污泥與菌渣協(xié)同消化對微生物的影響分析

鮑王波

(中國聯(lián)合工程有限公司，杭州 310052)

城鎮(zhèn)人口的高速增長導(dǎo)致污水排放量激增，市政污水處理廠數(shù)量迅速增加，產(chǎn)泥量也同步增長。據(jù)報道，我國2010-2017年間市政污泥年均增長率高達(dá)4.7%[1]。市政污泥中含有大量經(jīng)過馴化的微生物菌群，這為降解其他有毒有害物質(zhì)提供了有利條件。同時，我國也是抗生素特別是青霉素生產(chǎn)和出口大國，據(jù)統(tǒng)計，2009年中國抗生素生產(chǎn)量已達(dá)14.7萬噸，約占全世界生產(chǎn)量的70%，其中青霉素生產(chǎn)量占全球產(chǎn)量的75%以上[2]，而這也同時產(chǎn)生大量生產(chǎn)廢渣。眾所周知，污水處理廠二沉池污泥大多屬于微生物內(nèi)源呼吸的產(chǎn)物，有機質(zhì)含量低[3]，營養(yǎng)物質(zhì)匱乏，而青霉素菌渣中含大量未完全利用的糖類、蛋白質(zhì)、脂類等[4]。因此，本研究探索將二沉污泥與青霉素菌渣進行協(xié)同消化處置，可達(dá)到以廢治廢的效果，并對其微生物活動進行了跟蹤分析，以期為后續(xù)研究提供參考。

1 研究方法

1.1 青霉素殘留檢測

樣品1g于15 mL離心管中，加入提取液(超純水)5 mL，渦旋1～2 min充分混勻后，20℃超聲40 min，4℃下4 000 r/min離心15 min，上清液轉(zhuǎn)移到干凈的離心管中待凈化。

SPE凈化：由于提取液中含有一定量的雜質(zhì)，會影響色譜圖峰型和儀器使用壽命，故進樣前需凈化處理。Oasis HLB小柱預(yù)先用5 mL甲醇活化、5 mL超純水平衡，再將提取液以2～3 mL/min的流速通過小柱，5 mL 5%的甲醇水溶液淋洗小柱，2 mL乙腈+2 mL甲醇洗脫。洗脫液于40℃下N2吹干后，以超純水定容至1 mL，0.22 μm濾膜過濾，采用高效液相色譜儀檢測青霉素含量。

經(jīng)試驗探索優(yōu)化，最終確定青霉素色譜檢測條件：Thermo C18 1.7 μm 2.1×100 mm色譜柱，柱溫30 ℃，流速0.15 mL/min，進樣體積10 μL，PDA檢測器，流動相A為0.1%的甲酸水溶液，B為乙腈，比例：A:B=60:40。

1.2 微生物基因組的PCR-DGGE指紋分析

1.2.1 樣本總DNA提取及PCR擴增

樣品總DNA采用美國MP公司土壤DNA提取試劑盒(MP Biomedicals)提取，DNA濃度采用核酸定量儀(Thermo NanoDrop 1000 spectrophotometer)測定。

PCR使用V6-V8區(qū)通用引物，序列：U968-GC(5’- CGCCCGCCGCGCCCCGCGCC CGGCCCGCCGCCCCCGCCCCAACGCGAAGAACCTTAC-3’)；L1401(5’-CGGTGTGTACAAGACCC-3’)，配置50μl PCR體系：5μl 10×PCR buffer (Mg2+free)，4μl dNTP Mix，左右引物各1μl，3μl MgCl2，1.5μl taq酶，DNA模板4μl，ddH2O 34μl。

PCR程序：94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，65℃退火30s，72℃延伸30s，35個循環(huán)，最后72℃保持8min。PCR產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖膠進行電泳。

1.2.2 PCR產(chǎn)物的DGGE指紋分析

PCR擴增產(chǎn)物進行變形梯度凝膠電泳(DGGE)分析，DGGE使用8%的聚丙烯酰胺(37.5:1丙烯酰胺:甲叉雙丙烯酰胺)凝膠，變性范圍：30%～50%(100%的變性劑中含有7 mol/L的尿素和40%的去離子甲酰胺)，蠕動泵自動灌膠。每條泳道加反應(yīng)體系樣20μl，1×TAE電泳液，60℃，200V預(yù)跑10分鐘，隨后60V電泳17h，SYBR Green I(1:10000稀釋)染色30分鐘后于凝膠成像儀(Bio-Rad，美國)中掃描成像[5]。

