壯藥白花九里明提取物綠原酸含量測(cè)定及對(duì)早孕子宮出血模型大鼠心肌細(xì)胞的影響

朱智德，楊 宏，蔣志雄，那襲雪，韓 璐，寧小清

壯藥白花九里明為菊科艾納香屬植物東風(fēng)草的干燥地上部分。白花九里明味微苦、性微溫，主治流行性感冒、產(chǎn)后失血過多、月經(jīng)不調(diào)等癥[1]。廣泛分布于我國(guó)廣西、廣東、云南、貴州、四川、湖南南部、江西南部、福建以及臺(tái)灣等地區(qū)[2]。現(xiàn)代研究對(duì)白花九里明的研究除婦科止血外，在心血管方面也有研究，王杉等[3]用白花九里明提取液對(duì)蟾蜍離體灌流蛙心，結(jié)果表明白花九里明不影響心率，低濃度的白花九里明對(duì)心肌收縮影響不明顯；中濃度、高濃度的白花九里明能降低心肌收縮力，且隨藥物濃度增大，降低心肌收縮力的效應(yīng)越明顯。鐘興隆等[4]研究表明，白花九里明提取液具有減慢小鼠心率、降低P波和QRS波振幅的作用；王彩冰等[5-6]觀察白花九里明提取液對(duì)小鼠不同時(shí)間段血壓和心率影響，結(jié)果顯示，白花九里明具有降低血壓的作用，對(duì)心率沒有明顯影響，其降壓作用可能通過減少心搏量和降低外周阻力來(lái)實(shí)現(xiàn)。熊繼宗等[7]的實(shí)驗(yàn)研究也表明，白花九里明當(dāng)用量達(dá)到一定濃度時(shí)對(duì)大鼠有降壓作用，而不影響大鼠的心率。陳天等[8]研究表明，白花九里明有改善心肌細(xì)胞缺血缺氧、干預(yù)氧自由基對(duì)心肌細(xì)胞損傷、促進(jìn)心肌細(xì)胞修復(fù)作用；白花九里明含有對(duì)心臟具有保護(hù)作用的綠原酸，目前尚未見白花九里明提取物對(duì)早孕子宮出血大鼠模型的心肌是否有影響的報(bào)道。故本研究擬通過測(cè)定提取物中綠原酸含量及觀察其對(duì)早孕子宮出血大鼠心肌細(xì)胞的影響，為白花九里明的進(jìn)一步研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥材和試劑 白花九里明提取物：白花九里明藥材購(gòu)自廣西北流市，提取物采用水提醇沉方法獲得。甲醇：分析純購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20180605；色譜純購(gòu)自賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司，批號(hào)：LOT164787。乙腈色譜純購(gòu)自賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司，批號(hào)：LOT161387；磷酸色譜純購(gòu)自天津市科密歐化學(xué)試 劑有限公司，批號(hào)：20160007；綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110753-201817；米索前列醇片購(gòu)自湖北葛店人福藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號(hào)H20073696；米非司酮片購(gòu)自湖北葛店人福藥業(yè)有限公司，批號(hào)H20033551；水合氯醛購(gòu)自天津市大茂化學(xué)試劑廠，批號(hào)302-17-0；羥乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)購(gòu)自Ruibio，批號(hào)7365-45-9；對(duì)硝基苯磷酸二鈉(PNPP)購(gòu)自Ruibio，批號(hào)XP7171；磷酸緩沖鹽溶液(PBS)購(gòu)自Solarbio，批號(hào)：P1022；無(wú)水乙醇購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：10009218；二甲苯購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：10023418；碳酸鋰購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20022818；冰醋酸購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：10009218；蘇木素購(gòu)自bioswamp，批號(hào)：G1140；伊紅購(gòu)自bioswamp，批號(hào)：E8090；中性樹脂購(gòu)自bioswamp，批號(hào)：G8590。

