基于網絡藥理學探討加味導赤散治療心脾積熱證復發性口腔潰瘍的活性成分及作用機制

張 鴿，胡 月，王倩倩，李艷青，郭洪波

復發性口腔潰瘍(recurrent oral ulcer，ROU)又名復發性阿弗他潰瘍(recurrent aphthous ulcer，RAU)，是一種好發于唇、舌、頰和軟腭等部位的孤立的、圓形或橢圓形潰瘍，常伴有自發性疼痛，易反復發作，病程有自限性，是口腔黏膜病中最常見的潰瘍類疾病，患病率高，居口腔黏膜病之首位。發病機制可能與機體的免疫功能紊亂、口腔菌群失調、微量元素缺失、微循環障礙等有關，病因尚不十分明確[1]。復發性口腔潰瘍包括起始、初級損傷反應、擴展損傷反應、潰瘍形成和修復5個階段，炎癥反應貫穿整個過程。現代醫學主要采用化學藥物治療，常用的藥物有維生素類、免疫調節類以及局部使用消炎類、激素類、止痛類藥物[2]，尚缺乏有效的根治方法。根據癥狀表現，中醫將復發性口腔潰瘍歸屬于口糜、口瘡范圍[3]，病因病機多為心火亢盛，火熱郁熾血脈，局部血敗肉腐，則為癰腫瘡瘍。郭洪波教授治療復發性口腔潰瘍心脾積熱證時以加味導赤散，多年臨證“驗之事不忒”。導赤散出自宋代錢乙的《小兒藥證直訣》，由生地黃、木通、甘草、淡竹葉組成，主治心胸煩熱，口渴面赤，意欲飲冷，口舌生瘡；或心熱移于小腸、小便赤澀刺痛、舌紅、脈數等心經火熱證。用通草易關木通，再加生石膏而成，延續了導赤散利水而不傷陰，滋陰而不戀邪，既清熱又養陰之藥性，又增加了其清熱瀉火之力和斂瘡之功。本方藥僅5味，配伍嚴謹，在復發性口腔潰瘍發病過程中給予了綜合、針對性的治療，與辛寒之石膏同用，使心脾熱邪得寒而止。本研究將中醫學、現代醫學及生物信息學巧妙結合，旨在基于“心主血脈”“心部于表”及微循環障礙理論分析復發性口腔潰瘍的病因病機。在此理論指導下，選用加味導赤散治療本病，并從現代藥理及分子生物學等角度探討其作用機制，使用分子對接驗證生地黃在改善微循環方面發揮的作用。

1 資料與方法

1.1 加味導赤散化學成分的篩選 借助中藥系統藥理學技術平臺(TCMSP)[4]收集加味導赤散中甘草、通草的化學成分，對化合物進行篩選[5]，以口服利用度(oral bio availability，OB)≥30%、類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18為篩選條件，在BATMAN-TCM(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)[6]數據庫收集淡竹葉、生地黃的化學成分，并以Score cutoff>20、P<0.05為篩選條件，文獻檢索石膏的化學成分，獲得5種中藥的化學成分。

1.2 加味導赤散活性成分及潛在靶點預測 通過TCMSP、BATMAN-TCM數據庫及文獻檢索，獲取加味導赤散(石膏、淡竹葉、通草、生地黃、炙甘草)活性成分的作用靶點，并使用UniProt數據庫[7]對靶點名稱進行轉換和矯正。

1.3 復發性口腔潰瘍疾病靶點預測 以“recurrent oral ulcer”為關鍵詞，在GeneCards數據庫進行檢索，獲取全部的復發性口腔潰瘍疾病靶點。

1.4 加味導赤散治療復發性口腔潰瘍的靶點預測 使用Venny在線作圖工具(維尼2.1.0)將加味導赤散靶點與復發性口腔潰瘍作用靶點取交集得到加味導赤散治療復發性口腔潰瘍靶點。

1.5 構建中藥-成分-靶點網絡及拓撲屬性分析 利用獲取的交集靶點制作Network以及Type文件，并將準備好的文件導入Cytoscape 3.8.2軟件制作中藥-成分-靶點網絡圖，并利用工具分析網絡屬性，導出屬性文件，進行拓撲屬性分析，通過藥物與化合物及化合物與靶點連接情況，篩選出加味導赤散治療靶點作用于復發性口腔潰瘍的關鍵化合物和靶點，同時結合現有報道文獻進行分析。