1.2.3 DGGE條帶克隆測序分析

(1)DNA回收

對DGGE 指紋圖譜上的DNA條帶進行割膠回收，溶于20 μl滅菌的去離子水中，4℃靜置過夜。以上述膠水混合物為DNA模板再次進行PCR擴增，反應(yīng)體系：10×PCR緩沖液5μl，dNTP(25 mmol/L)4μl，V3可變區(qū)通用引物(不帶GC夾子)各0.5 μl，MgCl2(25 mmol/L) 3 μl，模板2 μl，TaqDNA聚合酶0.3 μl，dd H2O 36 μl，總體積50 μl。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30s，65℃退火30s，72℃延伸30s，72℃保持7 min，共循環(huán)35次，4℃保溫。

將50μl擴增到的PCR產(chǎn)物進行1.5% 的瓊脂糖凝膠電泳，使用Axygen公司的凝膠回收試劑盒割膠回收，產(chǎn)物加入20μl去離子水-20℃保存用于后續(xù)的酶連與轉(zhuǎn)化。

音樂，能夠喚起人內(nèi)心最真實的聲音，也是構(gòu)建情境教學(xué)法最有效的方法。在小學(xué)語文教學(xué)中，最注重的就是強化學(xué)生的讀寫能力。因為漢語是我國的母語，聽說能力肯定都具備了，關(guān)鍵在于“讀”和“寫”。而用音樂來創(chuàng)設(shè)情境，就能夠幫助學(xué)生很好地融入課本，在音樂的伴隨下，學(xué)生與課本內(nèi)容產(chǎn)生了共鳴。這樣，學(xué)生在“讀”的過程中才能調(diào)動自己的真實情感。如在進行《怒吼吧，黃河》一文的教學(xué)時，教師可以在閱讀的同時播放《黃河大合唱》這首歌，讓學(xué)生在感受音樂磅礴氣勢的同時，理解文章的真實情感，這大大提高了語文教學(xué)的課堂效率。

(2)酶接轉(zhuǎn)化

4 ℃條件下，滅菌管中加入酶接體系：DNA片段4.5 μl，PMD-19載體0.5 μl，SolutionI 5 μl，總體積10 μl，16℃保存4h。

將酶接體系(10 μl)加入到感受態(tài)細(xì)胞中(感受態(tài)細(xì)胞要一直處于冰盒中)，在冰盒中放置半小時，42℃水浴熱激90s后，冰上放置2 min，加入800 μl LB液體培養(yǎng)基，于37℃恒溫?fù)u床中孵育30～40 min。然后將其涂布在含青霉素(100 μg/ml)的LB固體培養(yǎng)基上，于37℃過夜培養(yǎng)。

(3)克隆子的培養(yǎng)與驗證

高溫滅菌的96孔板中加入含有青霉素(100 μg/ml)的液體LB培養(yǎng)基600 μl，挑取平板上生長良好的單菌落接種到培養(yǎng)基中，37℃過夜培養(yǎng)。

取上述培養(yǎng)所得菌液進行PCR擴增(10×PCR緩沖液2.5 μl，dNTP(25 mmol/L)2 μl，M13左右引物各0.5 μl，MgCl2(25 mmol/l) 1.5 μl，菌液0.3 μl，TaqDNA聚合酶0.25 μl，dd H2O 17 μl)PCR條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30s，65℃退火30s，72℃延伸30s，35個循環(huán)，72℃保持7 min，4℃保溫。PCR產(chǎn)物進行1.5%的瓊脂糖電泳驗證，根據(jù)電泳圖譜條帶位置選取酶接成功的克隆子進行DNA測序。

1.3 PCR-DGGE指紋圖譜數(shù)據(jù)分析

DGGE圖譜使用Quantity one軟件進行數(shù)據(jù)提取分析導(dǎo)出至Excel工作表中。Quantity one軟件自動提取條帶豐度數(shù)據(jù)及條帶數(shù)量S，由此計算多樣性香農(nóng)(Shannon)指數(shù)H及均勻度E，計算公式如下：

H=-ΣPi×lnPi[6]

E=Hmax/lnS[7]

其中，Pi=ni/N，ni為第i個條帶的豐度值，N為第i個條帶的泳道上所有條帶豐度之和，Hmax為所有H值中最大的值。采用Quantity one軟件對DGGE條帶進行聚類分析。

