精子tsRNA 參與跨代遺傳的研究進展

劉政麟 裴仕隆 韓 宇 陳周昊 審校 劉 悅 丁之德

1.上海交通大學醫學院2019 級臨床醫學八年制；2.上海交通大學醫學院 組織胚胎學與遺傳發育學系

tsRNA（tRNA-derived small RNAs）是近幾年受到高度關注的具有基因調節功能的一類非編碼小RNA，其來源于tRNA，且屬于tRNA 在生理或病理條件下切割后產生的新的小RNA。 早期有關tsRNAs 結構和功能的研究認為，tsRNAs 作為一種RNA 損傷后的降解產物，只是隨機的核苷酸序列，本身沒有與生理代謝過程相關的結構或功能特性； 同時， 由于這些small non-cpdomg RNA 片段數量太少，推測其對早期胚胎發育并不發揮重要作用。 然而， 近年來的研究表明，tsRNAs 并不是無意義的隨機片段， 而是由特定的酶識別特定的位點， 從而產生的具有特定結構和功能的非編碼小RNAs。 隨著研究的深入，tsRNAs 在細胞活動中的重要性逐漸被發現。 tsRNAs 對多種生理代謝過程具有調控功能，如在細胞增殖和凋亡、蛋白質翻譯調控、核糖體生物合成、免疫反應、精子RNA 介導的表觀遺傳等多種生理過程中發揮著關鍵作用。 本文主要綜述了tsRNA 的產生、修飾、參與精子介導的跨代遺傳等研究進展。

一、tsRNA 的來源與分類

（一）tsRNA 的來源

20 世紀70 年代末，tsRNA 被認為是tRNA 隨機降解的產物，并未引起足夠的重視。 隨著高通量測序技術的廣泛應用，人們在細菌、真菌、植物和哺乳動物中進一步研究并分析了tsRNA 的產生環境。 在tsRNA 產生過程中， 存在著多種復雜的處理程序，tRNAs 首先被RNA 聚合酶III 轉錄成前體tRNA 副本，隨后在RNase P和RNaze Z 的加工后產生tsRNA， 根據核酸內切酶切割的位置不同可以對tsRNA 進行分類， 此過程的副產物也可以作為單獨的tsRNA 參與細胞的生理活動[1-4]。

（二）tsRNA 分類

根據酶切割位點不同，tsRNA 大致可分為五類：

1.5’tsRNA，這是含量最豐富的一類tsRNA，來源于成熟tRNA 的5’端。 在正常條件下，由Dicer 或其他核酸內切酶切割tRNA D 環與反密碼子環之間的莖可產生5’tsRNA，而在低氧、高輻射、蛋白質缺乏、細菌病毒感染等應激狀態下，由angiogenin、RNY,Ro60-Associated Y1、RNase L 等切割tRNA 反密碼子環也可產生5’tsRNA。 5’tsRNA 通常包含tRNA 的第一個核苷酸，通常終止于tRNA 的反密碼子環。 不同來源的5’tsRNA 大小不同， 如human embryonic kidney cells 293 細胞、前列腺癌細胞和Halophage Archaea 的5’tsRNA 大小差異顯著。 5’tsRNA 大小一般在30-35 nt（核苷酸）之間，但也存在一些規模較小的部分，這些較小的5’tsRNA 進一步分為3 個亞組，18-20 nt 片段，25 nt 片段和27-30 nt 片段。 這些小RNA 的5’端和tRNA 的5’端高度相似，這表明3’端核酸內切酶的剪切位置決定了這些片段的大小[5-7]。

