抗大口黑鱸(Micropterus salmoides)蛙虹彩病毒藥效模型的構建及其抗病毒中藥篩選*

李秋語 黃小紅 郝貴杰 胡大雁 張成賽 牛 晨 袁雪梅 黃 雷于 喆 姚嘉赟① 楊桂連 姜建湖

(1. 吉林農業大學動物科學與技術學院 吉林省動物微生態制劑工程研究中心 吉林長春 130118; 2. 浙江省淡水水產研究所農業農村部淡水漁業健康養殖重點實驗室 浙江省魚類健康與營養重點實驗室 浙江湖州 313001; 3. 湖州市農業科技發展中心浙江湖州 313001)

大口黑鱸(Micropterus salmoides)是我國重要的淡水養殖魚類, 因其肉質鮮美, 深受國人喜愛, 目前其在我國的年產量約為50 萬t, 有著“第五大家魚”之稱(Liet al, 2020)。但近年來, 隨著養殖密度的不斷提高以及養殖環境的惡化, 病害暴發日益嚴重, 嚴重影響了產業的發展, 目前病害已成為大口黑鱸養殖產業發展的一大瓶頸問題(Shimaharaet al, 2010;Godahewaet al, 2018)。其中, 養殖階段危害最大的是體表潰瘍綜合征, 其病原為大口黑鱸蛙虹彩病毒(largemouth bass virus, LMBV) (Plumbet al, 1996;Grizzleet al, 2002), 它可造成養殖階段大口黑鱸的大量死亡, 死亡率可達70%以上。蛙虹彩病毒是一種直徑120～300 nm 的正二十面體病毒, 多為單分子線性雙鏈DNA 病毒, 基因組大小為l70～200 kb。大口黑鱸感染后其肝脾腎臟會出現不同程度的充血腫脹,皮膚是大口黑鱸最易受感染的靶器官, 宿主體表通常出現大面積的潰瘍, 嚴重時肌肉壞死形成瘺, 腹鰭處出現念珠狀, 死亡率高達40%以上。

疫苗一直以來是病害防控的重要利器, 在人類以及動物的疫病防控中起著舉足輕重的作用(Yaoet al, 2016)。水產動物疫病研究歷經一個多世紀的發展,在我國取得了長足的進步, 但因水產動物本身的特性決定了水產動物疫苗具有注射免疫操作復雜, 容易產生應激, 免疫效果相對較差等缺點(Yaoet al,2011a)。中藥因其來于自然用于自然, 具有毒性相對較低、相對綠色安全等優勢, 一直以來是新藥研發的熱點和焦點同時, 天然產物具有結構新穎、活性成分豐富等特點, 是發現新型抗病毒藥物先導物的重要來源(Yaoet al, 2011b)。藥物篩選的關鍵和核心是建立快捷、高效的藥效篩選模型, 抗病毒藥物的篩選模型主要有體外藥效篩選模型和體內藥效篩選模型,體外藥效篩選模型具有操作便捷, 實驗周期較短的優點等優點; 體內模型相較于體外模型, 雖然耗時較長, 但能更全面反映藥物的實際抗病毒效果。在水產動物中, 影響病毒感染模型的因素很多, 包括環境因子、魚體本身的生理機能、病毒的毒性等。

因此, 本研究擬通過研究水溫、病毒載量以及魚體大小等這幾個關鍵因子對大口黑鱸感染蛙虹彩病毒的影響, 進而構建體內抗病毒藥效篩選模型, 結合體外藥效模型, 構建大口黑鱸蛙虹彩病毒藥物篩選模型, 篩選出有效的抗病毒藥物中草藥, 并進行抗病毒藥效評價, 為大口黑鱸蛙虹彩病毒的防控提供重要的技術手段和方案。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

大口黑鱸(Micropterus salmoides)購買自湖州融晟漁業科技有限公司, 體表光滑無損傷, 經顯微觀察無寄生蟲感染, 隨機取10 尾經BHI 培養基分離未發現病原感染, 并經 PCR 檢測不攜帶蛙虹彩病毒。

