五種中草藥復方體外激活花鰻鱺(Anguilla marmorata)外周血白細胞活性的評價*

李忠琴 張新艷 楊求華 林 茂 江興龍 翟少偉①

(1. 集美大學水產學院 福建廈門 361021; 2. 福建省淡水水產研究所 福建福州 350002; 3. 福建省水產研究所 福建廈門361012; 4. 鰻鱺現代產業技術教育部工程研究中心 福建廈門 361021)

花鰻鱺(Anguilla marmorata)為典型的降河洄游魚類, 隸屬于硬骨魚綱(Osteichthyes)、鰻鱺目(Anguilliformes)、鰻鱺科(Anguillidae)、鰻鱺屬(Anguilla), 俗名又稱花鰻、鱸鰻、雪鰻、鱔王、烏爾鰻等(Wanget al, 2016), 主要生活在西太平洋和印度洋的熱帶、亞熱帶的近海淡水區域(Huanget al,2016)。中國本土野生花鰻鱺受到水資源污染, 過度捕撈等危害, 苗種資源日漸枯竭, 于1988 年被中國列為瀕危物種, 是國家二級保護野生動物(陳健榮等,2018)。目前中國推廣養殖的花鰻鱺魚苗主要來自菲律賓等東南亞海域。相對于日本鰻鱺等傳統鰻鱺品種,花鰻鱺的苗種儲備豐富, 價格低, 養殖利潤較高, 有助于應對鰻鱺養殖品種單一的難題, 填補鰻苗市場空缺。花鰻鱺的養殖勢頭良好, 但由于集約化養殖的弊端和養殖技術的局限, 養殖過程中容易受到環境、管理、營養、疾病等因素的影響而感染疾病(于海振,2014)。防治花鰻鱺疾病一般使用抗生素類化學藥物,這類藥物抑菌效果顯著, 但是如果使用不當, 會導致生物體內抗藥菌株的增加、細菌耐藥性增強, 而抗生素殘留問題導致的水產品安全性問題也對鰻鱺出口有著嚴重影響, 危害食用人群的身體健康。

中草藥作為漁用合成藥物、抗生素等藥用添加劑的安全有效的替代品, 對養殖魚類具有免疫增強、抗炎、誘食、促消化和促生長等功效(路晶晶等, 2018; Huet al, 2019)。其配制形式可分為兩種, 一種是以單味中藥的形式添加到飼料中, 該形式對動物的作用具有偏向性, 只能發揮部分功效; 另一種是配伍多種具有不同功效的中草藥, 以復方的形式添加到飼料中,該形式能同時兼顧多種功效, 比單味中藥更高效、更全面。目前, 中草藥復方在漁業中的應用越來越常見,而評價中草藥復方的藥效是中草藥應用推廣過程中不可缺少的環節。

魚類白細胞的呼吸暴發是指白細胞吞噬病原微生物后的一種氧依賴的殺傷機制, 可以作為評價機體殺滅被吞噬進白細胞的有害物質能力的指標(程鎮燕等, 2017)。血細胞中的嗜中性顆粒白細胞和巨噬細胞擁有著強大的吞噬作用, 在機體非特異性免疫機制中有必不可少的作用(王曉雯等, 2017)。本實驗使用非連續性密度梯度離心法優化花鰻鱺外周血白細胞的分離體系, 采用染色觀察法和流式細胞術檢測各分離液中白細胞濃度。采用NBT 法和流式細胞術測定白細胞的呼吸暴發活性和吞噬能力, 旨在評價五種中草藥復方對花鰻鱺外周血白細胞的激活作用,明確中草藥復方對花鰻鱺的白細胞是否具有免疫促進作用, 為中草藥復方在水產養殖中的研制與應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

五種中草藥復方為鰻鱺現代產業技術教育部工程研究中心自主研制, 均以主成分命名, 分別為多糖(Dt)復方、白頭翁(Btw)復方、板藍根(Blg)復方、大黃(Dh)復方、百里酚(Blf)復方, 分別用5%二甲基亞砜溶解成1.0 mg/mL, 3 000 r/min 離心5 min, 取上清備用。花鰻鱺(200 g±9.7 g), 購自福建省龍巖大泉鰻魚養殖有限公司。