2.3’tsRNA。 3’tsRNA 來源于成熟的3’末端，其中常含有標志性的CCA 序列。 在正常與應激狀態下，TΨC 環以及反密碼子環和TΨC 環之間的莖可被Dicer 或其他核酸內切酶切割產生3’tsRNA, 可根據它們的大小分為3’tsRNA 或3’halves(35-45 nt)和較小的

tRF-3s(18-20 nt)[5-7]。

3.tRNA 前體的3’拖車序列。 RNase P 和RNase Z分別在成熟過程中處理細胞核中5’ 端前導序列和3’端尾部序列的前tRNA， 生成的30 個拖尾序列變成14-48 nt 長的tsRNA。 它們的5’末端在tRNA 基因組序列的3’末端之后開始，而它們的3’末端是由多尿苷尾部形成，即RNA pol III 終止信號。 雖然該類tsRNA 通常被認為是在細胞核中產生， 但亦有報道顯示， 這類tsRNA 中的tRNA-related fragment-1001 是由ElaC Ribonuclease Z 2 產生，ELAC2 是一種由前列腺癌易感基因編碼的tRNA 3’內切酶[8]。這一發現提示該類3’拖車序列(Trailer Sequence)可能起源于多條生物發生途徑。

4.第四類是tRNA 半體，這是一類在tRNA 的反密碼子環處切割產生，且大小為30-40 nt 的tsRNA，因它們幾乎是其前體tRNA 長度的一半，故稱為tRNA 半體（也被稱為tRNA halves）。tiRNA 可簡單分為兩類(即5’tiRNA 和3’tiRNA)。 5’tiRNA 的5’ 末端對應于前體tRNA 的5’末端，而3’末端位于前體tRNAs 的反密碼子環內。因此，3’tiRNA 的3’端與前體tRNA 的3’端的CCA 序列相匹配， 它們的5’ 端是反密碼子環的一部分。 參與tiRNA 生成的主要酶是血管生成素， 它是RNase A 超家族的成員。 在正常情況下，血管生成素定位于細胞核內，或與血管生成素抑制劑ribonuclease inhibitor 1 一起以非活性形式存在。 然而，在應激條件下，血管生成素從細胞核釋放或從RNH1 解離， 并在其反密碼子環處切割tRNA 以生成tiRNAs，但也有報道稱，在亞砷酸鹽處理的條件下， 加工tRF5-AlaCGC(tRNA半體)需要血管生成素和Disher 共同作用。

5.其他tsRNA，其來源于tRNA 或tRNA 前體其他區域的切割。 這些其他類型的tsRNA，也稱為I-TRF 或TRF-2， 包括其前體tRNA， 且含有反密碼子的內部區域；它們的長度可變。最后，還有一組tsRNA，其5’端對應于前tRNA 的前導序列5’端，而其3’端對應于反密碼子環的5’端外顯子。 目前這兩種類型的tsRNA 產生的詳細原理還未見[9]。

由上述可見，tsRNA 可通過核酸內切酶在tRNA 特定位點上的裂解生成，這些小RNA 不是簡單的降解產物， 并且不同類型的tsRNA 具有不同的生物學發生機制，并且也可能有不同的生物學作用。

二、tsRNA 研究技術

目前對tsRNA 的研究主要集中在其對某些疾病或生理現象的影響過程，通常包括tsRNA 的分離純化、定量測量、特異性地增加或減少。 如首先對不同狀態的組織進行tsRNA 的分離和純化， 以獲取特定的研究對象中所富集的tsRNA， 然后通過生物化學技術分析不同的tsRNA 成分， 篩選可能會對生理功能產生重要影響的tsRNA 種類。最后并對此進行驗證，并通過特異性地提高或降低tsRNA 的含量， 觀察細胞或組織所發生的變化而得出結論。 在這期間，為了得到高效且準確的研究結果，現主要的應用方法包括micro array，RNA-seq，Northern blotting，Cross-linking ligation and sequencing of hybrids(CLASH)等。

（一）Micro array 是一種高通量檢測tsRNA 表達的有效方法，其主要是通過制作特定基因芯片對目標tsRNA 進行含量方面的分析。其特點是擁有極高的特異性以及靈敏度。 Schena 等利用不同種屬的cDNA 與熒光探針雜交， 在鼠與酵母對照組中未發現擬南芥基因表達陽性情況[10]，以此來驗證該技術。 同時De Saizieu 等人證明其靈敏度強于Northern 雜交， 錯誤的重復率低于25%[11]， 但其在針對sncRNAs 測量方面存在對小RNA 覆蓋面不全這一不可忽視的問題。 Balatti V 等人通過將腫瘤樣本中總RNA 與特定的RNA 樣品進行雜交后確定了tsRNA 的表達與腫瘤中原癌基因表達的關系，進而發明了一種基于tsRNA 的診斷技術[12]。Farina NH等人在驗證四種tsRNA （ts-19，ts-29，ts-46 和ts-112）可能與抑癌基因RUNX Family Transcription Factor 1 的抑制性表達相關過程中也使用了類似的雜交原理[13]。

