼠的RVSP 及RVHI 比較（）

注：與正常組比較，*P<0.05；與MCT 組比較，#P<0.05；1mmHg=0.133kPa

2.3 三組大鼠的肺組織病理改變

正常組大鼠肺組織肺動脈管壁結構清楚，厚度正常，中膜平滑肌細胞未見明顯增殖，外膜未見血管外基質沉積。MCT 組大鼠肺組織肺動脈管壁明顯增厚，平滑肌細胞增殖、肥大，導致管腔狹窄，外膜可見血管外基質沉積；治療組大鼠肺動脈管壁增厚較MCT 組明顯降低，肺動脈外膜周圍可見少量血管外基質沉積，見圖1。

圖1 三組大鼠肺動脈組織形態學改變（HE 染色×200）

2.4 三組大鼠的肺動脈形態計量學指標比較

MCT 組大鼠的肺動脈中膜厚度百分比及血管壁面積指數顯著高于正常組（P<0.01）。治療組大鼠的肺動脈中膜厚度百分比及血管壁面積指數顯著低于MCT 組（P<0.05），見表2。

表2 三組大鼠的肺動脈形態計量學指標比較（）

表2 三組大鼠的肺動脈形態計量學指標比較（）

注：與正常組比較，*P<0.01；與MCT 組比較，#P<0.05

2.5 三組大鼠的肺動脈PCNA 及α–SMA 表達量比較

正常組大鼠的肺動脈管壁及血管壁周圍僅有少量PCNA 表達。MCT 組大鼠的PCNA 及α–SMA 表達均顯著高于正常組（P<0.01）；治療組大鼠的PCNA及α–SMA 表達均顯著低于MCT 組（P<0.01），見表3、圖2。

圖2 三組大鼠的免疫組織化學檢測PCNA 及α–SMA 表達（×200）

表3 三組大鼠的肺動脈PCNA 及α–SMA 表達量比較（）

表3 三組大鼠的肺動脈PCNA 及α–SMA 表達量比較（）

注：與正常組比較，*P<0.01；與MCT 組比較，#P<0.01

3 討論

隨著近年來對肺動脈高壓研究的深入，臨床上可用的治療藥物較前有所增加，特異性針對前列環素、內皮素和一氧化氮通路的靶向藥物可明顯改善患者的活動能力和預后[8]，但仍不能完全阻止病程進展，且部分藥物存在價格昂貴、無法普及等情況[9]。

肺血管重構是促進肺動脈高壓發生發展的關鍵因素，是一個持續發展的病理過程[10]。肺血管重構涉及血管內皮損傷、血管中膜增厚、周圍血管的肌纖維化和細胞外基質增多等[11]。其中肺動脈平滑肌細胞（pulmonary arterial smooth muscle cell，PASMC）增殖和肥大引起的肺血管重構是導致肺動脈高壓的關鍵因素[12]。在肺血管重構過程中PASMC 不僅是肺血管收縮的效應細胞，同時也是導致血管平滑肌遷移、肥大增殖的細胞基礎。因此，如能減緩PASMC的增殖和肥大，對改善肺血管重構具有重要意義。

近年來發現，紫杉醇不僅能用于腫瘤的治療，在抗血管重構方面也有獨特的優勢，既往研究發現它在抑制細胞快速增殖的同時，還可下調腫瘤壞死因子–α 等，促進細胞凋亡，對PASMC 的增殖、遷移有較好的抑制作用[13,14]。研究表明，低濃度紫杉醇可對轉化生長因子–β 促進PASMC 外膠原合成具有顯著的抑制作用，該作用可能是通過調控Smad3 蛋白的磷酸化實現[15]。

但傳統的紫杉醇制劑由于自身及溶劑的特點，可引起嚴重過敏反應、骨髓抑制、消化系統反應、神經毒性及毛囊炎、靜脈炎等不良反應，且不良反應隨劑量增加而加重，限制了其臨床應用的安全性和有效性[16]。脂質體是將親水性或親脂性藥物封包在脂質雙分子層所制成的超微制劑[17]。由于紫杉醇脂質體結構類似生物膜，可使紫杉醇攜帶各種親水的、疏水的或兩親的物質，有減少藥物劑量、降低毒性、減輕變態反應和免疫反應的效果，同時又不降低紫杉醇的治療效果[18]。

本研究表明紫杉醇脂質體對MCT誘導建立的大鼠肺動脈高壓模型進行干預，可明顯降低肺動脈高壓大鼠的RVSP 和RVHI，病理也證實經紫杉醇脂質體干預后，肺動脈管壁厚度及管腔狹窄程度有較大改善。說明對肺動脈高壓有一定的緩解作用。

PCNA 是反映細胞增殖的良好指標，存在于細胞核內，是啟動DNA 復制的必要條件[19]。因此，PCNA 陽性細胞數量的增多也提示細胞增殖異常活躍。α–SMA對定位平滑肌細胞具有較高特異性，對了解PASMC增殖意義較大[20]。本實驗中，MCT 組大鼠肺動脈及血管周圍的PCNA 陽性細胞表達增加，α–SMA 表達也顯著升高，提示肺動脈平滑肌細胞增殖明顯，而經過紫杉醇脂質體干預后肺動脈及血管周圍的PCNA及α–SMA 表達均降低，提示紫杉醇脂質體通過抑制肺血管中的平滑肌細胞增殖而緩解肺血管重構。

綜上，紫杉醇脂質體可降低MCT 誘導肺動脈高壓大鼠的肺動脈壓力，其可通過抑制肺動脈平滑肌細胞增殖而緩解肺血管重構，但仍需進一步研究探討其抑制肺動脈平滑肌細胞增殖的機制。