1.2 花鰻鱺外周血白細胞的分離

1.2.1 花鰻鱺血樣制備 丁香油麻醉花鰻鱺, 用經3 000 U/mL 肝素鈉浸潤的注射器從花鰻鱺尾靜脈取血1 mL, 加入兩倍體積的細胞培養基, 混勻, 4 °C保存待用。

1.2.2 花鰻鱺外周血白細胞的分離 用生理鹽水將 Percoll 分離液配制成 20% (1.031 g/mL)、30%(1.043 g/mL)、40% (1.056 g/mL)、50% (1.067 g/mL)、60% (1.090 g/mL) 5 個不連續密度梯度, 分別取0.5 mL 各密度的分離液于不同的1.5 mL 離心管中,沿管壁小心緩慢加入上述血液樣品1 mL, 每個密度重復三管, 室溫400g離心20 min。取上清, 等體積加入細胞培養基, 混勻制成白細胞懸液。

1.2.3 白細胞計數 取20 μL 上述白細胞懸液于血球計數板中, 加入20 μL 吉姆薩(Giemsa)染色液,顯微鏡上計數每個密度梯度分離液中白細胞; 另取100 μL 白細胞懸液, 使用流式細胞儀檢測白細胞濃度, 綜合分析并選擇最適密度的分離液分離花鰻鱺外周血白細胞。

1.3 白細胞的呼吸暴發測定與數據分析

在96 孔板中, 每一行為一組, 每組分為兩個亞組(L, N), 每個亞組3 個孔, 第一行(A 行)作為空白組,其余各行(B～F 行)為實驗組。96 孔板每孔加入100 μL 1.0×105cell/mL 白細胞懸液, A 行加入100 μL PBS 緩沖液, B～F 行分別加入Dt、Btw、Blg、Dh 和Blf 共5種1.0 mg/mL 中草藥復方, 每孔用PBS 緩沖液補齊到300 μL。室溫孵育2 h 后去上清100 μL, 用細胞培養基100 μL 清洗三次。L 亞組每孔加50 μL 細胞培養基和50 μL PBS 緩沖液, N 亞組每孔加入50 μL 0.2%NBT 溶液和50 μL 細胞培養基, 室溫孵育1 h。每孔去上清100 μL, 加入100 μL 甲醇固定3 min, 去上清100 μL, 再用100 μL 70%甲醇清洗3 次, 小心吸走孔內所有液體, 室溫風干, 每孔加入100 μL 2 mol/L 氫氧化鉀和200 μL 二甲基亞砜, 酶標儀測定每孔的OD630nm值。

分別計算每組的相對呼吸暴發活性(SPO)、實驗組相較于空白組的呼吸暴發提高率NBT%。

式中, ODN: 使用酶標儀檢測N 亞組在波長630 nm 處的 OD 值; ODL: 使用酶標儀檢測 L 亞組在波長630 nm 處的OD 值。

1.4 白細胞的吞噬活性測定與數據分析

流式細胞術測定白細胞的吞噬活性: 分別取5 種1.0 mg/mL 中草藥復方藥液100 μL 于不同的離心管中,每種藥液設置3 個重復, 作為5 個實驗組, 另取100 μL 5%二甲基亞砜于另外3 個離心管中, 作為空白對照。每管加入200 μL 1.0×105cell/mL 白細胞懸液, 孵育2 h,每管加入20 μL 用生理鹽水100 倍稀釋的熒光微球溶液,避光孵育1 h, 依次使用流式細胞儀上機檢測。

圖1 為以參數前向散射角(forward scatter, FSC)為x軸, 側向散射角(side scatter, SSC)為y軸建立的散點圖, 分別代表細胞的復雜程度和大小, 圖2 為FITC直方圖(橫坐標代表細胞的大小, 縱坐標代表細胞的豐富度)。分別計算白細胞吞噬率、發生吞噬白細胞率, 公式如下:

圖1 花鰻鱺白細胞吞噬反應的SSC/FSC 二維散點圖Fig.1 SSC/FSC two-dimensional scatter plot of phagocytosis in A. marmorata

