鎘誘導的雄性生殖毒性及其拮抗藥物*

鄭婷婷 吳雋宸 孟思含 陳揮昂 王曉琛 劉 強

上海交通大學醫學院（上海 200025）；上海市生殖醫學重點實驗室（上海 200025）

隨著當今社會城市化和工業化進程的加快， 鎘已經成為一種普遍存在的有毒重金屬和環境污染物。 自然和人為活動可導致土壤鎘污染，使得大米、蔬菜以及包括煙草在內的植物鎘蓄積嚴重。 人類由于接觸鎘污染環境、 長期吸煙或攝入被鎘污染的食物導致鎘在體內蓄積。 大量研究證實，鎘進入機體后可導致肝、腎損傷[1]，對生殖系統也有影響。 鎘在人體內的半衰期很長，為20～30年；而排泄率很低，每天小于1～2 μg，因此鎘難以從體內排泄，容易在肝臟、腎臟和睪丸積累。 近年來調查發現， 相對其它部位， 人類生殖系統對鎘更加敏感：鎘會對睪丸等組織結構造成損傷，并降低男性精液質量，包括精子存活率、前向運動力等，導致男性生殖能力下降甚至不育[2]。 因此，對鎘的生殖毒性及其拮抗藥物的研究具有重要臨床意義。

一、鎘暴露

現有的研究普遍認為哺乳動物生殖系統對鎘暴露環境敏感， 且易受到影響。 鎘能誘導細胞內活性氧（reactive oxygen species,ROS）生成并下調內源性抗氧化劑水平，從而導致氧化應激，使睪丸細胞發育和功能異常[2]。 研究表明，鎘暴露會誘導生精上皮的空泡形成和損傷以及睪丸支持細胞結構的異常變化。 在破壞支持細胞功能后，鎘會破壞血睪屏障，增加生精小管通透性并阻礙精子發生[3]。 鎘暴露還阻礙睪丸間質細胞的發育，抑制間質細胞的功能，同時會誘導睪丸間質細胞脫氧核糖核酸（DNA）損傷和凋亡，并下調其類固醇生成相關基因的表達， 從而導致睪酮分泌減少，干擾生殖細胞的發育和功能。 最終，鎘會導致精子形態異常和精子活力降低[4]。 然而，研究發現，長期低濃度的鎘暴露不會引起睪丸組織學改變、精子數量減少和生育力低下， 也不會導致大鼠睪丸血睪屏障的改變，表明低濃度鎘可能不表現出生殖毒性[5]。 因此對于鎘生殖毒性機制的研究至關重要，能夠幫助我們深入了解不同劑量的鎘暴露情況對雄性生殖系統和精子的影響，并為其進一步治療提供方向。

二、鎘誘導雄性生殖毒性的機制

鎘誘導雄性生殖毒性的機制主要包括誘導睪丸細胞的氧化應激狀態和凋亡以及干擾內分泌， 進而引起睪酮等類固醇合成改變， 對睪丸組織和精子產生直接影響，以及對睪丸細胞骨架的破壞。

（一）氧化應激

睪丸細胞含有大量不飽和脂肪酸， 因此極易受到ROS 的影響[6]。 鎘本身雖然不能產生自由基，但是能通過各種反應產物間接導致氧化應激[7]。 鎘誘導的氧化應激可能通過以下幾種機制發生。

首先，通過分子模擬機制，鎘可以取代細胞必需的金屬離子，如Ca2+或Zn2+，并參與關鍵的生理過程，從而干擾絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）、c-Jun 氨基末端激酶（JNK）、RAS 等信號通路。 被取代的金屬離子又通過Fenton 反應誘導產生過量的ROS，攻擊亞細胞結構，甚至DNA，最終導致細胞凋亡、壞死或異常增殖[8]。

其次， 鎘可以結合到抗氧化酶活性部位內的巰基上，使其錯誤折疊，從而降低體內各種抗氧化酶和抗氧化劑的濃度，最終導致機體抗氧化能力降低[6，9]。 體內的酶和非酶抗氧化系統包括超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）、過氧化氫酶（catalase, CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase,GPx）和還原性谷胱甘肽（glutathione,GSH），它們可以清除氧自由基并保護細胞免受氧化損傷。 SOD 催化氧自由基歧化生成過氧化氫，再由CAT 轉化為水和氧氣。 GPx 是一種廣泛存在于機體內的重要過氧化物酶，能催化GSH 轉化為氧化型谷胱甘肽（glutathione oxidized, GSSG），將有毒的過氧化物還原為無毒的羥基化合物， 在體內清除自由基，促進過氧化氫分解，從而保護細胞膜結構不被氧化物質損傷。 因此，當鎘降低這些酶的濃度時，機體將無法充分清除過量的ROS， 從而導致細胞氧化/ 抗氧化平衡失調[10]。