大口黑鱸蛙虹彩病毒LMBV 由本實驗分離鑒定,按照常規方法在鯉魚上皮瘤細胞上進行培養, 并經擴大培養獲得100 mL 的病毒培養液, 進而測定其半數細胞培養物感染量(TCID50)后放置于–80 °C 冰箱中保存備用。

鯉魚上皮瘤細胞(Epithelioma papulosum cyprini,EPC 細胞)由浙江省淡水水產研究所實驗室保存; 大口黑鱸蛙病毒LMBV-YJ 株由浙江省淡水水產研究所實驗室分離、鑒定和保存; 所使用的中藥(表1)均購于安徽亳州中藥材市場; 四唑鹽(MTT)細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒購自廣州永津生物科技有限公司;QIAamp DNA Mini Kit/QIAamp RNA Mini Kit 購自上海浦泉生物科技中心。

表1 實驗用中草藥Tab.1 The Chinese herbal medicines used for experiment

1.2 方法

1.2.1 藥物的制備 將購買的中草藥經粉碎后過40 目篩, 并按照1∶8 的比例(藥物∶75%乙醇)在55°C 的條件下, 抽提1 次后, 每次3 h, 過濾后殘渣按照1∶5 的比例(藥物∶75%乙醇)抽提2 次, 合并抽提液,旋轉蒸發儀蒸至浸膏狀, 再于真空干燥箱中干燥至粉末狀, 4 °C 冰箱保存備用。

1.2.2 藥物的配制 精確稱取中藥的干燥提取物,溶解與DMSO 中, 使其濃度為100 mg/mL, 使用時在利用滅菌的生理鹽水進行稀釋至所需濃度, 進行細胞實驗時, 將充分溶解的藥物分別過0.45、0.2 以及0.1 μm 的有機濾膜過濾, 同時對藥液在BHI、TSA 培養基以及含0.2%胎牛血清的M199 培養基上進行培養以確保不含雜菌。

1.2.3 體外藥效篩選試驗 在進行藥效之前先確定藥物對細胞的毒性作用濃度。在96 孔細胞培養板中加入約106個EPC 細胞過夜后, 加入不同濃度梯度各中藥提取物, 72 h 后利用MTT 試劑盒測定細胞的增殖情況, 進而確定藥物的安全濃度。每種藥物設置5 個濃度梯度, 每個濃度設置3 個重復。根據藥物對細胞的毒性結果選取藥物進行體外藥效試驗: 將過濾后的藥物根據設置的藥物濃度與病毒液一起混勻后, 加入至事先準備好的含106個EPC 細胞的96 孔細胞板中, 放置在28 °C 的細胞培養箱中進行培養5 d,每天觀察細胞生長情況及形態變化, 后棄去培養液,用MTT 法測定OD490nm值, 計算細胞存活率。

細胞存活率(%)=(病毒組OD490nm值/空白對照組OD490nm)×100%. (1)

1.2.4 體內模型構建

1.2.4.1 體內模型構建條件的確定

(1) 溫度 根據蛙虹彩病毒病的流行病學調查情況及文獻發病資料, 本實驗設定溫度梯度為16、19、22、25、28 和31 °C。根據溫度設置5 個實驗組, 每組隨機放置10 尾大小約為20 g 的鱸魚,每組設置3 個重復。實驗在控溫養殖水槽中進行, 在不同溫度條件下適應性養殖2 周后, 進行攻毒實驗,攻毒劑量為每尾鱸魚腹腔注射 0.1 mL 109.33TCID50/mL 蛙虹彩病毒。注射后持續觀察2 周, 每天于早8:30、晚5:30 投喂普通飼料兩次, 每天進行觀察記錄, 計算死亡率。