1.4 實驗設(shè)計

將青霉素菌渣(青霉素殘留量1.09±0.58 mg/kg)與市政污水處理廠二沉池剩余污泥按填埋質(zhì)量比0:1 (處理組1)、1:2(處理組2)、2:2(處理組3)的質(zhì)量比混合消化，并于0、3、7、20、60天時采集填埋樣品，檢測樣品中青霉素殘留，每個樣品3個平行；采用PCR-DGGE圖譜分析樣品微生物變化，每個樣品3個平行(重復(fù)實驗圖譜未列出)。

圖1 實驗裝置(A示意圖；B實物圖)

2 結(jié)果與討論

2.1 青霉素殘留檢測

結(jié)果表明(圖2)，樣品中殘留青霉素降解迅速，一方面是污泥中可能存在抗生素降解菌及其分泌的酶加速青霉素降解，另一方面消化過程體系溫度上升也促進青霉素的降解。

圖2 樣品中青霉素的殘留量檢測

2.2 樣品微生物多樣性分析

樣品微生物DGGE指紋圖譜見圖3，圖中共3個處理組，每組3個重復(fù)，1、2、3泳道代表第1處理組：m(菌渣)/m(污泥)=0:1；4、5、6泳道代表第2處理組：m(菌渣)/m(污泥)=1:2；7、8、9泳道代表第3處理組：m(菌渣)/m(污泥)=2:2。DGGE圖譜中的條帶編號分別代表切膠測序編號，結(jié)果未列出，下同。

DGGE指紋圖譜(圖3)顯示，第0天三個處理組條帶無明顯差異，聚類分析提示三個處理組相似度達(dá)82%以上，說明微生物群落結(jié)構(gòu)差異很小。第3天體系內(nèi)的微生物結(jié)構(gòu)與第0天相比發(fā)生明顯變化，0:1組微生物豐富度明顯降低，多數(shù)條帶強度微弱，可能是缺乏營養(yǎng)微生物大量死亡或休眠，而1:2和2:2組添加了菌渣營養(yǎng)物質(zhì)，都有各自的優(yōu)勢菌種，聚類分析表明，三組的相似度較低(僅46%)，但三個處理組均各自聚成一簇，這說明三個組的微生物結(jié)構(gòu)存在較大差異。第7天及第20天(與第7天基本相同，未列出)大體上持續(xù)第三天的情形，說明0:1組由于缺乏營養(yǎng)物質(zhì)微生物持續(xù)休眠，而1:2和2:2組少數(shù)能夠分解菌渣中營養(yǎng)物質(zhì)的菌群持續(xù)繁殖，保持較高活性。第60天時，各組微生物多樣性均得以恢復(fù)，說明微生物菌群經(jīng)過調(diào)整后逐漸變得豐富，但組間差仍然很大，聚類分析(圖4)表明三個處理組的組間相似度僅49%，明顯低于0天的82%，這說明雖然60天后，三個處理組的微生物豐富度有一定程度恢復(fù)，但相似度卻未增加。

圖4 樣品DGGE指紋圖譜聚類分析

2.3 樣品微生物多樣性分析

利用Quantity one軟件提取DGGE指紋圖譜數(shù)據(jù)并分析多樣性指數(shù)H及均勻度指數(shù)E，結(jié)果如圖5。結(jié)果表明，各組微生物多樣性及均勻度都呈現(xiàn)先下降后恢復(fù)趨勢，但添加了營養(yǎng)物質(zhì)菌渣的處理組微生物恢復(fù)較快，但60天后其2個指數(shù)均不能恢復(fù)至初期水平，這說明添加菌渣有利于體系中微生物快速恢復(fù)繁殖，但總體數(shù)量下降了。

圖5 樣品微生物多樣性指數(shù)H(左)及均勻度E(右)

2.4 基因測序分析

第0天的樣品條帶2測序結(jié)果與沙門氏菌(Salmonellaenterica)相似度99%，為腸細(xì)菌科(Enterobacteriaceae.)，分離自人或動物的腸道[8]；條帶3的測序結(jié)果與UnculturedChloroflexibacterium的相似度99%，Bj?rnsson L等[9]通過FISH探針法研究表明該菌在生物活性污泥中含量豐富，是廢水生物處理中重要微生物之一；條帶4(河氏菌屬，Hahellasp.，97%)、5(紅環(huán)菌屬，Rhodocyclaceaebacterium，99%)、8(紅長命菌屬，Rubrivivaxgelatinosusstrain，98%)則分別分離自海洋沉積物[10]、混合生物膜活性污泥[11]、湖泊沉積物[12]中。