（二）RNA-sequencing 技術是micro array 技術的迭代產品，其將目標RNA 純化后反轉錄為cDNA 并進行測序。 技術的主要難點在于sncRNA 片段的選取以及基因組數據的完整性。 前者需要考慮tsRNA 片段大小范圍及該范圍內目標RNA 純度。 tRFs 首先在17-26nt小RNA 序列區段被發現[12]，但該非編碼RNA 大部分長度大于30nt。 至于后者，因無法確定其他未探明區段是否存在tsRNA，很可能造成假陰性結果，即產生大量未與已知基因組匹配的序列，其含量可能高達70%[13]。

（三）Northern blotting 是檢測tRF 和tiRNA 的一種重要方法。 將RNA 電泳分離后與相應被標記的探針雜交，通過信號反應顯示其含量。 該技術費用較低，操作簡便，但存在純度較低，易出現未知RNA 鏈污染的情況。 Kim HK 等人[4]在大鼠原位肝細胞癌模型中研究LeuCAG3′tsRNA 誘導快速分裂細胞凋亡的作用時采用了這一方法， 并最終驗證得到了一條較為清晰的分子作用機制通路。 由于tsRNA 在分子間相互作用關系中所處的獨特位置，可能會建立另一種轉錄后機制，同時，利用這一機制，可以在不同的生理狀態下微調基因表達，即為治療癌癥新的潛在性靶點。

需要指出的是， 在RNA 提取與含量分析實驗中，通常是多種檢測方式共同使用。Northern blot 常用于初期目標RNA 提取鑒定與目標tsRNA 片段長短定位，micro array 與RNA-seq 則主要應用于特異大小tsRNA表達情況的精準測量。

三、tsRNA 修飾調節

tsRNA 是經特定的酶在tRNA 特定的位置進行切割后產生，因此tsRNA 可以攜帶tRNA 的多種RNA 修飾。 這些RNA 修飾一方面可以增強或者抑制核酸內切酶的活性， 改變核酸內切酶切割tRNA 的效率[14]。Donovan J 等在人類細胞中證明了tRNA 反密碼子環第34 位G 到Q 的修飾可以介導RNaseL 對tsRNAHis第36 位的特異性切割[15]。 在其他物種細胞如大腸桿菌tRNATyr/Asn/His/Asp 反密碼子環擺動位置的queuosine(Q34)修飾能增加RNA 酶Colicin E5 的活性；在乳酸克魯維酵母中發現tRNAGlu（UUC）、tRNALys（UUU）和tRNAGln（UUG）第34 位的mcm2s2U 修飾對酵素在反密碼子環擺動位置的切割非常重要。另一方面，RNA 修飾也可以調節應激誘導的tsRNA 切割。 DNA（cytosine-5）-methyltransferase-like protein 2 和NOP2/Sun RNA Methyltransferase 2 介導的m5C 修飾， 能增加tRNA 的穩定性；Blanco S 等人證明了m5C 的缺失增加血管生成素介導的細胞內核酸內切酶對tRNA 的剪切能力，使得tRNA容易在反密碼處被切割而產生更多的tsRNA[16]。

tsRNA 在經過修飾后形成的特殊結構會存儲遺傳信息。 Safra M 等發現m1A 修飾缺失會導致tsRNA 內部不能正常形成堿基配對的結論基礎上， 進一步研究發現tsRNA 不能正常折疊成倒L 型結構， 而產生意外的二級結構，導致其無法正常發揮作用[17]。 這些特異位點的改變可能會引起tsRNA 對RNA 酶消化的抵抗性，并改變其生物學功能。

