胃癌患者血清sB7-H3檢測(cè)的臨床意義

陳 忠，朱 燕，毛 飛

(1.合肥京東方醫(yī)院 檢驗(yàn)科，安徽 合肥230012；2.江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院 檢驗(yàn)科，江蘇 鎮(zhèn)江212002；3.江蘇大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江212013)

胃癌的診斷和治療策略的改進(jìn)可以提高胃癌的早期發(fā)現(xiàn)率，從而可以降低患者死亡率。然而，盡管新的抗腫瘤藥物能夠改善胃癌患者的預(yù)后，但總體生存率仍不理想[1]。因此，尋求新的腫瘤分子標(biāo)志物以提高對(duì)腫瘤早期發(fā)生進(jìn)展侵襲轉(zhuǎn)移的預(yù)測(cè)，具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。B7-H3(CD276)是B7/CD28家族重要的免疫檢查點(diǎn)成員。許多B7分子與CTLA4、PD-1等已知檢查點(diǎn)標(biāo)記相互作用，被認(rèn)為能共同刺激免疫應(yīng)答[2]。最近有研究發(fā)現(xiàn)它在抗原呈遞細(xì)胞上誘導(dǎo)抑制T細(xì)胞功能發(fā)揮重要作用，有助于腫瘤細(xì)胞的免疫逃避[3]。B7-H3在多種人類實(shí)體瘤中高表達(dá)，盡管它的受體還沒有被確定，但其影響腫瘤進(jìn)展已經(jīng)超出它的免疫調(diào)節(jié)作用。血清sB7-H3(soluble B7-H3)作為非侵入性檢測(cè)指標(biāo)用于肝癌、大腸癌及膽囊癌等疾病的檢測(cè)已有報(bào)道[4-6]。但檢測(cè)其在胃癌患者血清中含量與胃癌臨床病理特征相關(guān)性的研究罕見，本研究旨在探討檢測(cè)血清sB7-H4在胃癌診療中的臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源及臨床資料

隨機(jī)選取2020年7月-2021年6月在江蘇大學(xué)附屬人民醫(yī)院普通外科接受根治手術(shù)的60例胃癌患者的胃癌及癌旁組織(距腫瘤病灶外5 cm)樣本，術(shù)前有化放療史均已排除，采集上述胃癌組術(shù)前及40例慢性胃炎組的外周血3 ml，所有病例均經(jīng)病理確診，并收集30例健康志愿者的外周血3 ml做對(duì)照組。其中胃癌組：男(34例)，女(26例)，年齡35歲-82歲，中位年齡59歲。均預(yù)先告知所有患者及家屬并簽署知情同意書，本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 儀器與試劑

酶標(biāo)儀(瑞士 Tecan公司)、B7-H3檢測(cè)ELISA盒(上海凱博生物科技公司)、小鼠抗人B7-H3單克隆抗體(蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)生物技術(shù)研究所)、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠 IgG(北京中杉金橋技術(shù)有限公司)、IHC染色試劑盒(武漢博士德公司)。

1.3 方法

1.3.1ELISA 采集各受試者空腹外周靜脈血3 ml，以2 000 r/min 離心5 min，分離血清存于-80℃冰箱待檢。嚴(yán)格按試劑盒操作說明書要求用ELISA方法檢測(cè)血清sB7-H3水平，讀取酶標(biāo)儀450/540 nm處吸光度(A)值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品的濃度值(ng/ml)。

1.3.2免疫組織化學(xué) 對(duì)石蠟包埋的組織塊進(jìn)行3 μm組織切片，然后用二甲苯脫蠟和梯度酒精洗滌水化，在檸檬酸緩沖液中微波提取抗原。切片用無(wú)血清蛋白阻滯劑封閉10 min修復(fù)抗原，按IHC染色試劑盒說明書進(jìn)行操作，加入小鼠抗人B7-H3單克隆抗體(1/200稀釋)，一抗孵育后，3次PBS洗滌，用二抗辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(1/3000稀釋)孵育15 min，陰性對(duì)照組織切片不加一抗。免疫組化染色評(píng)分是按照Fromovitz方法判定[7]，按照切片中著色陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞所占百分比與著色強(qiáng)度的乘積進(jìn)行判定，腫瘤細(xì)胞著色陽(yáng)性比例：≤10% 1分；11%～50% 2分；51%～75% 3分；>75% 4分；另以著色強(qiáng)度分為：無(wú) 0分；淺黃色1分；棕黃色2分；棕褐色3分。最終染色評(píng)分為二者的乘積，評(píng)分≥3分為B7-H3蛋白陽(yáng)性表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組血清sB7-H3水平比較