(2) 魚體大小 考慮成本、體內實驗操作的方便性并結合發病情況, 本實驗共設置10、20、50 和100g 四個規格的魚體, 實驗共設置4 組, 每組隨機放置10 尾不同規格的鱸魚, 每組設置3 個重復。實驗在控溫養殖水槽中進行, 適應性養殖1 周后, 進行攻毒實驗, 攻毒劑量為每尾鱸魚腹腔注射0.1 mL 109.33TCID50/mL 蛙虹彩病毒。注射后持續觀察2 周, 每天于早8:30、晚5:30 投喂普通飼料兩次, 每天進行觀察記錄, 計算死亡率。

(3) 攻毒劑量 在前期預實驗結果的基礎上,設置 3 個攻毒劑量, 即以 1010.02、109.33、107.64TCID50/mL, 實驗魚大小為20 g 左右的規格, 養殖溫度為25 °C。實驗在控溫養殖水槽中進行, 適應性養殖1 周后, 進行攻毒實驗, 攻毒劑量為每尾鱸魚腹腔注射0.1 mL 不同濃度的蛙虹彩病毒。注射后持續觀察2 周, 每天于早8:30、晚5:30 投喂普通飼料兩次,每天進行觀察記錄, 計算死亡率。

1.2.5 抗蛙虹彩病毒中草藥的篩選 對于制備的中草藥利用體外和體內實驗進行篩選, 對篩選出的具有較好抗病毒藥效的中草藥進行體內實驗, 并進行組織病理學分析。

(1) 體外試驗 同1.2.2。

(2) 體內試驗 根據細胞毒性試驗結果, 選取紫花地丁等8 種中藥進行體內抗病毒藥物初篩試驗, 每種藥物設置2 個濃度組, 每組隨機放置20 尾大小為20 g 左右的鱸魚, 試驗溫度設定為25 °C, 試驗在溫度可控的循環養殖水槽內進行。各中藥組投喂0.06 g/kg 和0.6 g/kg 飼料的提取物, 病毒組和對照組投喂基礎飼料, 每天投喂2 次, 時間設定為上午9 點和下午16 點, 實驗魚經適應性養殖2 周后,投喂藥物3 d, 投喂3 d 后進行攻毒, 中藥組和病毒組試驗魚腹腔注射0.1 mL 109.33TCID50/mL 的蛙虹彩病毒, 對照組腹腔注射相同劑量的生理鹽水。攻毒后繼續投喂藥物, 并每天觀察并記錄實驗魚死亡情況, 連續觀察14 d, 統計死亡率, 計算藥物對實驗魚的保護率。

對經初篩獲得的具有較好抗病毒效果的2 種中藥黃連和紫花地丁進行體內藥效試驗, 試驗共設置黃連組、地丁組、病毒組和對照組, 黃連組和地丁組投喂0.3、0.6 和1.2 g/kg 飼料的提取物, 并按照上述的方法進行投喂和攻毒并 連續觀察14 d, 統計死亡率, 計算藥物對實驗魚的保護率。

(3) 體內病毒載量測定 從上一步驟的實驗魚中分別于攻毒后24、48、72 h 隨機取3 尾實驗魚的肝臟組織進行病毒載量的測定。體內病毒載量測定利用前期實驗室構建的熒光定量PCR 法進行測定。

(4) 組織病理學觀察 對各實驗組中未死亡的鱸魚進行組織病理學觀察, 確定藥物的藥理作用。分別取各實驗組的肝臟和腎臟組織, 用10%福爾馬林固定、石蠟包埋, 經過一系列的脫水處理, 蘇木精和伊紅染色(H&E), 進而在顯微鏡下觀察比較病理損傷情況。

2 結果

2.1 抗病毒藥效篩選模型的構建

2.1.1體外模型的構建 大口黑鱸蛙虹彩病毒病毒可在EPC 細胞上較好地生長, 且在接毒后可觀察到的明顯噬斑, 見圖1。同時, 使用藥物后病理變化顯著減少, 表明體外模型構建成功。

