血漿外泌體miR-21對胃癌細胞藥物敏感性的影響

杜 沛，李 婷，文 雯

(空軍軍醫大學第一附屬醫院 胃腸外科，陜西 西安771032)

奧沙利鉑是胃癌主要的化療藥物之一，通過干擾腫瘤細胞DNA復制從而誘導其凋亡，同時還能影響機體的免疫功能，而患者在化療過程中產生的耐藥性是治療失敗的主要原因。若能在化療前得知患者的耐藥情況，及早使用靶向藥物，對于控制患者病情和提高患者的生存期具有重要意義。外泌體是由細胞主動分泌的，由蛋白質、核酸、抗原、脂類和糖類等組成的納米級囊泡小體，可攜帶宿主細胞的miRNAs、蛋白、抗原等進入不同的受體細胞，發揮功能[1]。研究表明，外泌體包含很多與耐藥性相關的miRNAs，例如miR-21[2]，miR-206[3]，miR-27a[4]等，但外泌體來源的miRNA能夠在胃癌中傳遞耐藥性卻罕見報道。本研究通過研究外泌體來源的miR-21在胃癌細胞中傳遞耐藥性的功能，為胃癌患者化療前的藥效評價提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料人胃癌細胞SGC7901購于上海中科院細胞庫；RPMI-1640培養基、標準胎牛血清、雙抗(青霉素、鏈霉素)、胰蛋白酶、Cell Counting Kit-8(CCK8)細胞計數試劑盒均購于北京Solarbio科技有限公司；BCA蛋白定量試劑盒、ECL化學發光底物購于武漢艾迪康生物科技有限公司；CD9、TSG101、CD63一抗、羊抗鼠二抗、羊抗兔二抗均購于武漢愛博泰克生物科技有限公司；RNA提取試劑盒、miRNA逆轉錄試劑盒、熒光定量試劑盒購于日本Takara公司；雙熒光素報告酶試劑盒購于美國Promega公司。MK3型酶標儀、CO2細胞培養箱購于美國Thermo Forma公司，DYY-8C型電泳儀穩壓電源、SDS-PAGE蛋白電泳儀、轉膜儀購于北京六一儀器廠，Step one plus實時熒光定量PCR儀購于美國ABI公司，CKX41型倒置相差顯微鏡購自于日本Olympus公司，超凈工作臺購自于蘇凈集團安泰公司，5810R型冷凍離心機購于德國Eppendorf公司。

1.2 細胞培養以及耐藥細胞構建

為建立奧沙利鉑耐藥細胞系SGC7901/L-OHP，將SGC7901細胞采用逐步增加奧沙利鉑濃度梯度進行誘導。SGC7901和SGC7901/L-OHP細胞的培養于RPMI1640培養基，培養基中包含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素，5%的二氧化碳，培養箱的溫度為37℃。

1.3 細胞活力檢測

CCK8測定奧沙利鉑對敏感細胞SGC7901和耐藥細胞SGC7901/L-OHP生長活力的影響。加入RPMI1640完全培養基制備單細胞懸液，按照5×103細胞/mL接種到96孔板中，然后在培養箱中進行過夜孵育。隨后加入不同濃度的奧沙利鉑，孵育24 h。向每個96孔板加入10 μl新鮮制備的CCK-8溶液，在37°C孵育4 h。利用多功能酶標儀在450 nm的激發波長下測量OD值，X軸上繪制奧沙利鉑濃度，在Y軸上繪制OD450值，繪制細胞生長曲線，計算奧沙利鉑引起細胞的半抑制濃度(IC50)，所有實驗分別進行了3次。

1.4 外泌體的提取分離和形態鑒定

收集細胞培養上清，12 000 g離心30 min，去除上清，得到外泌體。向外泌體中加入5 ml PBS，對外泌體進行洗滌，輕輕混勻后使用離心力12 000 g離心30 min，去除上清，得到洗滌后的外泌體。從-80℃冰箱取出分裝后的外泌體，取10 μl外泌體懸液滴至2 mm電鏡銅網狀柵中，室溫靜止1 min，用濾紙吸去多余水分。加入10 μl、20 g/L磷鎢酸于銅網上負染 2 min 后濾紙吸干，白熾燈下烤干，采用 Hitachi-7500 透射電子顯微鏡觀察外泌體形態并拍照。