1.6 構建蛋白相互作用(PPI)網絡及拓撲屬性分析 將獲取的加味導赤散治療復發性口腔潰瘍的靶點上傳至STRING數據庫(https://string-db.org/)[8]，物種選擇為“Homo sapiens(智人)”，并設置條件“minimum required interaction score=0.4”和“hided is connected nodes in the network”，隨后導入輸出文件，利用Cytoscape 3.8.2軟件制作PPI網絡圖并進行拓撲網絡分析，同時構建藥物-化合物-靶點網絡，并利用Network Analyzer進行拓撲分析。

1.7 基因本體(GO)富集與京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路分析 采用DAVID6.8數據庫(https://david.ncifcrf.gov/)[9]對加味導赤散治療靶點進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，隨后導出富集分析結果文件，利用R語言進行作圖實現結果可視化。

1.8 分子對接 通過PubChem數據庫[10]收集生地黃活性成分3D結構，篩選生地黃作用的基因靶點中與微循環相關靶點：內皮素-1(EDN1)、纖溶酶原激活劑(PLAT)、纖溶酶原(PLG)、整合素β-2(ITGB2)、蛋白激酶C-δ型(PRKCD)，并從PDB數據庫[11]篩選其最佳蛋白的晶體結構(有配體、結構相對完整)分別為：與EDN1復合的人內皮素受體B型(5GLH)、雙苯甲脒人雙鏈組織型纖溶酶原活化劑復合物的催化結構域(1A5H)、重組纖溶酶原KRingle 1的結構和纖維蛋白結合位點(1PKR)、整合素β2亞基的PHE2和PHE3片段結構(2P28)、磷酸酪氨酸結合結構域(1YRK)。利用AutoDock Tolls 1.5.6軟件進行分子對接，結合能(predicted binding affinity)越小則表明蛋白與配體對接活性越好，利用Pymol 2.3.0分別對結合能最低的對接模式進行可視化處理。

2 結 果

2.1 加味導赤散中活性成分及靶點的篩選 在TCMSP數據庫中搜索加味導赤散各單味藥，基于ADME參數OB≥30%、DL≥0.18的條件初步篩選出91個活性成分，其中甘草88個，通草3個，重復成分1個，在BATMAN-TCM(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)數據庫檢索淡竹葉和生地黃，最終得到8個有效成分，其中淡竹葉4個，生地黃4個。文獻檢索得到石膏化學成分1個，綜合兩個數據庫及文獻檢索，共得到加味導赤散活性成分99個。最后用UniProt數據庫將TCMSP數據庫中得到的靶點名轉換為Gene symbol，得到5味藥物的靶點，去除重復值后，得到426個藥物靶點，包括甘草225個，地黃216個，石膏0個，淡竹葉7個，通草3個，其中25個重復靶點。

2.2 復發性口腔潰瘍疾病靶點的獲取 在GeneCards數據庫中以“recurrent oral ulcer”為關鍵詞，檢索疾病靶點，并3次計算Relevance score值的中位數，選擇大于中位數的疾病靶點，最終得到479個疾病靶點。