胃癌組血清sB7-H3濃度為(25.5±11.4)ng/ml，顯著高于慢性胃炎組(9.1±7.8)ng/ml和健康志愿對(duì)照組(7.8±6.5)ng/ml，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.0001)，見圖1。

圖1 各組血清sB7-H3水平比較

2.2 胃癌及癌旁組織中B7-H3蛋白表達(dá)

IHC染色結(jié)果顯示，60例胃癌組織中，有46例B7-H3蛋白呈陽(yáng)性表達(dá)，其陽(yáng)性表達(dá)率為 76.7%(46/60)，而其對(duì)應(yīng)癌旁組織的陽(yáng)性表達(dá)率為8.3%(5/60)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，主要在細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中，見圖2。

注：A為胃癌旁組織細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)不表達(dá)B7-H3蛋白；B為胃癌組織細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)B7-H3蛋白陽(yáng)性表達(dá)

2.3 胃癌組血清sB7-H3水平在臨床病理因素及癌組織表達(dá)各組間的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

胃癌組血清sB7-H3水平在腫瘤分化程度、TNM分期、浸潤(rùn)深度、B7-H3蛋白表達(dá)及有無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而在胃癌患者各組間性別、年齡、腫瘤大小的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 胃癌組血清sB7-H3水平在臨床病理因素及癌組織表達(dá)情況各組間的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 討論