圖1 感染蛙虹彩病毒的EPC 細胞Fig.1 The EPC cells infected with LMBV

2.1.2體內模型的構建 不同溫度、不同個體大小的大口黑鱸對不同攻毒劑量蛙虹彩病毒的影響如圖2。由圖2 可知: 溫度和魚體大小均可顯著影響大口黑鱸的死亡率, 在本文的攻毒劑量范圍內, 只有當溫度高于22 °C 時方可引起大口黑鱸的死亡, 低于該溫度則不會引起鱸魚的死亡, 而25 °C 以上在5 d 內死亡率可達100%。同時, 當魚體大于100 g 時, 在試驗期內不會引起鱸魚死亡, 只有在10 g 和20 g 這兩種規格的實驗魚的死亡率可達100%。1010.02、109.33、107.64TCID50/mL 這3 個攻毒結果表明, 高濃度病毒第2 天即開始死亡, 且5 d 內死亡可達100%, 而中濃度攻毒劑量則在第3 天開始死亡, 至第8 天死亡率達100%, 而低濃度組至試驗結束死亡率一直維持在60%, 故而中濃度適合于藥效模型的構建。對用于藥物篩選的動物模型而言, 快捷、高效、低價和有效是最根本的, 因此綜合而言, 20 g 左右的實驗魚易于養殖、容易進行注射攻毒且價格相對低廉, 適合于藥效模型的構建。故而確定體內藥效模型的條件為: 25 °C,魚體大小20 g 左右, 攻毒劑量為腹腔注射0.1 mL 109.33TCID50/mL。

圖2 水溫、攻毒劑量、魚體大小等對攻毒死亡率的影響Fig.2 Effects of water temperature, challenge dose, and fish size on challenge mortality

2.1.3體內藥效篩選模型構建 根據上述條件的模式初步確定模型條件為: 水溫 25 °C, 體重大小20 g, 攻毒劑量為腹腔注射0.1 mL 109.33TCID50/mL。該條件下大口黑鱸從第3 天開始死亡, 至第8 天死亡率可達100%。病魚出現與自然感染大口黑鱸類似的癥狀: 肛門紅腫、鰭條基部出血、體表出血點狀出血,嚴重部位出現潰瘍癥狀。組織病理學觀察顯示: 感染病魚肝細胞高度腫脹, 部分細胞漿內可見大量圓形空泡; 腎小球肥大細胞核縮、碎裂, 嚴重空泡化, 胞漿呈絲網狀(圖3)。

圖3 攻毒后肝腎組織病理學變化Fig.3 Histopathological changes of liver and kidney after challenge

2.2 藥物篩選結果

2.2.1體外篩選 柴胡等29 種中草藥對EPC 細胞的安全性實驗結果如表2, 由表2 可知, 博落回等15種中草藥對EPC 細胞具有一定的毒性作用, 其濃度為1×10–2g/mL 時, 細胞存活率在65%以下, 而黃連、紫花地丁等藥物對EPC 細胞的毒性相對較低, 其濃度為1×10–1g/mL, 細胞的存活率在95%以上。

表2 不同中藥提取物對EPC 細胞存活率的影響Tab.2 Effects of different Chinese herbal extracts on survival rate of the EPC cell

因博落回等 15 種藥物對細胞的毒性較大, 因此我們選擇黃連、紫花地丁等14 種藥物毒性較低的進行抗病毒體外藥效評價, 體外抗病毒藥效結果如表3。由表3 可知, 黃連、紫花地丁等藥物具有較好的抗病毒作用, 體外抗病毒效果最好的是黃連, 其最高濃度細胞的存活率可達96.88%, 其次是敗醬草和紫花地丁, 其最高濃度的細胞的存活率仍可達96.36%和96.28% (表3)。

表3 不同中藥提取物的體外抗病毒藥效Tab.3 In vitro antiviral effects of different Chinese herbal extracts