1.5 蛋白質免疫印跡

取出分裝后的外泌體，加入適量蛋白裂解液冰上裂解30 min，每隔5 min于渦旋儀上震蕩，4℃下12 000離心10 min，上清即為外泌體蛋白。蛋白樣本進行10% SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳，待Marker完全分離，將膠轉移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉90 min。采用含1% Tween-20的TBS洗膜，每次5 min，共3次。分別加入一抗(1∶1 000)于4℃孵育過夜，二抗(1∶10 000)37 ℃孵育1.5 h，凝膠成像儀捕獲蛋白條帶圖像，采用Image J軟件進行量化，實驗重復3次。

1.6 SGC7901/L-OHP細胞來源外泌體與SGC7901細胞共培養

向耐藥細胞株SGC7901/L-OHP中轉染miR-21 mimic，繼續培養細胞48 h。收集細胞培養上清，采用超速離心法分離外泌體。將SGC7901/L-OHP細胞中分離的外泌體與敏感細胞SGC7901共培養，隨后采用奧沙利鉑處理，觀察奧沙利鉑對SGC7901增殖抑制率的影響。

1.7 熒光定量PCR

根據說明書要求，使用TRIzol試劑從細胞、外泌體和臨床組織樣本中提取出總RNA，并用 Prime Script RT reagent Kit(Invitrogen,USA) 合成第一鏈cDNA。使用miRcute Plus miRNA qPCR Detection Kit(TIANGEN)進行RT-qPCR反應。miRNA的相對表達水平用U6進行標準化。相對表達量用2-ΔΔCT法進行計算。

1.8 患者納入和排除標準

選擇 2018年1月至 2021年6月就診于空軍軍醫大學第一附屬醫院的124例患者，其中治療敏感患者62例，耐藥患者62例，行腹腔鏡胃癌根治術并接受術后鉑類化療的。納入標準：簽署知情同意書，同意參加此研究者；年齡 18～75歲；病理確診進展期胃癌患者；患者均進行規范腹腔鏡胃癌根治手術，并接受了以鉑類為基礎的化療方案；既往無其他部位腫瘤病史；無嚴重心肺功能、肝腎功能損害等化療禁忌者。排除標準：后期無法實現隨訪者；妊娠或哺乳期婦女；臨床資料不全者；血液系統及免疫系統疾病患者。

1.9 數據統計分析

采用Graphpad prism 8.0.3軟件對數據進行統計分析，數據用均值±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析和t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 外泌體形態和標志物鑒定如圖1所示，透射電鏡下可見大小不一、外形為橢圓形微小囊狀，此為外泌體。隨后用western blot檢測外泌體標志蛋白，結果顯示，在血漿和血漿外泌體中均能檢測到外泌體標志蛋白TSG101、CD63和CD9的表達，與血漿相比，血漿外泌體中TSG101、CD63 及 CD9 的蛋白表達量更高，見圖2。

圖1 透射電鏡觀察外泌體形態量

圖2 Western blot檢測外泌體標記蛋白CD9、CD63和TSG101的表達

2.2 RT-qPCR檢測外泌體miR-21在耐藥細胞SGC7901/L-OHP和親本細胞SGC7901中的表達量結果顯示，miR-21在耐藥細胞株SGC7901/L-OHP中的相對表達量高于SGC7901中的相對表達量，其中在SGC7901/L-OHP細胞株中的相對表達量為7.703±2.142，在SGC7901中的相對表達量為0.937±0.071(P<0.05)。

2.3 外泌體miR-21傳遞耐藥性的能力檢測向SGC7901/L-OHP中轉入miR-21 mimic和NC mimic，檢測miR-21的過表達效率，結果顯示，miR-21在SGC7901/L-OHP中的相對表達量為11.69±1.239，在對照組NC mimic中的相對表達量為1.120±0.120，說明miR-21轉染成功(P<0.05)。收集轉染miR-21 mimic和NC miRNA的SGC7901/L-OHP細胞培養上清，分別提取外泌體，與親本細胞SGC7901細胞共培養，并設置未共培養的SGC7901作為空白對照組。通過CCK8檢測SGC7901對奧沙利鉑的敏感性，IC50在空白對照組、NC mimic組和miR-21 mimic組中分別為16.40、22.95和39.46 μmol/L，說明耐藥細胞SGC7901/L-OHP通過外泌體將耐藥性傳遞給敏感細胞，使親本細胞對奧沙利鉑的敏感性下降。