此外， 鎘還可以通過調節核因子E2 相關因子2（Nrf2）來影響睪丸細胞的氧化應激狀態。 Nrf2 是一種重要的轉錄因子， 通過結合II 相抗氧化酶基因 （如NQO1、HO1、γGCS 和GPx）的抗氧化反應元件（antioxidant response element,ARE）調控這些基因表達，維持氧化還原穩態，有利于細胞存活。Nrf2/ARE 信號通路是一條重要的抗氧化通路，廣泛分布于睪丸和全身的細胞。外源性鎘可以通過抑制Nrf2 及其調節基因的表達水平來抑制睪丸細胞的固有抗氧化能力， 從而誘導氧化應激[11]。

（二）細胞凋亡

鎘誘導的氧化應激與生精細胞等多種細胞的凋亡有關。 鎘通過線粒體途徑增加促凋亡蛋白B 細胞淋巴瘤-2 相關X 蛋白（Bax）、半胱氨酸蛋白酶-3（caspase-3）、細胞色素C（Cyt-c）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的表達，同時降低抗凋亡蛋白B 淋巴細胞瘤-2（Bcl-2）的表達，誘導睪丸生精細胞凋亡[9]。 同時，鎘誘導使得蛋白激酶B的磷酸化被抑制，促進凋亡蛋白Bcl-2 細胞死亡拮抗因子（BAD）去磷酸化，去磷酸化的BAD 與Bcl-2 形成異二聚體并取代Bax，促進細胞凋亡[12]。

近年來研究發現， 破壞細胞自噬也是鎘誘導睪丸損傷的機制之一。 鎘可以增加溶酶體膜通透性和干擾鈣依賴性自噬體- 溶酶體融合，從而破壞自噬，誘導細胞凋亡[13]。

（三）內分泌毒性

鎘具有抑制內分泌的作用， 會干擾下丘腦-垂體-性腺軸（HPG 軸）。 HPG 軸以負反饋的方式調節促性腺激素和雄激素的釋放[14]。下丘腦間歇性釋放促性腺激素釋放激素， 刺激垂體以相同的時間間隔釋放促卵泡生成激素（follicle stimulating hormone, FSH）和促黃體生成素（luteinizing hormone,LH），然后支持細胞合成、分泌抑制素B 和雄激素結合蛋白， 睪丸間質細胞合成和分泌睪酮，為精子發生提供微環境[15]。 而鎘可以在神經內分泌組織中累積，通過影響HPG 軸進而阻礙睪酮的生成。

（四）睪丸間質細胞毒性

鎘可直接作用于睪丸間質細胞， 使類固醇生成受損，使睪丸和血清的睪酮濃度降低。 睪酮調節整個精子發生過程，作為一種“生存因子”保護生精細胞免于凋亡，維持正常的組織結構[6]。

第一步：整頓隊伍。由中隊長集合隊伍，下練兵口令，要求動令簡潔，短促，清晰；聲音洪亮，字正腔圓，保證口令清晰傳達；練兵人員按照口令，迅速、準確的行動。

睪酮的合成是一個復雜的過程， 其中涉及多種蛋白質：類固醇急性調節蛋白（steroidogenic acute regulatory protein,StAR）將膽固醇從細胞質運輸到線粒體，然后細胞色素P450 膽固醇側鏈裂解酶（P450scc）將膽固醇分解為孕烯醇酮；孕烯醇酮被輸送到滑面內質網，在羥類固醇脫氫酶3βHSD 和17βHSD 等酶的級聯作用下合成睪酮[16]。 此外，固醇類生成因子1（SF1）在成人睪丸的間質細胞中高表達， 它能調節類固醇生成基因和性腺的功能[17]。 鎘處理導致睪丸SF1、StAR 和P450scc的mRNA 表 達 水 平 以 及StAR、P450scc、3βHSD 和17βHSD 的蛋白表達水平顯著降低， 從而抑制睪酮生成[16-17]。