四、精子tsRNA 參與父系跨代遺傳

相較于含有大量RNAs 的卵母細胞， 由于精子中sncRNAs 數量太少， 早期不認為其在子代遺傳發育中產生重要作用。 近年來，該觀點已被修正即精子sncRNAs 在子代遺傳發育中的作用得到了初步的實驗論證。

Chen 等人[18]通過實驗證明父代受環境影響產生的獲得性性狀可以通過tsRNA 傳遞給子代。在實驗中，通過向5 周齡F0 雄性小鼠喂食高脂肪飲食（high-fat diet,60%脂肪） 構建父代飲食導致代謝紊亂的代際傳遞模型，同時向其他同期F0 雄性小鼠喂食正常飲食(normal diet,10%脂肪)構建對照組。 喂食六個月后，高脂肪飲食組小鼠展現出肥胖， 葡萄糖不耐受以及胰島素耐藥等體征， 而正常飲食組小鼠各項體征處于正常范疇。 隨后， 將HFD 組和ND 組小鼠精子頭部分別注射到正常卵母細胞中，在胚胎發育為個體后，均正常飲食。 HFD組子代在第7 周左右展現出葡萄糖耐受以及胰島素抵抗力受損等表象，在第15 周時該表象愈發明顯。 值得注意的是， 將HFD 組和ND 組精子RNA 提取純化后分別注射至正常小鼠受精卵中， 得到的子代在正常飲食條件下，HFD 組子代出現血糖耐受性受損的表象，但對胰島素的敏感性與ND 組子代相似。 該實驗結果表明其中存在一種之前未注意到的RNA 影響傳代遺傳過程。通過轉錄組測序（RNA-seq）技術比較兩個組子代RNA 發現，HFD 組子代相較于ND 組子代tsRNA 含量比例更高，miRNA 含量比例降低， 提示tsRNA 含量易受高脂肪飲食的影響。隨后，將兩組精子tsRNA 提純并注入正常小鼠受精卵實驗中，注入HFD 組tsRNA 的小鼠成功表達出胰島素耐藥的特征， 驗證發現主要為代謝相關基因的表達下調，但具體機制仍有待研究。

RNA 修飾會對精子中tsRNA 的濃度和表達譜的變化產生較大的影響[7]。目前可以確定tsRNA 確實在表觀遺傳中起到重要作用。 表觀遺傳的調控按照步驟大致分為兩個部分， 其一是父代將表觀遺傳信息儲存在精子中， 其二則是子代對于遺傳信息的提取過程，即tsRNA 如何通過生化反應途徑對子代的代謝過程產生影響[20]。tsRNA 在精子中的豐度和可能存在的特殊結構是父代將環境產生的變化通過tsRNA 進行表觀遺傳的主要方式。 Chen 等證明，高脂飲食能夠導致tsRNA 中的m5C、m2G 修飾的增加，也會影響tRNA 的穩定性，導致tsRNA 含量發生變化，從而介導表觀遺傳。 DNMT2是tsRNA 產生的重要酶之一，其發現過程也頗為曲折[21]，當科學家們終于意識到其作用位點位于RNA 而非DNA 之后[22]，才逐漸發現它的催化機制[23]。 而DNMT2敲除的小鼠不能將這種父代表型傳遞給子代， 相應的m5C、m2G 修飾也恢復到正常水平。 DNMT2 的缺失還可以改變精子小RNA 表達譜[16,17]。

tsRNA 也可介導F0 母本性狀傳遞給F2 子代個體。 研究中發現，高脂飲食誘導組（HFD 組）的F0 雌鼠與正常雄鼠產下的F1 代雄性小鼠，正常喂養后提取其精子總RNA 注入到受精卵中， 產生的F2 代小鼠相較于正常飲食喂養組（control diet 組）F0 代雌鼠產生的F2代小鼠總體以及內臟脂肪含量更高， 同時在胰島素耐受實驗中也會展現出更高的血糖水平。 在高通量測量后發現，HFD 暴露組的F1 代雄鼠精子tsRNA 含量相較于CTR 組更高。 因此，HFD 暴露組的F0 代雌鼠與體現出胰島素耐受、肥胖代謝綜合征的F2 代小鼠之間的相關性以及與正常飲食組精子tsRNA 含量之間的比較，均表明“tsRNA 可以作為載體，促進了性狀的跨代遺傳”這一結論[19]。