B7-H3是B7配體家族的一員，是一種在抗原提呈細(xì)胞上表達(dá)的外周膜蛋白，也是適應(yīng)性免疫反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)因子。是基于抗體腫瘤免疫治療中一個(gè)有吸引力的靶點(diǎn)，它在分化的惡性細(xì)胞和癌源性細(xì)胞上過表達(dá)，在多種實(shí)體瘤中表達(dá)陽(yáng)性。但在正常組織中有少量低水平表達(dá)。在非惡性組織中，B7-H3在適應(yīng)性免疫中具有主要的抑制作用，抑制T細(xì)胞的活化和增殖。在惡性組織中，B7-H3抑制腫瘤抗原特異性免疫反應(yīng)，導(dǎo)致原癌形成[8]。B7-H3在腫瘤/上皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞中表達(dá)，包括巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和骨髓來源的抑制細(xì)胞，B7-H3在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)水平高于非腫瘤組織細(xì)胞[9]。B7-H3除了具有免疫調(diào)節(jié)作用外，還具有內(nèi)在的促腫瘤活性，與促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、血管生成、轉(zhuǎn)移和抗癌耐藥有關(guān)，參與腫瘤免疫原性和癌癥進(jìn)展[10]。B7-H3可能作為循環(huán)可溶性亞型存在于血清和其他體液中，它在多種腫瘤中過表達(dá)，與腫瘤預(yù)后不良相關(guān)。B7-H3蛋白在非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)和前列腺癌等多種腫瘤組織中均有表達(dá)[9,11]，NSCLC中B7-H3過表達(dá)與腫瘤浸潤(rùn)性細(xì)胞毒淋巴細(xì)胞增多和預(yù)后不良相關(guān)。食管癌組織中B7-H3的高表達(dá)與腫瘤侵襲和生存時(shí)間顯著相關(guān)，B7-H3的高表達(dá)參與了食管癌進(jìn)展，可能參與了T細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤微環(huán)境抗腫瘤反應(yīng)的負(fù)調(diào)控以及食管癌細(xì)胞的增殖和遷移[12]。結(jié)直腸癌組織中B7-H3表達(dá)與巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)密度呈正相關(guān)，B7-H3表達(dá)及巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)密度與患者總體生存率呈負(fù)相關(guān)，B7-H3通過STAT3信號(hào)通路調(diào)控結(jié)直腸癌細(xì)胞中CDC25A的表達(dá)。此外，過表達(dá)B7-H3通過降低CDC25A依賴的G2/M期阻滯而增強(qiáng)了化療耐藥性。與正常鄰近組織相比，結(jié)直腸癌樣本中B7-H3和CDC25A均顯著上調(diào)，且水平與腫瘤分期相關(guān)，CDC25A與B7-H3表達(dá)呈正相關(guān)[13]。B7-H3的表達(dá)與許多臨床病理特征相關(guān)，包括腫瘤分期、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)受累度和生存率[14]。乳腺癌組織中B7-H3 mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著高于癌旁組織，B7-H3可能成為乳腺癌治療的新靶點(diǎn)[15]。腎癌中發(fā)現(xiàn)一組B7-H3表達(dá)的CAFs(Cancer-associated fibroblasts)，B7-H3可刺激CAFs分泌HGF和CXCL12，對(duì)CAFs有較強(qiáng)的抗凋亡作用，B7-H3+ CAFs可促進(jìn)腎癌的侵襲和轉(zhuǎn)移[16]。迄今國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)實(shí)體瘤組織中B7-H3表達(dá)的研究較多，而對(duì)外周血中B7-H3表達(dá)的研究甚少。宮頸癌患者血清中B7-H3水平明顯高于正常獻(xiàn)血者，高表達(dá)B7-H3可促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞增殖，增強(qiáng)了宮頸癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，B7-H3在宮頸癌組織中的表達(dá)明顯高于正常宮頸組織，B7-H3高表達(dá)與宮頸癌患者預(yù)后不良有關(guān)，它能促進(jìn)宮頸癌的增殖、侵襲和遷移，可能是治療宮頸癌的潛在靶點(diǎn)[17]。Lina等[18]研究結(jié)果表明慢性胃炎患者B7-H3表達(dá)增高與幽門螺旋桿菌相關(guān)慢性胃炎患者Th2細(xì)胞應(yīng)答增強(qiáng)有很強(qiáng)的相關(guān)性，幽門螺桿菌通過CagA和肽聚糖直接上調(diào)B7-H3表達(dá)，并通過操縱宿主T細(xì)胞反應(yīng)和誘導(dǎo)慢性炎癥間接上調(diào)B7-H3表達(dá)。本研究結(jié)果也顯示胃癌組血清B7-H3水平顯著高于慢性胃炎組及健康志愿組，慢性胃炎組高于健康志愿組，提示B7-H3可能參與胃癌發(fā)生及進(jìn)展。

B7-H3在胃腸道腫瘤中表達(dá)顯著，而在這些器官的正常健康組織中的表達(dá)被證明是缺失或很少的。該分子能通過各種免疫和非免疫分子機(jī)制影響胃腸道腫瘤的生物學(xué)行為，其中一些是B7-H3相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑誘導(dǎo)的結(jié)果，B7-H3在這些腫瘤的進(jìn)展、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用[19]。

本研究結(jié)果胃癌組織B7-H3蛋白陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于癌旁組織，表明了B7-H3與胃癌進(jìn)展及侵襲相關(guān)，與Li等[20]研究結(jié)果基本一致，B7-H3表達(dá)增加與胃癌浸潤(rùn)深度和CXCR4表達(dá)呈正相關(guān)，表明B7-H3能促進(jìn)胃癌細(xì)胞遷移和侵襲，B7-H3和CXCR4可能是胃癌治療的新靶點(diǎn)。可溶性B7-H3(sB7-H3)在多個(gè)腫瘤和腫瘤細(xì)胞系中的表達(dá)也出現(xiàn)升高，且其高表達(dá)與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移有顯著相關(guān)性。

綜上所述，檢測(cè)胃癌患者血清sB7-H3水平，可以輔助判斷胃癌進(jìn)展侵襲轉(zhuǎn)移情況，可作為胃癌診療潛在的分子標(biāo)志物。