第3天的樣品條帶3測序結(jié)果與厭氧繩菌屬(Anaerolineaceaebacterium)98%相似，根據(jù)Yamadat等研究表明[13]，其對青霉素敏感，故可推測其受到菌渣中殘留青霉素的抑制作用而在2、3處理組未發(fā)現(xiàn)。條帶5結(jié)果與埃氏巨型球菌(Megasphaeraelsdenii)99%相似，Marounek等[14]研究表明，埃氏巨型球菌以有機酸、氨基酸等有機物為底物，可耐受低濃度的青霉素，因此可以推測埃氏巨型球菌可能因缺乏易降解的營養(yǎng)物質(zhì)而未成為第1處理組的優(yōu)勢菌屬，又可能因高濃度青霉素抑制而未成為第3處理組的優(yōu)勢菌屬。條帶9測序結(jié)果與彎曲乳酸桿菌(Lactobacilluscurvatus)相似度99%，在第2、3處理組的強度高于第1處理組，Danielsen[15]、Mataragas等[16]研究發(fā)現(xiàn)Lactobacilluscurvatus可耐受較高濃度青霉素，說明菌渣中殘留的青霉素對其無明顯影響。另外，據(jù)報道，與條帶5、9相近的菌屬均為嚴(yán)格厭氧的化能有機異養(yǎng)型微生物，能夠降解多糖、果膠、蛋白質(zhì)等復(fù)雜的大分子聚合物，推測第3天時填埋處于厭氧反應(yīng)的水解、酸化階段。

第7天的樣品條帶4測序結(jié)果與梭菌屬(Clostridiumjejuense)97%相似，研究表明Clostridiumjejuense為嚴(yán)格異養(yǎng)厭氧菌，能利用葡萄糖、氨基酸等發(fā)酵產(chǎn)生甲酸、乙酸、CO2等[17]，說明該菌屬能加速菌渣中有機物的降解。條帶5與Sporanaerobacteracetigenes99%相似，研究表明Sporanaerobacteracetigenes[18]也是嚴(yán)格異養(yǎng)厭氧菌屬，可利用葡萄糖、氨基酸等小分子有機物為底物，發(fā)酵產(chǎn)生乙酸、H2、CO2等，故可推測第2處理組此時可能進入有機物厭氧降解的第二階段(產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸)階段。條帶7(消化鏈球菌屬Peptostreptococcusrussellii)、8(Peptostreptococcusanaerobius)在第3處理組強度最高，可利用葡萄糖等易降解有機物發(fā)酵產(chǎn)生醋酸、乳酸、甲酸等[19]，因此推測第3處理組也已進入產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸階段。填埋20天的測序比對結(jié)果與第7天基本相同，故不再贅述。

由于數(shù)據(jù)庫有限，第60天的樣品測序結(jié)果未發(fā)現(xiàn)比對結(jié)果，說明第60天時微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生較大變化。

3 結(jié)論

(1)利用二沉池污泥與抗生素菌渣協(xié)同消化有利于加速抗生素降解進程，減輕殘留物對環(huán)境的影響。

(2)PCR-DGGE指紋圖譜的微生物多樣性分析發(fā)現(xiàn)，在填埋不同時期，不同處理組的微生物菌落結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變。不同處理組的微生物多樣性演變都經(jīng)歷了從減少到恢復(fù)的過程，但群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了難以恢復(fù)的改變。

(3)測序分析表明，與不含菌渣的0:1處理組相比，菌渣與污泥混合填埋處理時，第3天發(fā)現(xiàn)與可將復(fù)雜大分子聚合物水解、酸化為單體或小分子聚合物的菌群Megasphaeraelsdenii、Lactobacilluscurvatus同源的DNA片段，第7天樣品中發(fā)現(xiàn)與可利用小分子有機物或單體發(fā)酵產(chǎn)生甲酸、乙酸、H2、CO2等小分子化合物的菌群Clostridiumjejuense、Sporanaerobacteracetigenes、Peptostreptococcusrussellii、Peptostreptococcusanaerobius同源的DNA片段。