2.2.2 體內抗病毒藥物初篩 對體外抗病毒效果較好的黃連等8 種中藥進行第一次體內抗病毒藥效評價, 其結果如圖4, 黃連、紫花地丁、板藍根、蒲公英和馬鱉草等藥物對大口黑鱸均具有一定的保護作用, 且存在一定的濃度依賴關系, 對照組在攻毒后第3 天即開始死亡, 至第8 天時死亡率為100%, 而黃連組和紫花地丁組在第5 天時才發生死亡, 而到第12天之后即不再發生死亡。當投喂濃度為0.6 g/kg 時,黃連和紫花地丁對大口黑鱸的最高保護率均達40%。

圖4 初篩藥物對大口黑鱸的保護率Fig.4 The protection rate of initial screening drugs against largemouth bass

2.2.3 黃連和紫花地丁抗病毒藥效評價 對初篩選中效果最好的黃連和紫花地丁, 以0.3、0.6 和1.2 g/kg 的劑量進行投喂, 其體內抗病毒藥效評價如圖5。由圖5 可知, 黃連和紫花地丁對大口黑鱸均具有一定的保護作用, 其濃度為0.6 g/kg 和1.2 g/kg 時,黃連和地丁的保護率最高均達到40%。

圖5 不同濃度黃連和紫花地丁對大口黑鱸的保護率Fig.5 The protection rates of C. chinensis and V. philippica at different concentrations to largemouth bass

2.2.4體內病毒含量測定 黃連組和紫花地丁組肝組織的病毒載量測定結果如圖6: 口服黃連和紫花地丁對蛙虹彩病毒具有顯著的抑制效果, 且存在著時間依賴關系, 同時, 黃連的抑制效果優于紫花地丁,黃連組最高抑制率可達70.5%, 而紫花地丁最高抑制率可達67.1%。

圖6 黃連和紫花地丁對蛙虹彩病毒的體內抑制作用Fig.6 In vivo inhibitory effect of C. chinensis and V. philippica on LMBV

2.2.5組織病理學觀察 通過肝臟和脾臟的組織病理學切片(圖7)可看出: 相對于空白對照的肝細胞,病毒對照組有小區片狀的肝細胞壞死(黃色箭頭)片狀細胞消失, 且有炎細胞浸潤(紅色箭頭)間質纖維組織增生和色素沉淀(黑色箭頭); 黃連組僅出現肝細胞輕度水腫和極少邊緣處點狀壞死; 紫花地丁組也僅有間質肝細胞輕度濁腫。同樣比較與于空白對照的脾細胞, 病毒對照組出現了大片的淋巴細胞減少, 未見明顯淋巴小結, 且有較多的炎癥細胞浸潤; 黃連組僅有間質炎癥細胞浸潤, 紫花地丁組細胞狀態與空白對照組一致。由此可看出兩組藥物均起到了對病毒的抑制作用。

圖7 紫花地丁和黃連用藥后的組織病理學觀察Fig.7 Histopathological assessment of largemouth bass after treated with V. philippica and C. chinensis

3 討論

大口黑鱸是我國的重要名優魚類, 在我國的水產養殖中占有重要的地位, 但近年來不斷暴發的病毒病給該產業造成了巨大的經濟損傷, 也成為了現在大口黑鱸養殖發展的一大瓶頸, 尤其是蛙虹彩病毒病給整個大口黑鱸的養殖產業帶來了巨大的經濟損傷。目前對該病防治的研究主要集中在檢測和疫苗研制方面, 但目前還未有生產文號的藥物可使用, 因此迫切需要有效的藥物, 本研究通過構建體外和體內藥物篩選模型, 從29 種中藥中篩選獲得黃連和紫花地丁這2 種對大口黑鱸蛙虹彩病毒具有一定效果的中草藥, 其體內保護率可達40%, 具有一定的開發前景。