圖2 花鰻鱺白細胞吞噬反應的FITC 直方圖Fig.2 FITC histogram of phagocytosis in A. marmorata

式中,M1、M2: 未被吞噬的熒光微球顆粒數,M1中的每個顆粒包含1 個熒光微球,M2中每個顆粒包含2 個熒光微球;N: 所有發出熒光的顆粒數;N1: 檢測得到的顆粒總數;N2: 熒光微球顆粒總數;P1～P5: 分別表示發出單個、2 個、3 個、4 個和5 個熒光強度的顆粒數, 一個熒光強度代表一個熒光微球顆粒。

1.5 統計學分析

實驗數據處理采用SPSS 25.0 統計學軟件進行單因素方差分析處理, Duncan 法進行多重比較, 結果以平均值±標準差(mean±SD)表示,P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 花鰻鱺外周血白細胞的分離

兩種測定白細胞濃度方法的結果如圖3, 花鰻鱺外周血在20%、30%、40%、50%、60%這5 個密度梯度的Percoll 分離液的作用下, 分離獲得的白細胞的數量隨著Percoll 分離液的密度下降而不斷減少,即20%＜30%＜40%＜50%＜60%, 其中, 30%和40%的密度獲得的白細胞數量都是在105cell/mL 左右, 而流式細胞儀要求上機顆粒濃度在105cell/mL 左右更具精確性, 因此, 30%和40%的兩個分離液密度更加適合本實驗要求。對比兩種計數方法, 可以看到, 染色法計算得出的白細胞數量普遍小于流式細胞術, 但是相差不超過10%, 隨著分離液梯度變化的規律也一致, 重復性良好, 符合實驗要求。

圖3 各比例梯度的Percoll 分離液分離花鰻鱺外周血白細胞的效果Fig.3 Separation of leukocyte from A. marmorata peripheral blood by Percoll separation solution in different density gradients

2.2 五種中草藥復方對花鰻鱺白細胞氧呼吸暴發活性的影響

5 種中草藥復方對花鰻鱺白細胞的氧呼吸暴發活性的影響結果如圖4, NBT%為各中草藥復方與空白組比較的相對呼吸暴發活性提高率。5 種中草藥復方皆在不同程度上提高了花鰻鱺外周血白細胞的呼吸暴發活性, 呼吸暴發活性大小依次為Blg＞Dt＞Btw＞Blf＞Dh, 其中 Blg 組和 Dt 組的 NBT%分別高達1 030.00%和728.57%, 約為空白組的10 倍和7 倍, 均極顯著高于Dh 和Blf 組(P＜0.01)。Btw 組的NBT%為413.00%, 是空白組的 4 倍, 并顯著高于 Dh 組(P＜0.05), 與Blf 組差異不顯著(P＞0.05), 在該實驗中,Dt 組、Btw 組和Blg 組對花鰻鱺白細胞的呼吸暴發活性的促進效果最佳。

圖4 五種中草藥復方與花鰻鱺白細胞孵育后的呼吸暴發活性Fig.4 Respiratory burst activity of A. marmorata leukocyteafter incubation with five Chinese herbal compounds

2.3 五種中草藥復方對花鰻鱺白細胞吞噬能力的影響

從兩個方面評價5 種中草藥復方對花鰻鱺外周血白細胞的吞噬能力, 結果如圖5 所示, 發生吞噬白細胞率代表發生吞噬活動的白細胞的百分數, 花鰻鱺白細胞經過藥液的孵育后, 發生吞噬白細胞率均有提高, 大小依次為Dt＞Btw＞Blg＞Dh＞Blf ＞空白, 但每組間的差異不顯著(P＞0.05)。白細胞吞噬率代表白細胞在同樣微球濃度的溶液體系中吞噬微球總量的百分數, 可以看出, 5 種中草藥復方均較大程度上提高了白細胞吞噬率, 由大到小依次為Dt＞Blg＞Btw＞Dh＞Blf ＞空白, 其中Dt 組的白細胞吞噬率與空白組的差異極顯著(P＜0.01), Blg 組顯著高于空白組(P＜0.05), Btw、Dh 和Blf 組的白細胞吞噬率雖然高于空白組, 但差異不顯著(P＞0.05)。