另外，電壓依賴性陰離子通道（VDAC2）是啟動類固醇生成的關鍵調節因子。 VDAC2 位于線粒體外膜，參與多種離子依賴性過程， 包括激素釋放和抗凋亡途徑，并與精子獲能和頂體反應有關。 StAR 在轉移到線粒體基質之前與VDAC2 相互作用。 鎘通過下調VDAC2 基因的表達和激活JNK、P53 途徑，減少膽固醇從細胞質運輸到線粒體，從而抑制睪酮合成，最終導致精子功能障礙[18]。

（五）睪丸組織與精子毒性

作為ATP 結合盒式蛋白外排轉運體家族的一員，多藥耐藥蛋白1b（Mdr1b）促進精子發生過程中產生的毒素通過血睪屏障排泄。核轉錄因子Y-α（Nfya）是一種進化上高度保守的轉錄因子，協助Mdr1b 啟動子激活。鎘通過減少Nfya 在Mdr1b 核心啟動子區域的CCAAT盒中的募集來抑制Mdr1b 轉錄， 并通過與精子發生相關的級聯途徑和信號傳導，抑制毒素外排，對睪丸組織與精子產生毒性[19]。

鎘能夠嚴重損害生精小管和間質， 其形式包括血管充血和出血，上皮細胞內形成空泡，管腔內上皮細胞脫落，生精小管上皮細胞紊亂，多核巨細胞產生，部分生精小管壞死等。 鎘中毒大鼠體內生精上皮細胞持續變性，形成多核巨細胞，是對損傷的非特異性反應[12]。

鎘還以劑量和時間依賴性的方式干擾精子特異性Ca2+通道的功能，顯著降低精子的活力、頂體反應和受精能力[20]。

（六）細胞骨架

細胞骨架的正確組織和動力學行為是細胞活動的基礎，這依賴于細胞骨架相關蛋白的調控。 形態發生紊亂關聯激活因子1（DAAM1）屬于formin 家族，調節未分支肌動蛋白絲的成核；脯氨酰內肽酶（PREP）是一種絲氨酸蛋白酶，也與微管有關。 DAAM1 和PREP 在精子發育成熟期間密切參與生精細胞形態的變化， 維持肌動蛋白和微管組織的內部環境穩定， 而鎘暴露會誘導這些蛋白質表達受損，導致細胞骨架動力學改變，進而引起睪丸組織的改變，如生精上皮細胞脫落等[6]。

三、拮抗鎘生殖毒性的藥物

（一）天然抗氧化劑

氧化損傷是鎘致睪丸功能障礙的主要分子機制。因此， 各種具有抗氧化潛力的天然化合物被廣泛用于改善鎘誘導的雄性生殖毒性。近年來的實驗表明，28 天的鎘暴露會導致睪丸鎘累積、 組織病變和精子參數變化， 包括異常精子率升高、 精子數減少和精子活力下降。 相比之下，維生素E 治療顯著減少了鎘的累積，減輕了組織病變和睪丸功能障礙， 并有效緩解大鼠睪丸的氧化應激； 其實質是維生素E 通過上調Nrf2 途徑，保護睪丸免受亞慢性鎘暴露引起的氧化損傷[21]。另一項研究表明，維生素E 緩解了氯化鎘對睪丸中鈉鉀泵、鈣泵等離子泵的毒性作用， 從而提高了睪丸結構和功能的完整性[22]。目前臨床上對于特發性弱精子癥在常規中醫治療基礎上給予維生素E 聯合復方氨基酸膠囊治療， 能夠明顯改善患者的臨床癥狀， 減少精子畸形比例，明顯增強精子活力和強度，增加精子濃度，提高受孕比例[23]。