病害的暴發與環境密切關聯, 溫度是影響病毒感染的重要影響因素和限制因子, 也是構建體內抗病毒藥效模型的重要因素。于新然(2019)對鯉皰疹病毒Ⅱ型致病性及其對異育銀鯽溫度敏感特性的研究表明, 當溫度低于10 °C 時, 即使感染也不發生死亡,而只有溫度高于20 °C 才會導致大規模的死亡。而鱖魚傳染性脾腎壞死病毒(ISKNV)的暴發同樣與溫度存在顯著的關聯, 其在20 °C 以下不發病, 而28～30 °C是其最佳發病溫度(曾慷等, 1999)。本研究結果顯示,蛙虹彩病毒在22 °C 以下幾乎不會造成死亡, 提示蛙虹彩病毒是一種高溫病毒病, 這與目前該病的流行病學調查結果是一致的, 同時結果也顯示在實際生產中尤其是在溫室苗種培育可通過降低溫度來提高育種的成功率。魚體大小對病毒感染也存在顯著的影響, 雷燕(2015)研究發現大口黑鱸彈狀病毒一般僅在鱸魚苗種時期會導致大量的死亡, 而對于成魚即使感染也不會導致死亡。本研究結果顯示魚體在100 g以上時不會造成魚體的死亡, 這與實際生產中有一定的差異性, 這可能是因為影響虹彩病毒對鱸魚致死的因素不僅僅是溫度, 還可能與其他環境條件、病毒毒力以及感染時間等均有一定的相關性, 但具體機制還需要進一步研究。本研究構建的體內藥效評價模型被證實可行、可靠的。

黃連又稱味連、川連等, 是毛茛科植物黃連、三角葉黃連或云連的干燥根莖, 它是我國一種常用的中草藥, 具有降血糖(王新征等, 2021)、抗糖尿病(鄭雨加等, 2021)、抗菌(蔣麗施等, 2021)、治療消化系統疾病(李海元等, 2020)、抗炎和抗病毒(馬國琴等, 2019)等方面的作用。本研究結果顯示黃連提取物具有較好的抗蛙虹彩病毒的作用, 這是首次研究黃連對水產動物病毒性疾病的藥效研究, 國內外研究表明黃連流感病毒、單純孢疹病毒等均具有一定的作用, 且黃連提取物黃連素通過對病毒RNA 聚合酶活性的抑制作用而達到抗病毒的治療作用(馬國琴等, 2019)。

紫花地丁又稱紫堇, 是堇萊科(Violaceae)植物紫花地丁的全草, 具有抗炎(李金艷等, 2008)、抑菌(李永生等, 2013)、清熱解毒、抗病毒和抗腫瘤(崔雪等,2020)等作用。其化學成分主要為黃酮、生物堿、香豆素、甾體類、酰胺類、萜類和環肽類等, 其中目前報道的從紫花地丁中分離出來的具有生物活性的單體物質主要有木犀草素、芹菜素、槲皮素、7,8-二甲氧基香豆素、咖啡酸以及奎寧酸等物質。目前對紫花地丁抗病毒作用的研究較多, 其主要對傳染性支氣管炎病毒、呼吸道合胞病毒、抗雞新城疫病毒、流行性感冒病毒、丙型肝炎病毒以及猴免疫缺陷病毒具有一定的作用, 其抗病毒的主要活性成分有木犀草素、cycloviolacin VY1 (環紫素VY1)等(崔雪等, 2020)。本研究初步確定了黃連和紫花地丁具有較好的抗蛙虹彩病毒的作用, 但其抗病毒主要活性成分還需要進一步研究, 這對于將來開發抗病毒先導化合物以及抗病毒藥物的合成均具有較好的意義。

4 結論

本實驗通過研究水溫及魚體大小等條件, 確定了大口黑鱸抗蛙虹彩病毒藥物篩選模型條件的水溫、魚體大小及攻毒劑量。結合體內和體外藥效篩選模型,篩選出紫花地丁和黃連這兩種對大口黑鱸蛙虹彩病毒具有較好作用的中藥。當兩者的添加量為0.6 g/kg時, 其保護率可達40%, 且用藥后對大口黑鱸肝組織病毒有著較高的抑制率。紫花地丁和黃連具有開發抗蛙虹彩病毒植物源藥物的潛力和前景, 有望在我國魚類產業健康養殖中起到重要作用。