2.3 加味導赤散治療復發性口腔潰瘍的靶點預測 將藥物靶點和疾病靶點列表分別放入維尼2.1.0得到疾病與藥物的交集靶點，共93個交集。詳見圖1。

圖1 疾病與藥物的交集靶點Venn圖

2.4 中藥-成分-靶點網絡構建及分析結果 通過Cytoscape 3.8.2來構建加味導赤散治療復發性口腔潰瘍的藥物-成分-靶點網絡圖(見圖 2)。圖中菱形代表共同靶點，圓形代表藥物及其有效活性成分，顏色越深，圖形越大，代表度值(degree)越大，連線越粗，連接越緊密。結果顯示，藥物-化合物-靶點網絡總共186個節點、791條邊，包括90個化合物節點，93個靶點節點，其中3個單味藥節點，依照交集結果，各單味藥度值從大到小排名為甘草(84)、淡竹葉(3)、生地黃(3)、通草(0)、石膏(0)。排名前5位的化合物為槲皮素(quercetin)、山奈酚(kaempferol)、甘草查爾酮A(licochalcone a)、柚皮苷(naringenin)、異鼠李素(isorhamnetin)。詳見表 1。網絡圖中度值排名前10位的靶點為前列素內環氧化物合成酶2(PTGS2)、雌激素受體(ESR1)、雄激素受體(AR)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARG)、誘導型一氧化氮合酶(NOS2)、細胞周期蛋白A2(CCNA2)、凝血因子X(F10)、前列素內環氧化物合成酶2(PTGS1)、二肽基肽酶-4(DPP4)、血管內皮細胞生長因子受體2(KDR)。預測這些關鍵化合物和靶點在加味導赤散對復發性口腔潰瘍的治療調控網絡中起著至關重要的作用。

圖2 中藥-成分-靶點網絡圖

表1 加味導赤散中主要有效化合物基本信息

2.5 PPI網絡構建及關鍵靶點篩選 將加味導赤散的治療靶點基因導入STRING數據庫數據庫，設置篩選條件為智人，設置條件“minimum required interaction score=0.9”和“hided is connected nodes in the network”，保存得到的相應結果文件，得出88個基因靶點，PPI網絡如圖 3所示，顏色越深，圖形越大，degree值越高，篩選排名前10位的靶點分別為信號傳導及轉錄激活因子3(STAT3)、腫瘤壞死因子(TNF)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1(AKT1)、白細胞介素6(IL6)、細胞腫瘤抗原p53(TP53)、血管內皮生長因子-α(VEGFA)、 轉錄因子p65(RELA)、絲裂原激活蛋白激酶(MAPK)1、表皮生長因子受體(EGFR)、胰島素(INS)，提示這些靶點在加味導赤散治療復發性口腔潰瘍中可能具有重要作用。

圖3 PPI網絡圖

2.6 GO富集分析結果 利用DAVID6.8進行GO分析，導出結果文件，并用R語言將結果可視化。結果得到GO生物學過程(biological process，BP)600個條目，前10個為生物學過程中RNA聚合酶Ⅱ的轉錄正調控、炎癥反應、信號轉導、對缺氧的反應、免疫反應、對藥物的反應、積極調控細胞增殖、對脂多糖的反應、凋亡過程的負調控、轉錄的正調控，DNA模板。GO細胞組分(cellular component，CC)50個條目，前10個分別為細胞外空間、細胞質、質膜、細胞外區域、胞質溶膠、細胞外泌體、膜、線粒體、質膜的組成部分、細胞質的核周區域。GO分子功能(molecular function，MF)85個條目，前10個分別為蛋白質結合、相同的蛋白質結合、蛋白質均二聚活性、細胞因子活性、酶結合、血紅素結合、蛋白質異二聚活性、鋅離子結合、受體結合、轉錄因子結合。詳見圖 4～圖 6。

圖4 GO-BP富集分析結果

圖5 GO-CC富集分析結果

圖6 GO-MF富集分析結果

2.7 KEGG通路分析結果 KEGG通路富集分析發現93個共同靶點有92個(98.9%)被富集，共105個通路，前20條通路主要富集為：乙型肝炎、癌癥的途徑、膀胱癌、缺氧誘導因子1(HIF-1)、TNF信號通路、恰加斯病、胰腺癌、利什曼病、前列腺癌、蛋白聚糖在癌癥中、瘧疾、弓形體病、磷脂酰肌醇-3-羥激酶(PI3K)-蛋白激酶B(Akt)信號通路、肺結核、細胞凋亡、炎癥性腸病、小細胞肺癌、非酒精性脂肪肝、核轉錄因子-κB(NF-κB)信號通路、類風濕性關節炎。利用R語言作圖，詳見圖 7。

圖7 KEGG富集分析結果

2.8 分子對接結果 結合能較低的6對是PLAT與campesterol、PLG與Gamma-Aminobutyric Acid、EDN1與campesterol、PRKCD與campesterol、PLG與campesterol、ITGB2與campesterol；用Pymol 2.3.0軟件將分子對接可視化，最后兩組最低結合能狀態下無氫鍵形成。詳見表2、圖 8。

