幽門螺旋桿菌毒力因子 CagA 介導的 PI3K-AKT信號通路活化對胃癌細胞增殖和凋亡的影響

王麗萍,陳 平,叢春莉,劉彥琦

(內蒙醫科大學附屬醫院 消化內科，內蒙古 呼和浩特010050)

胃癌(gastric carcinoma，GC)是由于體內某種類型的細胞在胃異常增殖而引起的[1]。2018年僅新增病例就超過100萬例，預估的死亡人數達到78.3萬人[2]。該疾病發展是一個多步驟的過程[3]。目前研究發現，某些輻射、化學物質、細菌或病毒在內的許多因素可直接或間接地影響DNA復制過程發生突變，影響細胞增殖[4-6]。有研究使用腫瘤促進劑發現刺激細胞增殖可增加癌癥的發展[7]。許多因素可能在胃癌的發展中起作用，這些因素在研究中被證實是影響胃癌發展的獨立因素[8-10],如幽門螺旋桿菌(helicobacterpylori，H.pylori)感染。在發展中國家，70% 至90% 的人在10歲之前攜帶幽門螺桿菌[11]，60%胃癌患者感染H.pylori。由于H.pylori感染是慢性活動性胃炎、胃黏膜相關淋巴樣組織淋巴瘤、消化性潰瘍及胃癌發生之間的關系已經得到了證實[12]。WHO在1994年已將H.pylori列為第一類致癌物[13]。

幽門螺旋桿菌毒力因子又稱細胞毒素相關蛋白A(cytotoxin-associated gene A,CagA)，是125kDa-145kDa效應蛋白，表達該蛋白的菌株被認為是高毒力菌株，其中就包括H.pylori。CagA(+)的H.pylori菌株被稱為Ⅰ型菌株[14]。目前研究已經明確Ⅰ型菌株的H.pylori引起的胃黏膜損傷、胃部炎癥更為嚴重，且患胃癌的風險更高[15]。當CagA 癌蛋白植入到胃上皮細胞時，會擾亂多種細胞內信號通路，促進宿主細胞的惡性轉化。CagA 的致癌活性與促炎癥反應之間還存在相互的前饋刺激機制[16]，進一步加劇了胃癌的發展。磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinases，PI3K)激活導致磷脂酰肌醇依賴性激酶1(phosphatidylinositol kinase1，PDK1)的刺激，這是一種磷酸化和激活蛋白激酶B(protein kinase B,PKB)，又稱AKT[17]。AKT 通過磷酸化調節包括增殖和存活在內的多種細胞功能的多個靶點來介導 PI3K 的下游作用。PI3K-AKT 信號在胃癌標本中增加，AKT 磷酸化水平的增加與疾病的晚期相關[18]。雖然，CagA(+)菌株感染增強了細胞增殖和疾病的進展，但其參與過程的確切機制仍有待闡明。因此，本研究探討CagA是否介導PI3K-AKT信號通路活化從而影響胃癌細胞增殖和凋亡。

1 材料與方法

1.1 胃癌細胞株和CagA(+)Hp菌株

從上海信裕生物工程有限公司購買SGC-7901(人胃癌細胞，ECACC,T-25 Flask)，在10% FBS+1%P/S+RPMI-1640生長培養基中，在95%空氣、5% CO2、37℃的培養條件下每隔3天傳代1次。

從內蒙古大學附屬醫院胃癌患者胃黏膜分離培養，鑒定CagA(+)的Hp菌株復蘇、傳代后接種于改良的布氏肉湯培養基中并在5%O2、85%N2、10%CO2、37℃振蕩培養36 h。3 600 r/min離心15 min，上清液用0.22 μm直徑微孔濾膜過濾后分裝。對照濾液中未接種CagA(+)的Hp菌株。

1.2 試劑

Wortmannin購自 Cell Signaling(Danvers，MA，USA)公司，四甲基偶氮唑藍(methyhhiazolyltet-razolium，MTT)為武漢博士德生物有限公司。GAPDH購自 Santa Cruz 生物技術公司。端粒酶活性檢測試劑盒購自上?？瓢┥镉邢薰?。

1.3 細胞處理和分組

SGC-7901于培養基中培養并傳代，至細胞貼壁85%后換成新鮮配置的RPMI-1640培養液，不加任何細菌和抑制劑，收集細胞作為對照組。SGC-7901細胞以5×104/ml接種于96孔板，貼壁后棄培養液加入稀釋后的Hp菌液作為Hp組。使用Wortmannin作為PI3K-AKT通路抑制劑，經Wortmannin預處理2 h后同Hp組作相同處理，作為CagA(+)+PI3K抑制劑組。

1.4 MTT 法測定細胞活力

選擇對數生長期的細胞，配成2.0×104個/ml單細胞懸液后接種在96孔板內，每孔加入200 μl懸液培養24 h。按CagA(+)組和CagA(+)+Wortmannin組分別加入含Hp和/或不和Wortmannin的培養液(DMSO≤0．05%)再溫育24、48、72、96 h。以上所有孔設置5個復孔。再加入濃度為5 g/L的MTT10 μl，于37℃孵育4 h后離心棄上清，每孔加入150 μl的DMSO振蕩10 min后，用酶標儀檢測490 nm處各孔的吸光度值，并重復3次。

1.5 FCM法檢測細胞周期及細胞凋亡

各組細胞經不同處理后用0.25%胰酶消化收集，使用 PBS 洗滌2次，并在4℃下在75%乙醇中固定過夜。在 PBS 中洗滌2次后，將細胞用含有10 mg/mL RNA 酶的50 μg/mL(pH7.0)碘化丙錠溶液(R40432，Sigma)染色，并37 ℃孵育，避光30 min。然后將細胞轉移到帶有過濾器的流式細胞儀管中進行細胞周期分析。