1.2 儀器和設(shè)備 超純水機(jī)(Q-Gard A2 Mingche，批號(hào)：F7CA94750)；優(yōu)普超純水機(jī)(四川優(yōu)普超純科技有限公司，型號(hào)：UPK-II-60L)；循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司，型號(hào)：SHB-B95)；中型超聲清洗器(德國(guó)埃爾瑪公司)；Waters Alliance e2695高效液相色譜儀(Waters corporation)；色譜柱(InertSustain?C18 250 nm×4.6 nm，5 μm，購(gòu)自GL Sciences Inc)；臺(tái)式多功能冷凍離心機(jī)(Centrifuge5430R，Eppendorf)；電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司，型號(hào)：SQP、METTLER TOLEDO，型號(hào)：XS105DU]；光吸收微孔板檢測(cè)(Tecan Austria GmbH，型號(hào)：Infinite M200 PRO)；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海鴻都電子科技有限公司，型號(hào)：DHG-9140A)；移液槍[大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器(北京)有限公司]；微孔濾膜(天津津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，規(guī)格：0.45 μm)；色譜進(jìn)樣瓶(上海安譜科學(xué)儀器有限公司，規(guī)格：2 mL)；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 (上海鴻都電子科技有限公司，批號(hào)DHG-914OA)；恒溫箱 (上海鴻都電子科技有限公司，批號(hào)DHG-914OA)；高速冷凍離心機(jī) (上海安亭科學(xué)儀器廠制造，批號(hào)TG16-WS)；電子分析天平(賽多利斯德國(guó)，批號(hào)JA1003B)；正置顯微鏡(徠卡顯微系統(tǒng)有限公司，MD1000)；移液器(吉爾森P型移液器公司)； 恒溫烘箱 (上海恒一科學(xué)儀器有限公司，DHG-9023A)；組織脫水機(jī)(湖北康強(qiáng)醫(yī)療器械有限公司，TKD-TSB)；石蠟包埋機(jī)(湖北泰維科技實(shí)業(yè)有限公司，TB-718D)；石蠟切片機(jī) (徠卡顯微系統(tǒng)有限公司，RM2235)；攤片烤片機(jī)(湖北康強(qiáng)醫(yī)療器械有限公司，TKD)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 Wistar大鼠120只，體質(zhì)量(280±20)g，無(wú)特定病原體(SPF)級(jí)，雌雄各半，購(gòu)于長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(湘)2016-0011。實(shí)驗(yàn)前，動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。實(shí)驗(yàn)大鼠雌雄分籠飼養(yǎng)，每籠5只，自由飲水，室溫20～25 ℃，相對(duì)濕度45%～65%。

1.4 壯藥白花九里明提取物中綠原酸含量測(cè)定

1.4.1 色譜條件

1.4.1.1 流動(dòng)相觀察 分別以乙腈-水(10∶90)、乙腈-0.1%磷酸(10∶90)、甲醇-0.1%磷酸(32∶68)、甲醇-水(32∶68)作為考察的流動(dòng)相，對(duì)白花九里明一種提取物進(jìn)行流動(dòng)相的研究。結(jié)果顯示，白花九里明一種提取物的峰型在流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸(10∶90)的條件下較好，且沒有出現(xiàn)倒峰、拖尾的現(xiàn)象。故選用乙腈-0.1%磷酸作為白花九里明一種提取物含量測(cè)定的流動(dòng)相。詳見圖1～圖4。

圖1 乙腈-0.1%磷酸(10∶90)

圖2 乙腈-水(10∶90)

圖3 甲醇-0.1%磷酸(32∶68)

圖4 甲醇-水(32∶68)

1.4.1.2 流動(dòng)相比例選擇 分析圖5和圖6可知，在流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸(10∶90)的條件下，綠原酸對(duì)照品色譜圖與白花九里明提取物色譜圖比對(duì)，提取物中綠原酸的峰未達(dá)到分離要求(R>1.5)，所以繼續(xù)調(diào)整比例，至分離度達(dá)到要求。分析圖7～圖10可知，在流動(dòng)相乙腈-0.1%磷酸(8∶92)的條件下，提取物中綠原酸峰型對(duì)稱性好，無(wú)倒峰、拖尾現(xiàn)象，分離度R>1.5。故選用乙腈-0.1%磷酸(8∶92)作為白花九里明一種提取物中綠原酸含量測(cè)定的流動(dòng)相，綠原酸對(duì)照品色譜圖見圖11，提取物色譜圖見圖12。