阿魏酸具有很強的抗氧化活性， 可以減輕睪丸組織中鎘的累積所產生效應， 并通過調節血清睪酮、FSH和LH 的水平來恢復精子發生。 同時，阿魏酸還激活了Nrf2 信號通路，使鎘誘導的氧化/抗氧化平衡失調恢復正常[24]。 矢車菊素-3-O-葡萄糖苷（C3G）在自然界中廣泛存在，且已被證明具有顯著的抗氧化活性。 研究者發現，它可以阻止精子DNA 的氧化損傷，減輕睪丸的氧化應激， 并通過MAPK 信號通路顯著抑制鎘誘導的精子細胞的線粒體凋亡途徑[15]。 此外，C3G 還可以作用于下丘腦，通過調節雄性青春期小鼠的HPG 軸，減輕鎘誘導的性激素分泌障礙[25]。蔬食埃塔棕果油含有高濃度的不飽和脂肪酸，具有抗氧化性，可使生精上皮損傷減少，血清睪酮濃度升高，睪丸中錳和鋅濃度恢復，SOD和CAT 酶活性增加[26]。綠茶具有抗氧化作用，其提取物可以抵抗氯化鎘產生的氧自由基的作用。 綠茶處理后的大鼠的生精小管直徑，睪丸生發層厚度，精原細胞、睪丸支持細胞和間質細胞的數量均顯著增加，精子數、精子運動性和睪酮水平也顯著提高， 證明了綠茶對鎘毒性的拮抗作用[27]。 除以上物質外，姜黃素[28-29]、咖啡酸苯乙酯[30]、葡萄籽原花青素[12]、槲皮素[31-33]、柚皮素[10]、菲油果提取物[34]、萊菔硫烷[35]等均具有顯著的抗氧化作用，它們能夠恢復血清睪酮水平和抗氧化酶的活性，降低丙二醛水平，減少生殖細胞和間質細胞的凋亡，明顯改善鎘誘導的精子數量、運動性和畸形率的變化，因而對鎘的生殖毒性起拮抗作用。

（二）藥用植物

藥用植物的發現、使用和栽培歷史悠久。辣木葉乙醇提取物可使氯化鎘處理后大鼠生殖器官重量恢復，精子數量和精子運動性提高，異常精子率、睪酮和丙二醛水平下降[36]。 黃精源于百合科植物的干燥根莖，是一種被廣泛使用的中草藥。 用黃精水提取物處理后的小鼠睪丸重量增加，精子存活率提高，異常精子率降低，睪酮水平升高， 受損的睪丸組織恢復，ROS 水平降低，睪丸細胞凋亡受到抑制。進一步研究表明，黃精水提取物可以通過硫氧還蛋白互作蛋白 （TXNIP）/ 核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3（NLRP3）/caspase-1 信號通路調節氧化應激， 通過Cyt-C/caspase-9/caspase-3 通路抑制細胞凋亡，從而保護小鼠睪丸免受鎘的損傷[37]。漢黃芩素是傳統中草藥黃芩的有效成分之一。 研究表明， 漢黃芩素處理可顯著改善鎘誘導的大鼠睪丸和附睪重量下降、精子數量和質量的降低、類固醇生成基因表達下降和血清睪酮水平降低。此外，漢黃芩素治療對鎘誘導的睪丸氧化應激也有顯著的作用， 抑制了鎘引起的炎癥反應和細胞凋亡[38]。葛根素是從葛根中提取的一種異黃酮。 鎘暴露降低了大鼠睪丸中乳酸的產生，而葛根素處理可激活AMP 活化蛋白激酶（AMPK）/ 沉默信息調節因子1（SIRT1）信號通路，恢復乳酸的產生，拮抗鎘對大鼠睪丸的毒性[39]。

（三）微量元素

鋅是生物體內重要的微量元素，具有催化、調節和參與大分子構成等生理功能[40]。一項研究發現鋅與男性生殖功能聯系緊密：在吸煙者中，精漿鋅濃度與精子數量、運動力呈顯著正相關，而血清鋅濃度則與異常形態的精子數量呈負相關[41]。 另一項研究發現，在使用氯化鋅治療鎘暴露的雄性大鼠21 天后， 大鼠睪丸重量恢復，睪丸氧化應激水平顯著降低，精液質量顯著提高[42]。綜合目前研究， 鋅拮抗鎘生殖毒性的機制可以總結為以下3 點：（1）維持機體抗氧化防御系統[43-44]；（2）抑制鋅轉運蛋白ZIP8（SLC39A8）介導的鎘轉運[45-46]；（3）誘導金屬硫蛋白合成，降低睪丸鎘濃度[47]。

作為人體必需的微量元素和重要的營養成分，硒以抗氧化的方式保護男性生殖系統。 硒蛋白家族中的谷胱甘肽過氧化物酶、 硫氧還蛋白還原酶是硒應對氧化損傷的主要形式[48]。研究表明硒可以減少鎘在組織中的累積， 并通過過氧化物酶體增殖物激活受體-γ（PPAR-γ）/磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B 途徑抑制鎘誘導的細胞凋亡[49]。鎘暴露的雄性小鼠腹腔注射硒30 天后， 小鼠睪丸抗氧化物水平升高，DNA 損傷減少，表明硒通過恢復組織抗氧化能力減輕DNA 的氧化損傷，從而削弱鎘對睪丸組織的毒性作用[49]。 另一項研究發現， 不同形式的硒對生殖系統的保護效果存在差異。 該研究中鎘暴露的睪丸重量減小并嚴重充血，生精小管縮窄，生精上皮變薄。 使用納米硒或亞硒酸鈉治療后睪丸充血部分緩解，而酵母硒可使充血顯著緩解。此外，納米硒和酵母硒都能顯著緩解生精小管的損傷，但亞硒酸鈉對生精小管的保護作用并不明顯[51]。