五、精子tsRNA 對早期胚胎的調控

研究發現，tsRNA 除了在體內多種生理代謝過程具有重要的作用外， 其對于子代早期胚胎發育過程有關鍵的調控作用，而對這方面的進一步探究，有助于更加全面、深入地了解精子RNA 介導的表觀遺傳信息在父代與子代之間的傳遞。

2016 年，Chen 等[18]通過對雄性小鼠進行高熱量飲食誘導，發現其子代相關基因表達明顯異常，證明精子tsRNAs 的確對早期胚胎的發育過程起到了重要的作用。 2018 年，Luo 等[24]的研究發現，果蠅體內tsRNAs 可通過互補序列配對識別目標mRNA， 優先識別并結合核糖體蛋白(ribosomal proteins)和核糖體翻譯啟動或延伸因子(IEFs)mRNA，進行AGO2 蛋白依賴性的抑制調控，從而抑制靶基因的翻譯。 同時，該研究還發現，在serum starvation 條件下的果蠅體內的5’tsRNA 而不是3’tsRNA 顯著增加，導致RPs 和IEFs 的翻譯合成降低[24]。2017 年，Schorn等[25]的研究發現，在模仿表觀遺傳重編程的GC-2spd, 小鼠精母細胞系和胚胎干細胞（embryonic stem cells）細胞中檢測到了豐富的sRNA，其與LTR- 逆轉錄轉座子或內源性逆轉錄病毒(Endogenous Retrovius)互補，可以干擾轉座子發生轉移，而這些sRNA 大部分來自tRNA，具有3’端CCA 核苷酸。 另一方面，該研究還發現，來源于tRNA3’端、長度為18nt 的tsRNAs 可以與ERV 共同競爭ERV 引物的結合位點(Primer Binding Site)， 如在LTR-逆轉錄轉座子復制期間，PBS 與tRNA 結合， 且高度富集于兩個最活躍的小鼠轉座子家族inhibitor of apoptosis protein 和ETn，從而對ERV 逆轉錄起到特異性的抑制作用，同時也可以對反轉座子遷移進行特異性地抑制[25]； 而來源于tRNA3’端、長度為22nt 的tsRNAs 則可以通過轉錄后sRNA 介導的沉默來抑制ERVs 的表達，但長度為18nt 的3’tsRNA 則對轉錄或蛋白水平沒有影響[25]。 Conine 等提取附睪頭部和尾部的精子并將其通過Intracytoplasmic sperm injectrtion（ICSI）分別注入至正常小鼠卵母細胞。 此項針對受精卵與胚胎的研究發現，在附睪頭部精子含少量tsRNA 存在的情況下， 受精卵內部分調控因子過量表達，胚胎植入率和成活率低下。 同時，當精子在附睪經過一系列代謝調節后， 附睪尾部精子tsRNA含量比例增加， 所得到的受精卵與胚胎可正常進行生理代謝，植入率和存活率均達到正常標準。 隨后，在驗證實驗中， 將tsRNA 純化后的提取物注入到上述缺陷細胞中，各項生理指標又得到一定程度的改善。 由此判斷tsRNA 在胚胎正常發育中也不可缺少[26]。

六、小結與展望

現有的研究發現可介導跨代遺傳的非編碼小RNA—tsRNA。 父代通過對RNA 以及剪切后的tsRNA進行特異性修飾， 完成精子介導的父代與子代之間的表觀遺傳信息傳遞。 在胚胎的早期發育過程中， 由于tsRNA 對轉座子轉移的抑制以及對核糖體合成的促進， 可對細胞分裂、 早期分化以及凋亡產生重要的影響。 然而，tsRNA 介導的表觀遺傳具體的分子機制仍有待于進一步深入研究。