圖5 白花九里明提取物色譜圖[流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸(10∶90)]

圖6 綠原酸對(duì)照品色譜圖[流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸(10∶90)]

圖7 白花九里明提取物色譜圖[流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸(15∶85)]

圖8 白花九里明提取物色譜圖[流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸(12∶88)]

圖9 白花九里明提取物色譜圖[流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸(7∶93)]

圖10 白花九里明提取物色譜圖[流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸(8∶92)]

圖11 綠原酸對(duì)照品色譜圖[乙腈-0.1%磷酸(8∶92)]

圖12 白花九里明提取物色譜圖[乙腈-0.1%磷酸(8∶92)]

1.4.2 綠原酸波長(zhǎng)測(cè)定的選擇 運(yùn)用酶標(biāo)儀對(duì)綠原酸進(jìn)行波長(zhǎng)掃描，掃描的波長(zhǎng)在230～400 nm，結(jié)果其吸光度值在波長(zhǎng)330 nm處最大，所以，選用330 nm作為白花九里明一種提取物中綠原酸含量測(cè)定的檢測(cè)波長(zhǎng)。

1.4.3 提取物中綠原酸含量測(cè)定的色譜及檢測(cè)條件的確定 色譜柱：C18柱(InertSustain?C18 250 nm×4.6 nm，5 μm)，檢測(cè)波長(zhǎng)330 nm。流動(dòng)相：采用乙腈-0.1%磷酸，流動(dòng)相比為8∶92，流速1.0 mL/min，柱溫25.0 ℃，進(jìn)樣體積10 μL，理論塔板數(shù)按綠原酸峰計(jì)算不應(yīng)少于3 000。

1.4.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 取綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品1.2 mg置于10 mL的容量瓶中，加水定容至刻度，充分搖勻。即得濃度為0.12 mg/mL的綠原酸對(duì)照品溶液。0.45 μm微孔濾膜過濾，分別進(jìn)樣2 μL、4 μL、6 μL、8 μL、10 μL，綠原酸對(duì)照品的進(jìn)樣質(zhì)量(μg)作為橫坐標(biāo)(x)，峰面積作為縱坐標(biāo)(y)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖13)。并計(jì)算出回歸方程，y=2 000 000x+6 159.6，R2=0.999 3。綠原酸在0.24～1.20 μg質(zhì)量范圍內(nèi)與其對(duì)應(yīng)的峰面積呈良好的線性關(guān)系(見表1)。

圖13 綠原酸對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)曲線

表1 綠原酸進(jìn)樣質(zhì)量與其相對(duì)應(yīng)的峰面積

1.4.3.2 精密度觀察 取濃度為0.12 mg/mL的綠原酸對(duì)照品溶液，0.45 μm微孔濾膜過濾，按照上述確定的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，且每次的進(jìn)樣體積均為10 μL。分別測(cè)定其峰面積并計(jì)算出精密度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。經(jīng)計(jì)算綠原酸峰面積的RSD值為0.72%，表明實(shí)驗(yàn)所用的該儀器精密度良好。詳見表2。

表2 精密度的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1.4.3.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密稱取白花九里明一種提取物0.1 g，置于10 mL的容量瓶中，加水定容至刻度，搖勻。0.45 μm微孔濾膜過濾，分別在0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h進(jìn)樣測(cè)定其綠原酸的峰面積，進(jìn)樣體積均為10 μL，并計(jì)算峰面積的RSD值。計(jì)算出其RSD=1.28%，表明樣品溶液穩(wěn)定性良好。詳見表3。