表2 生地黃有效成分-關鍵靶點分子對接結果

圖8 分子對接模式及結果

3 討 論

心主血脈，脈為血府，與心相連，在心氣充沛，血液充盈，脈道通利的情況，心氣才能推動血液暢行脈中，環周不休。心、血、脈三者的正常是保證血運暢通的條件。王麗丹等[12]經理論研究得出血與脈的生理和病理與心關系密切。徐吉利等[13]認為“心部于表”有兩方面涵義：其一，心氣的運動趨勢是向上向外，故主體表；其二表為“陽”意時，“心部于表”是指心的生理特性即心屬火、為陽中之陽臟。故而《外臺秘要》云：“口瘡者，心脾有熱，氣沖上焦，熏發口舌故作瘡也。”吳以嶺[14]認為，中醫“絡脈”在形態和功能上與現代醫學的微血管和微循環相似，絡病的病理變化涉及現代醫學中血液流變學改變、局部微循環障礙、血流力學改變及細胞因子調控異常等。在復發性口腔潰瘍發生發展過程中均不同程度上有血流動力學、血液流變學及微血管病變參與到微循環障礙的發生過程中，微循環障礙使局部組織細胞缺氧壞死，引起黏膜組織損傷，同時會使局部血管的通透性增加，導致免疫物質滲出而引起自身免疫反應。

從中藥-成分-靶點網絡圖中得出，治療復發性口腔潰瘍的有效成分為槲皮素、山奈酚、甘草查爾酮A、柚皮苷、異鼠李素。基礎實驗驗證，異鼠李素的消炎作用主要是抑制NF-κB途徑[15]。炎癥反應各個階段的許多分子受NF-κB調節，包括TNF-α、白細胞介素1β(IL-1β)、白細胞介素2(IL-2)、IL6、白細胞介素8(IL-8)、白細胞介素12(IL-12)、誘導型一氧化氮合酶2(iNOS)、環氧化物酶2(COX2)、趨化因子、黏附分子、菌落刺激因素以及其他因素。另外，從體外研究和體內動物模型獲得的結果表明，柚皮苷可以下調幾種炎癥性標志物的表達，如toll樣受體4(TLR4)、TNF-α、IL-1β、IL6、iNOS，通過減弱NF-κB通路和激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)來激活COX2，這與多種促炎信號通路的抑制作用有關[16]。山奈酚通過抑制蛋白激酶和轉錄因子對炎癥相關疾病(包括過敏、關節炎、糖尿病、心血管疾病、癌癥和神經系統退化)具有治療作用。山奈酚能夠通過下調活性氧(ROS)依賴的MAPK-NF-κB和凋亡信號通路來減輕氧化應激和炎癥反應[17]。槲皮素[18]可阻止巨噬細胞中細菌脂多糖引起的iNOS、IL-1β和TNF-α的分泌，RAW2647細胞中TNF-α的分泌，細胞因子刺激的血管細胞黏附分子1(VCAM-1)和細胞間黏附分子1(ICAM-1)的表達，以及人臍靜脈內皮細胞中的E-選擇。研究表明，甘草查爾酮A顯著上調小鼠巨噬細胞RAW 2647細胞中抗氧化酶血紅素氧合酶1(HO-1)和核因子紅系2相關因子2(Nrf2)[19]。這種上調與Nrf2核易位的誘導、Keap1蛋白表達的降低和抗氧化反應元件(ARE)啟動子活性的升高有關。由此可見，甘草的多種有效成分除消除炎癥反應之外，還可從多方面改善復發性口腔潰瘍病人的微循環障礙。且度值較高的靶點中凝血因子X(F10)、血管內皮細胞生長因子受體2(KDR)、誘導型一氧化氮合酶(NOS2)均為與微循環障礙相關的靶點，由此可知，加味導赤散治療復發性口腔潰瘍時對其血液、血管的病理狀況可起到改善作用。