2.4 RT-qPCR檢測臨床血漿樣本外泌體中miR-21的表達量患者在誘導化療結束后，根據療效將患者分為兩組，分別選取化療敏感者和耐藥患者各62例，提取血漿外泌體，檢測患者miR-21的表達量，結果顯示，化療敏感患者血漿外泌體中的相對表達量為2.235±1.491，耐藥患者血漿外泌體中的相對表達量為7.682±4.490。說明，miR-21在耐藥患者血漿外泌體中的表達量高于敏感患者的血漿外泌體(P<0.05)。

2.5 血漿外泌體miR-21對胃癌患者化療敏感性的預測價值ROC曲線結果顯示，外泌體miR-21預測胃癌患者化療敏感性的曲線下面積為0.7921(95%CI:0.7118-0.8725，P<0.001)，靈敏度和特異性分別為62.90%和96.77%，見圖3。

圖3 ROC曲線顯示血漿外泌體miR-21表達對胃癌患者化療敏感性的預測價值

3 討論

腫瘤化療耐藥是一個復雜多因子參與的一個過程，耐藥發生的原因主要包括藥物外流、細胞凋亡減少、DNA修復能力增強等。化療耐藥是導致患者治療失敗的主要原因，若是在化療前得知患者對藥物的敏感性，及早使用靶向藥物，對于控制患者病情，提高患者的生存期具有重要意義。

外泌體是直徑在30～150 nm之間的囊泡，廣泛存在于多種體液中，富含有多種生物活性成分，具有顯著的分子異質性。外泌體作為一種重要的細胞間信息交流的工具，是連接細胞與微環境之間相互作用的橋梁。外泌體包裹miRNA可以防止被RNAase酶降解，有利于被受體細胞攝取進而影響受體細胞的生物學行為。耐藥細胞可以將攜帶miRNA的外泌體釋放到微環境中，進而賦予受體細胞耐藥性[1]。經研究證實，腫瘤細胞分泌的外泌體不但可以促進腫瘤細胞的增殖、侵襲與轉移，抑制機體的免疫反應，同時，耐藥細胞來源的外泌體能將分子轉運至受體細胞，增加受體細胞對化療藥物的耐藥性。

文獻調研發現miR-21能夠通過外泌體分泌，促進結腸腺癌的增殖、侵襲和耐藥[5]；同時外泌體來源的miR-21還能增加食管癌[6]和肺癌[7]等腫瘤的化療耐藥性；另外，外泌體來源的miR-21還能通過靶向PTEN和PDCD4促進口腔鱗癌的耐藥性[8]。miR-21能否通過外泌體將miR-21從耐藥細胞傳遞到受體細胞？迄今為止，僅有研究表明巨噬細胞外泌體來源的miR-21能夠增加胃癌細胞的耐藥性[9]，但是miR-21在胃癌中從耐藥細胞傳遞到敏感細胞未曾見報道。

因此，本研究用胃癌細胞SGC7901構建了奧沙利鉑耐藥細胞株，并提取耐藥細胞和敏感細胞上清的外泌體，檢測外泌體的形態和標記蛋白，隨后，檢測耐藥細胞和敏感細胞株中miR-21的表達量，發現miR-21在奧沙利鉑耐藥細胞中的表達量高于敏感細胞，這與miR-21在上述文獻中的作用一致。隨后向耐藥細胞中轉染miR-21后，收集上清提取外泌體并添加至敏感細胞中，結果顯示敏感細胞的IC50增加，最后，收集了臨床上化療敏感和耐藥的患者血漿，發現對化療藥物不敏感患者中的miR-21相對表達量較化療敏感者高，且ROC曲線分析顯示血漿外泌體miR-21能夠作為胃癌評價化療耐藥的標志物。

腫瘤化療耐藥是一個復雜多因子參與的一個過程，外泌體介導的耐藥因子還有很多。在本研究中，只探討了一種胃癌耐藥細胞SGC7901/L-OHP，在其他胃癌細胞中，是否也存在同樣的耐藥情況，還需要進一步去探索，另外miR-21是否只能對奧沙利鉑作用胃癌的療效進行預測？在其他化療藥物中的療效怎樣也將是后續需要探索的問題。