圖5 五種中草藥復方對花鰻鱺白細胞吞噬能力的影響Fig.5 Effects of five Chinese herbal compounds on the phagocytosis of leukocyte from A. marmorata

3 討論

3.1 Percoll 細胞分離液分離花鰻鱺外周血白細胞的條件優化

生物種類不同, 血細胞組成和每種血細胞含量也有所不同, 因此針對不同的生物類型, 應選擇適合的血細胞分離條件。國內外有許多學者對不同魚類的白細胞分離條件進行了調整與優化, 如半滑舌鰨(郝爽等, 2018)、鯉魚(豐培金等, 2004)和真鯛(孫修勤,2000)等。測定白細胞呼吸暴發活性和吞噬活性要求實驗白細胞濃度在105cell/mL 左右, 濃度過高或過低都會影響酶標儀和流式細胞儀檢測的精確性和準確性。經實驗驗證, 30%和40%的密度獲得的花鰻鱺外周血白細胞數量在105cell/mL 左右, 符合實驗要求。因此在正式的白細胞分離實驗中, 采取40%和30%分離液上下層疊加的體系。白細胞吞噬實驗需要的細胞種類應為巨噬細胞和中性粒細胞等具有吞噬作用的白細胞。而該體系下得到的白細胞除了這類吞噬細胞外還存在血小板等其他不具有吞噬作用的血細胞, 使得實驗獲得的發生吞噬白細胞率偏低。這一點在豐培金等(2004)的研究中得到證實, 在同一離心管中疊加不同密度的細胞分離液分離鯉魚外周血白細胞, 并鑒定了各液層分離出來的白細胞種類, 發現每種血細胞(紅細胞除外)在各個液層皆有分布, 但濃度比例各異。因此, 在后續的實驗中, 應尋求能更準確分離具有吞噬作用白細胞的方法, 以提高實驗數據的精確度。

3.2 白細胞濃度計數方法的比較

本研究在對Percoll 分離液密度優化的實驗中,使用了兩種方法計數白細胞濃度, 分別為染色觀察法和流式細胞術。從實驗結果來看, 流式細胞術比染色觀察法計算得出的白細胞數量多。究其原因是使用血涂片在顯微鏡下計數, 準確性不高, 誤差大, 且費時費力; 再者, 染色劑本身的局限性使得著色的白細胞種類不完全, 而流式細胞儀檢測細胞的優勢在于儀器的檢測通道僅允許顆粒依次通過, 不但能快速而準確地定量, 還能根據顆粒的各種屬性進行分選分析, 因此能捕捉到常規染色法中未能被染色劑著色的白細胞, 既有準確性又有針對性, 還省時省力,檢測更全面。

由于流式細胞術有強大的分選功能, 近些年來,國內外許多科學家應用流式細胞術精確區分了許多類型的白細胞。Faucher 等(2007)使用流式細胞術成功區分了中性粒細胞、單核細胞和B 淋巴細胞等白細胞類型, 但未能完全識別淋巴細胞亞群。Van De Geijn等(2011)同樣采用流式細胞術檢測出漿細胞、有核紅細胞、淋巴細胞亞群等, 分類更加全面。陽晶等(2015)應用流式細胞術從混合細胞群中分選活的衰老細胞。王新等(2013)發展并優化了一套操作簡便、效率較高的流式細胞儀實驗技術來分選轉基因斑馬魚的熒光標記細胞。在今后的實驗設計中, 可研究使用流式細胞儀有效分選出具有吞噬作用的花鰻鱺白細胞, 省去體外分離白細胞的繁瑣步驟, 直接在儀器上選擇特定細胞群, 并分析細胞群的特定功能; 還可以研究選用微流控芯片全自動裝置來檢測和分選白細胞(宋振玉等, 2015)。