從PPI網絡圖分析得出，PTGS2和 PTGS1是炎性疾病的重要靶點，當機體受脂多糖、真菌病原體和TNF-α、IL-1β等促炎癥因子刺激后，PTGS2和PTGS1的表達迅速增加，引起炎性反應，導致組織損傷。MAPK14參與機體的免疫調節與炎癥反應，可以調控 TNF-α、IL-1、IL-6等細胞因子的基因表達。DPP4是一種細胞表面糖蛋白，通過調節T細胞活化、細胞因子的水平、T細胞依賴性抗體的生成和B細胞免疫球蛋白參與介導機體免疫功能和疾病的發病機制，在巨噬細胞介導的炎癥、組織重塑和自身免疫性疾病中發揮重要作用。胰島素可以通過增加角質形成細胞、內皮細胞和成纖維細胞的再上皮化、血管生成和細胞外基質分泌的速率來促進愈合。可以歸因于胰島素作為一種生長因子在愈合事件中的合成代謝作用。胰島素作用于生長激素受體，增加人角質細胞的遷移、再上皮化以及膠原含量、肉芽組織和纖維母細胞局部胰島素樣生長因子的產生[20]。IL6是一種由巨噬細胞、T細胞、B細胞等多種細胞產生的淋巴因子，能使B細胞前體成為產生抗體的細胞；與集落刺激因子協同，能促進原始骨髓源細胞的生長和分化，增強自然殺傷細胞的裂解功能；能被TNF-α、IL-1等誘導且是急性期反應的主要細胞因子。

GO生物學過程中炎癥反應、信號轉導、對缺氧的反應、免疫反應、對藥物的反應、積極調控細胞增殖、對脂多糖的反應、凋亡過程的負調控等與加味導赤散治療復發性口腔潰瘍的機制密切相關，GO分子功能中血紅素結合這一功能或可改善復發性口腔潰瘍病人的微循環障礙。KEGG富集分析發現，與本研究密切相關的通路有HIF-1、TNF信號通路、PI3K-Akt信號通路、細胞凋亡、NF-κB信號通路等。何璐[21]經動物實驗發現，模型組γ干擾素(IFN-γ)和白細胞介素4(IL-4)水平都升高，加味導赤散高劑量組、中劑量組、低劑量組治療后血清IFN-γ和IL-4水平均降低，其中以高劑量組IFN-γ降低水平最為明顯。這一結果與GO富集分析研究高度吻合，由此可知，加味導赤散治療復發性口腔潰瘍或可通過改善細胞因子進一步影響微循環。

李玲[22]經臨床實驗發現復發性口腔潰瘍病人紅細胞聚集指數、全血切變率、全血低切相對指數、全血低切還原黏度較對照組呈上調表達，卡松黏度低于對照組，提示復發性口腔潰瘍的發生與血流變指標異常導致的微循環障礙有關，并且指出了微循環障礙的主要因素是血流變紅細胞聚集性的增加。現代藥理研究發現，地黃根莖主要含β-谷甾醇與甘露醇，及少量豆甾醇、微量的菜油甾醇(Campesterol)，還含地黃素、生物堿、脂肪酸、梓醇與維生素A類物質，地黃乙醇提取物對麻醉動物有降低血壓及促進血液凝固的作用[23]。從分子對接結果可知，菜油甾醇與這五種基因靶點結合均有最低結合能產生，且與PLAT的結合能最低，PLAT即纖溶酶原激活劑，通過水解纖溶酶原中的單個 Arg-Val鍵，將豐富但無活性的酶原纖溶酶原轉化為纖溶酶。通過控制纖溶酶介導的蛋白水解，在組織重塑和降解、細胞遷移和許多其他病理生理事件中發揮重要作用。通草具有通利血脈、清熱利尿的功效，現代基礎藥理研究利用二氯甲烷和甲醇對通草進行提取，結果表明，通草中80%的化合物和抗凝血酶Ⅲ類具有類似作用，從而表明通草具有預防血栓的作用[25]。

綜上所述，加味導赤散治療復發性口腔潰瘍是多種成分作用于多靶點、多通路，其中多個靶點及通路均涉及“絡病”的病理變化。本研究證實，生地黃、通草、甘草等的有效成分可明顯改善微循環障礙，這與微循環障礙多因素相互交錯重疊的機制相契合，也表明了“心主血脈”“心部于表”及“絡病學”理論指導臨床用藥之意義重大，值得進一步實驗驗證。