水產品中孔雀石綠殘留量測定前處理方法研究與優化

○蔣翠紅 楊翼羽 于林海 郭貴良

（長春市水產品質量安全檢測中心 吉林長春 130000）

孔雀石綠是水產養殖中禁用的一種三苯甲烷類染料，因其對治療魚的水霉病具有特效且價格低廉，加之宣傳力度不夠等原因，使得不少養殖戶還在小范圍使用。近年來研究發現，孔雀石綠在生物體內有明顯蓄積現象，會導致水生生物脊椎、頭和背鰭等部位畸變，卵染色體發生異常，對哺乳動物具有高毒、高殘留、致癌、致畸和致突變等副作用，殘留時間達100天以上，食用含孔雀石綠的水產品，會對人體健康產生危害，因此準確測定水產品中孔雀石綠具有重要意義。目前，國內檢測部門通用的方法是GB/T 20361-2006高效液相色譜熒光檢測器法，但該法前處理繁瑣、耗時，溶液轉移次數多，易造成損失。本文參考GB/T 20361-2006法，根據實際檢測工作，探討并優化了提取、萃取等影響檢測的環節，建立一種前處理簡便、快捷，回收率穩定的水產品中孔雀石綠殘留量的檢測方法。

1 試驗材料及設備

1.1 試驗材料

（1）乙腈為色譜純；二氯甲烷、硼氫化鉀溶液、酸性氧化鋁和乙酸銨等為分析純；水為超純水。Agilent酸性氧化鋁固相萃取柱（500mg，3mL）；Agilent PRS固相萃取柱（500mg，3mL）；孔雀石綠標準品（98.0%±0.2%）購置于德國Dr公司。

（2）精確稱取孔雀石綠標準品0.0100g，用乙腈定容到100.00mL，配制成100μg/mL的標準溶液，-18℃避光保存。使用前稀釋成需要濃度。

1.2 儀器與設備

Agilent 1200高效液相色譜（配熒光檢測器FLD），離心機，漩渦振蕩器，旋轉蒸發儀，固相萃取裝置，超聲萃取儀，組織攪碎機。

2 試驗方法

2.1 樣品處理

將水產品用清水淋洗干凈。魚去鱗、去皮，沿背脊取肌肉部分；蝦去頭、殼、腸腺，取肌肉部分；蟹、甲魚等取可食部分。樣品切為不大于0.5cm×0.5cm×0.5cm的小塊后混合，攪碎混勻，四分法取樣。所取樣品分為2份，一份供測定，另一份放置于-20℃冰箱中保存，備用。

2.2 提取

①稱取5.00g樣品于50mL離心管內，加入10mL乙腈，加入5g酸性氧化鋁，振蕩2分鐘，超聲波5分鐘，4000r/分鐘離心10分鐘，上清液轉移至125mL分液漏斗中，在分液漏斗中加入2mL二甘醇，3mL0.2mol/L硼氫化鉀溶液，振搖2分鐘。②在離心管中加入10mL乙腈，3mL0.2mol/L硼氫化鉀溶液，用玻棒搗散離心管中的沉淀并攪勻，漩渦混勻器上振蕩1分鐘，靜置20分鐘，4000r/分鐘離心10分鐘，上清液并入125mL分液漏斗中。③在離心管中繼續加入1.5mL鹽酸羥胺溶液、2.5mL對-甲苯磺酸溶液、5.0mL乙酸銨緩沖溶液，振蕩2分鐘，再加入10mL乙腈，繼續振蕩2分鐘，4000r/分鐘離心10分鐘，上清液并入125mL分液漏斗中。

在分液漏斗中加入25mL二氯甲烷，具塞，劇烈振搖2分鐘，靜置分層，將下層溶液轉移至250mL雞心瓶中，繼續在分液漏斗中加入5mL乙腈、15mL二氯甲烷，振搖2分鐘，靜置分層，將下層溶液合并至250mL雞心瓶，45℃旋轉蒸發至近干，用2.5mL乙腈溶解殘渣。

2.3 凈化

將PRS柱安裝在固相萃取裝置上，上端連接酸性氧化鋁固相萃取柱，用5mL乙腈活化，轉移提取液到柱上，再用乙腈洗雞心瓶兩次，每次2.5mL，依次過柱，棄去酸性氧化鋁柱，吹PRS柱近干，在不抽真空的情況下，加入3mL等體積混合的乙腈和乙酸銨溶液（pH=10），收集洗脫液，乙腈定容至3mL，供液相色譜測定。