3.3 五種中草藥復方對激活白細胞免疫作用的影響

本實驗中用于篩選的五種中草藥復方分別由多糖、白頭翁、板藍根、大黃、百里酚為主要成分, 配伍多種中藥免疫活性物質制作而成。多糖主要具有抗氧化、抗病毒、提高免疫力等活性(孟祥云等, 2018),在水產動物疾病防治研究中的用途非常廣泛, 如當歸多糖(譚連杰等, 2018)、海帶多糖(林建斌等,2017)、黃芪多糖(章燕鈴等, 2021) 分 別對卵形鯧 鲹、大黃魚、黃鱔等都有免疫增強的作用。白頭翁中的五環三萜皂苷類化合物是影響其藥理學活性的主要成分, 具有抗菌、抗炎、促進免疫以及抗血吸蟲病等作用(李春曉等, 2018); 夏與晴等(2019)研究表明白頭翁針對水產養殖中常見的5 種致病菌有良好的抑菌效果。板藍根具有清熱解毒、抗病毒和涼血利咽等功效,彭翔等(2013)用不同濃度的板藍根濃縮液拌料投喂施氏鱘幼魚, 發現其抗氧化酶活性、補體C3 和抗體IgM有一定的提高。大黃以清熱、延緩衰老成分和消炎抑菌等功效著稱于世, 李忠琴等(2012)檢測大黃對5 株從病鰻中分離出來的氣單胞菌的最低抑菌濃度, 有很好的抑菌效果, 最低抑菌濃度僅為0.75～1.50 mg/mL。百里酚來源于百里香、麝香草等植物, 該成分具有抗氧化、抑菌抗炎和防腐等功效, 百里酚目前應用于水產魚類疾病的研究較少。在食品研究中, 裴海閏等(2011)發現百里酚對大豆油有較強的抗氧化作用, 且對金黃色葡萄球菌等四株細菌均有不同程度的抑菌效果。上述5 種復方主要成分一般有其偏好的功效,與具有其他作用的中藥活性物質配伍后, 在一定程度上能擴大作用范圍和補充更多的功效。

魚類白細胞的呼吸暴發是指白細胞吞噬病原微生物后的一種氧依賴的殺傷機制, 生成的OCl–具有殺菌效果, 可以殺滅被吞噬進白細胞的有害物質。NBT 能與O2-相互作用產生藍色的甲腙, 甲腙在560 nm 處有最大的峰值。血細胞中的嗜中性顆粒白細胞和巨噬細胞擁有著強大的吞噬作用, 在機體非特異性免疫機制中有必不可少的作用。本實驗研究花鰻鱺白細胞的免疫活性, 在熒光微球的脅迫下, 白細胞被藥物激活產生吞噬作用, 分別以發生吞噬白細胞率和白細胞吞噬率來評價。孫曉飛(2014)檢測了39種單味中藥對棕點石斑魚血白細胞的呼吸暴發和吞噬作用, 結果顯示, 大部分中草藥對石斑魚白細胞免疫作用有增強效果。從本實驗結果可以看出, 五種復方均促進了花鰻鱺白細胞的呼吸暴發活性, 其中多糖復方、白頭翁復方、板藍根復方的促進效果優于大黃復方和百里酚復方。五種中草藥復方影響花鰻鱺白細胞吞噬率的差異性表現比發生吞噬白細胞率突出,其中多糖、白頭翁、板藍根復方組的白細胞吞噬率顯著高于空白組, 且高于大黃復方和百里酚復方。在發生吞噬白細胞率中, 五種中草藥復方均高于空白組,但差異并非十分明顯, 原因可能是白細胞懸液中含有大量不具有吞噬作用的血細胞, 懸液中細胞基數增大, 有吞噬作用的白細胞比率大大降低, 導致實驗檢測的各復方之間發生吞噬白細胞率差異不顯著。

4 結論

中草藥免疫增強劑應用于魚類的研究已有多年的歷史, 本研究綜合白細胞的呼吸暴發和吞噬能力的結果, 分析五種中草藥復方對花鰻鱺白細胞免疫活性的影響, 其中多糖復方、白頭翁復方、板藍根復方的體外激活白細胞免疫活性的效應更突出, 作為花鰻鱺免疫增強劑具有良好的推廣應用前景, 有助于擴大水產養殖業漁藥研制與應用的選擇。