表3 白花九里明提取物中綠原酸的穩(wěn)定性

1.4.3.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密稱取白花九里明一種提取物0.1 g，共稱6份，分別置于10 mL的容量瓶中，加水定容至刻度，搖勻，作供試品溶液。0.45 μm微孔濾膜過濾，按照上述的色譜條件，測(cè)定其綠原酸的峰面積。經(jīng)計(jì)算白花九里明一種提取物中綠原酸的平均含量為4.281 7 mg/g，其RSD=1.80%，表明實(shí)驗(yàn)所用的方法具有良好的重復(fù)性。詳見表4。

表4 重復(fù)性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1.4.3.5 加樣回收實(shí)驗(yàn) 精密稱取同一白花九里明提取物0.1 g(已知含量為4.281 7 mg/g)，共稱6份。分別置于10 mL的容量瓶中，加少量水溶解混勻，每份分別精密加入綠原酸對(duì)照品溶液(0.12 mg/mL)3.62 mL，再加水至刻度，充分搖勻，制得樣品溶液。0.45 μm微孔濾膜過濾，測(cè)定樣品溶液中的綠原酸含量，計(jì)算加樣回收率。經(jīng)過計(jì)算得出平均回收率為97.89%，RSD=1.36%，表明該方法具有良好的回收率。詳見表5。

表5 加樣回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1.4.3.6 白花九里明提取物中綠原酸含量測(cè)定 精密稱取白花九里明一種提取物3份，每份0.1 g，置于10 mL容量瓶中，加水定容至刻度，搖勻，得供試品溶液。0.45 μm微孔濾膜過濾，按色譜條件測(cè)定，每份樣品進(jìn)樣量為10 μL，測(cè)定其峰面積并計(jì)算出樣品中的綠原酸含量。

1.4.4 大鼠模型心肌組織切片

1.4.4.1 建立產(chǎn)后子宮出血大鼠模型 參考文獻(xiàn)[9]的方法按雌性與雄性1∶1比例合籠，次日晨進(jìn)行陰道涂片實(shí)驗(yàn)，在顯微鏡下觀察有精子或陰道栓即為妊娠第1天，選取10只未懷孕大鼠，作為空白對(duì)照組，選取懷孕成功大鼠50只，隨機(jī)分5組，每組10只。即模型組、陽(yáng)性組、白花九里明高劑量組(9.4 g/kg)、白花九里明中劑量組(4.7 g/kg)、白花九里明低劑量組(2.4 g/kg)。各組分別于妊娠第7天08：00灌胃給藥米非司酮溶液(12 mg/kg)和18：00灌胃米索前列醇溶液(120 μg/kg)，造成早孕大鼠的不完全流產(chǎn)子宮出血模型。連續(xù)給藥至第14天，每日置于大鼠陰道內(nèi)1個(gè)棉球，次日分別在08：00和18：00將棉球取出，密封冷藏保存?zhèn)溆茫瑫r(shí)更換新棉球。

1.4.4.2 給藥方法 未孕10只為空白組(灌胃生理鹽水)，取妊娠大鼠50只，隨機(jī)分為5組：模型組、陽(yáng)性對(duì)照組(按照人與實(shí)驗(yàn)Wistar大鼠劑量換算的咖啡酸片組10 mg/kg)、白花九里明高劑量組(9.4 g/kg)、白花九里明中劑量組(4.7 g/kg)、白花九里明低劑量組(2.4 g/kg)，每組10只。受孕8 d，各組于造模后第8天開始灌胃，每日1次，連續(xù)給藥7 d。

1.4.4.3 麻醉取血取心臟、切片、圖像采集 給藥第7天后30 min，用10%水合氯醛以0.3 mL/100 g腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈取3管血，分別于5 mL普通采血管、2 mL EDTA采血管、2 mL 3.2%枸櫞酸鈉采血管，備用。手術(shù)取心臟，取其一部分心臟組織用 10%甲醛固定，進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋切片，蘇木精-伊紅(HE)染色；光鏡下觀察。通過顯微鏡拍照，Lecia Applaction Stiue圖像系統(tǒng)采集。