1.6 端粒酶活性檢測

根據試劑盒說明書操作，使用基于聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction，PCR)的銀染分析試劑盒(# NKJ15DLM)分析端粒酶活性。在所提供的裂解試劑中提取各組胃癌細胞并提取端粒酶。然后用進行端粒重復擴增法(telomerase repeat amplification protocol，TRAP)。擴增后，PCR 產物在12%的非變性聚丙烯酰胺凝膠上分離并真空轉移到 PAGE 膜上進行銀染。在 Bioshine GelX 1650凝膠成像分析系統中掃描端粒酶特異性6-bp 階梯。用積分光密度法分析該組端粒酶活性。

1.7 PI3K-AKT mRNA相對表達量檢測

收集培養細胞，調節細胞濃度為5×106至1×107。用Trizol 試劑(Invitrogen，卡爾斯巴德，CA)從細胞中提取總RNA。Applied Biosystems使用SYBR Premix Ex TaqTM(TaKaRa，Japan)進行定量實時 PCR 分析。以 GAPDH 的 mRNA 作為內參。PI3K、AKT引物參考文獻[19]。用2-ΔΔCt 法計算 PI3K和AKT的相對表達。

1.8 統計學分析

2 結果

2.1 MTT檢測

結合細胞吸光度值和細胞個數的觀察結果顯示，與對照組相比，CagA對胃癌細胞有明顯的促進增殖的作用，其增殖作用隨時間延長逐漸增強(P<0.05)。經Wortmannin預處理的胃癌細胞活力有所下降，說明CagA可以介導PI3K-AKT活化對胃癌細胞起促進增殖作用(P<0.05)，見圖1。

圖1 MTT 法測定細胞增殖百分比

2.2 FCM檢測

實驗結果顯示，與對照組相比，CagA對胃癌細胞的有抑制凋亡有作用，該組S期、G2/M期的比例增加(P<0.05)，且未見明顯凋亡峰。CagA對胃癌細胞的作用，在PI3K-AKT通路抑制后效應減弱(P<0.05)，見表1。

表1 CagA介導PI3K/AKT活化對胃癌細胞周期的影響(n=15)

2.3 端粒酶活性檢測

對比對照組，CagA(+)組的胃癌細胞端粒酶活性較高(P<0.05)，24、48、72、96 h的A值為1.739±0.047、1.832±0.074、2.018±0.063、2.132±0.037。加入Wortmannin預處理后，隨著時間延長A值所逐漸降低的趨勢(P<0.05)，24、48、72、96 h的A值為0.192±0.002、0.082±0.003、0.073±0.005、0.062±0.003。

2.4 PI3K/AKT mRNA相對表達量檢測

用2-ΔΔCt 法計算 PI3K和AKT的相對表達結果顯示，與對照組相比，經CagA(+)Hp細菌濾液共孵育的胃癌細胞的PI3K-AKT相對表達量增加(P<0.05)，在加入PI3K-AKT通路抑制劑后，PI3K-AKT相對表達量減少(P<0.05)。說明Wortmannin有起到抑制PI3K-AKT通路的作用，見圖2。

圖2 各組PI3K/AKT mRNA的相對表達量

*P<0.05

3 討論

胃癌的發生、發展和侵襲是一個復雜而持續的過程。大多數H.pylori感染者沒有癥狀。只有10% 的感染者患有胃炎和其他疾病。然而，越來越多的證據表明由H.pylori感染引起的疾病確實增加了患胃癌的風險，即幽門螺桿菌與胃癌確有因果關系存在。有報道總結了所有可用的病例對照研究，并得出結論:幽門螺桿菌感染患者發生胃癌的相對風險是無感染患者的3.8倍。此外，在確診為幽門螺桿菌感染15年后，這種風險增加到8.7倍[20]。雖然H.pylori被認為是一類致癌物質，但它可能不是一種直接的誘變劑。CagA 及其相關致病島(CagPAI)與癌癥風險增加有關。CagA陽性被認為是幽門螺桿菌毒力的可能決定因素。研究表明，CagA 陽性H.pylori感染對胃癌的發生和發展有重要影響。CagA通過上皮細胞釋放白細胞介素8引起炎癥反應增加，導致活動性炎癥[21]。有研究發現，CagA 狀態和胃蛋白酶原水平之間有很強的相關性[22]。CagA 通過由 CagPAI 編碼的Ⅳ型分泌系統轉運到宿主細胞，定位于質膜，酪氨酸被多種 Src 激酶磷酸化。酪氨酸磷酸化的 CagA 激活 SHP-2，促進細胞增殖。

PI3K 通路是細胞中最重要的信號通路之一，參與了許多基本的細胞過程，包括增殖、細胞存活、運動和細胞生長[23],也是細胞應激過程中存活的關鍵調節因子[24]。PI3K-AKT通路的激活導致對腫瘤細胞生長和存活調控的嚴重干擾，最終導致競爭性生長優勢，轉移能力，血管生成和治療抵抗，因此PI3K-AKT通路活化對胃癌的發生發展產生很大的影響。該通路也被認為是抗癌藥物開發的最有潛力的通路之一。

在本研究中發現CagA(+)Hp感染的胃癌細胞增殖增加、凋亡降低、端粒酶活性升高，這些表現在PI3K-AKT通路被抑制后被降低。提示PI3K-AKT可能與CagA發生相互作用，影響胃癌的發生發展，可能PI3K是CagA在胃癌細胞中的靶分子。研究還表明CagA 和 PI3K-AKT可以通過影響細胞周期來促進細胞增殖，在PI3K-AKT通路被抑制后，CagA對細胞周期的調節作用減弱。這些結果表明PI3K-AKT可能是CagA調節細胞周期的靶點。