2.4 測定

2.4.1 高效液相色譜條件 色譜柱為Agilent ODS-C18柱（內徑250mm×4.6mm，粒度5μm）；流動相為乙腈-乙酸銨溶液（80∶20）；流速1.3mL/分鐘；柱溫35℃；激發波長265nm；發射波長360nm；進樣量20μL。

2.4.2 色譜分析 將配好的孔雀石綠標準工作溶液及樣品提取液置于液相色譜儀的樣品盤中，按上述色譜條件進行色譜分析，記錄峰面積，響應值均應在儀器檢測的線性范圍之內。根據標準品的保留時間定性（圖1），外標法定量（圖2）。

圖1 10 ng/mL孔雀石綠標準溶液液相色譜圖

圖2 標準曲線

3 結果與討論

3.1 樣品提取優化

（1）GB/T 20361-2006法中提取只采用勻漿機以10000r/分鐘的速度均質30s，勻漿只可以打碎一部分細胞，提取不完全。而本方法則采用組織攪碎機攪碎結合超聲破碎的方法提取樣品，同時省去了GB/T 20361-2006法中另取離心管加乙腈洗滌勻漿機刀頭的步驟，防止了用勻漿機勻漿增加加標損失，影響回收率。隱色孔雀石綠是孔雀石綠在生物體中的代謝產物，存在于細胞內，超聲提取彌補了勻漿機的不足，進一步進行細胞破壁提取，使組織內成分提取更加完全，有利于目標物的溶出，提高回收率。此外，超聲時間需要控制，時間過長容易引入較多的雜質，時間過短會造成提取不完全。有研究表明，超聲提取以5分鐘為宜。

（2）GB/T 20361-2006方法的樣品前處理過程中，樣品要經歷4次采用乙腈提取結合4次離心獲得目標物提取液，提取步驟多，成本高，影響回收率。為此，本方法省去第4步用乙腈提取并離心的步驟，這與2016年農業部組織的水產品中孔雀石綠殘留檢測能力驗證作業指導書中要求的相一致，減少了提取步驟，降低了成本，提高了工作效率。

3.2 樣品液液萃取優化

在實際樣品前處理過程中，水相與有機相的比例影響二者的分層效果，比例不當會導致兩相倒置、兩層界面模糊、乳化等現象。GB/T 20361-2006法采用液相法，用二氯甲烷進行反萃取時，第一次加入20mL二氯甲烷，第二次加入10mL二氯甲烷，由于乙腈對水的溶解度較大，分層不明顯，萃取效率低下，且容易使二氯甲烷發生倒相的現象，同時，有研究表明，試驗中水相的存在有助于去除樣品中水溶性雜質，因此水相的比例也不能過低。對此，本方法增加了二氯甲烷的用量，第一次加入25mL，第二次加入15mL，以使二氯甲烷相處于下層，避免了倒相，并且第二次萃取不用離心，仍用分液漏斗，分層效果也很明顯，既縮短了分離時間，又提高了提取效率。

3.3 樣品過濾膜改進

由于市面上的濾膜質量參差不齊，有時出現一些濾膜的雜峰，干擾出峰，使得譜圖不美觀，所以本方法將過柱提取液直接于刻度管中定容上機測定，節約了成本，提高了效率。

本方法目標峰能與其它雜質峰完全分離，峰形較好。

4 小結

本方法在GB/T 20361-2006法的基礎上進行了改進，將樣品前處理的勻漿提取改為樣品渦動和離心，且經超聲提取，提高了目標物的溶出效果，減少了勻漿帶來的損失，提高了回收率，同時，省去了第4步用乙腈提取并離心，減少了提取步驟，降低了成本；在萃取步驟增加了二氯甲烷用量，且第二次萃取不用離心，防止了倒相，縮短了分離時間，又提高了提取效率；實驗最后不用過濾膜過濾直接上機進行測定，節省了消耗品的成本，也避免了雜峰的干擾。需特別注意的是在樣品前處理的過程中，應避免強光直射。結果表明，經改進的方法用于檢測水產品中孔雀石綠殘留量簡便、快捷，出峰時間縮短，提高了工作效率，適用于日常水產品中孔雀石綠殘留量檢測工作的需要。當然，在今后的工作中筆者會繼續對水產品中孔雀石綠殘留量測定的前處理方法進行進一步研究、不斷改進，使之更加完善。