2 結(jié) 果

2.1 白花九里明提取物中綠原酸含量 實(shí)驗(yàn)測(cè)定提取物3份的峰面積并計(jì)算出樣品中的綠原酸含量分別為4.5233mg/g、4.4224mg/g、4.5092mg/g，平均(4.4850±0.062 5)mg/g。詳見表6。

表6 白花九里明提取物綠原酸含量測(cè)定結(jié)果

2.2 白花九里明提取物對(duì)心肌細(xì)胞的影響 空白組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組、白花九里明高劑量組、白花九里明中劑量組、白花九里明低劑量組心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，無(wú)變性壞死；毛細(xì)血管無(wú)明顯擴(kuò)張現(xiàn)象。說明提取物對(duì)心肌細(xì)胞無(wú)影響。詳見圖14。

圖14 各組大鼠心肌細(xì)胞HE染色圖(×100)

3 討 論

綠原酸是由咖啡酸的羧基和奎尼酸的羥基縮合而成的縮酚酸，是植物細(xì)胞通過莽草酸途徑合成的一種苯丙素類物質(zhì)，其分子結(jié)構(gòu)中有酯鍵、不飽和雙鍵、多亓酚和鄰二酚羥基[10-11]。

本實(shí)驗(yàn)參考了《中國(guó)藥典》(2015版)對(duì)蒲公英中綠原酸含量測(cè)定的條件及方法[12]，通過對(duì)綠原酸流動(dòng)相的優(yōu)化調(diào)整及波觀察，最終在檢測(cè)波長(zhǎng)為330 nm、流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸(8∶92)，在此條件下，綠原酸在0.24～1.20 μg質(zhì)量范圍內(nèi)與其對(duì)應(yīng)的峰面積呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為y=2 000000x+6 159.6，R2=0.999 3，平均回收率為97.89%，RSD=1.36%，白花九里明提取物中綠原酸含量為(4.485 0±0.062 5)mg/g。

綠原酸食入后可經(jīng)小腸分泌物作用，變?yōu)闊o(wú)致敏性物質(zhì)，有止血、增高白細(xì)胞及抗病毒作用，具有縮短血凝及出血時(shí)間的作用[13]。大部分綠原酸在腸黏膜酯酶作用下被水解為咖啡酸和奎寧酸，隨后進(jìn)入結(jié)腸，在腸道菌群的作用下代謝為間香豆素、苯丙酸、苯甲酸和馬尿酸，馬尿酸主要來(lái)源于部分奎寧酸的轉(zhuǎn)化，其他代謝產(chǎn)物主要來(lái)源于部分咖啡酸轉(zhuǎn)化，這些微生物源代謝產(chǎn)物占綠原酸攝入量的57.4%，然后在還原酶作用下轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的二氫阿魏酸進(jìn)入循環(huán)[14]。

綠原酸作為一種自由基清除劑和抗氧化劑，可以保護(hù)心血管系統(tǒng)。有研究顯示，綠原酸能對(duì)人的內(nèi)皮細(xì)胞損傷起保護(hù)作用，綠原酸可以通過消除抗脂質(zhì)過氧化和自由基來(lái)保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞，從而預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化和高血壓等[15]。本研究觀察白花九里明對(duì)早孕子宮出血大鼠模型心肌細(xì)胞的影響，結(jié)果顯示心肌細(xì)胞無(wú)明顯變化，這是否提示白花九里明提取液中的綠原酸對(duì)心臟有一定保護(hù)的作用，其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

白花九里明藥材含綠原酸、咖啡酸等止血物質(zhì)，具止血作用[16-17]，白花九里明提取物對(duì)子宮平滑肌具有明顯的收縮作用[18]，同時(shí)對(duì)早孕大鼠模型心肌細(xì)胞無(wú)影響，提示該提取物臨床用藥對(duì)心臟的安全性。