目前臨床會使用中藥搭配鋅、 硒劑治療男性不育癥，對提高精子質量有較好的作用，而且無明顯毒副作用[52]。

（四）其它

西格列汀（sitagliptin）可以抑制二肽基肽酶-4，減少腸促胰素的降解從而降低血糖， 將其單獨或與其他藥物聯合使用可治療Ⅱ型糖尿病。 Arab 等人發現給雄性大鼠用氯化鎘灌胃4 周后， 睪丸組織細胞自噬小體降解受阻，而西格列汀治療后自噬相關的AMPK/ 雷帕霉素靶蛋白（mTOR）途徑活化，細胞凋亡減少，表明西格列汀通過促進細胞自噬、減少凋亡來減輕睪丸損傷[13]。研究發現由松果體分泌的褪黑激素參與調節動物生殖活動[53]。 鎘中毒的雄性大鼠接受褪黑激素治療后，睪丸氧化應激顯著緩解，組織結構和功能恢復。 值得注意的是， 鎘會導致生精細胞中細胞骨架相關蛋白DAAM1和PREP 表達量下降， 而褪黑激素治療顯著改善了DAAM1 和PREP 的表達水平[6]，表明褪黑激素可能通過維持細胞骨架蛋白的功能保護睪丸免受鎘毒性的損傷。 谷氨酰胺是人體含量最豐富的非必需氨基酸，也是谷胱甘肽的合成原料之一。 研究發現，經谷氨酰胺治療的鎘暴露大鼠睪丸組織形態恢復正常，葡萄糖-6- 磷酸脫氫酶活性升高，抗氧化能力顯著提高[54]。 帚狀海翅藻是一種富含鋅、鐵、銅和錳等微量元素的藻類，具有較強的抗氧化能力。 研究發現帚狀海翅藻可以顯著改善精子運動力， 恢復血清睪酮水平[55]。 英夫利昔單抗是TNF-α 抑制劑，用于治療各種炎癥性疾病。 已知TNF-α可以誘導ROS 的產生[56]。 研究發現受鎘毒性損傷的大鼠睪丸組織中TNF-α 水平顯著升高， 脂質過氧化程度加重。 腹腔注射英夫利昔單抗治療3 周后，大鼠睪丸組織TNF-α 水平顯著下降，炎細胞浸潤減少，睪丸組織結構恢復， 表明英夫利昔單抗對鎘造成的睪丸損傷有明顯的緩解作用[57]。

四、總結與展望

綜上所述，鎘是環境中普遍存在的有毒重金屬、環境污染物，并通過食物、水、空氣和粉塵等經消化道和呼吸道進入人體，影響人的生殖系統。 鎘會通過誘導氧化應激狀態、 睪丸組織細胞凋亡和類固醇生成改變等多種機制導致雄性生殖毒性。

目前，許多拮抗鎘生殖毒性的藥物被陸續發現，例如維生素E、阿魏酸、矢車菊素-3-O- 葡萄糖苷等天然抗氧化劑，辣木葉、黃芩等藥用植物以及鋅、硒等微量元素。 臨床上會通過補充鋅和硒來提高精子質量，維生素E 目前已廣泛投入臨床使用， 能夠很大程度改善精子質量，提高受孕比例；但西格列汀、褪黑激素、帚狀海翅藻和英夫利昔單抗等其它藥物仍處于研究階段，尚未用于臨床。

隨著工業化進程加快， 人類生活環境受到的挑戰日益嚴峻， 鎘對男性生殖健康產生的后果也正在逐步加重。 生活中一方面我們要對鎘污染嚴加控制，從源頭上阻斷其對人體的傷害； 另一方面我們可以從藥物預防和治療入手， 目前研究已發現多個拮抗鎘雄性生殖毒性的藥物，但臨床上投入使用的仍乏善可陳，不僅是因為藥物臨床試驗的缺乏， 更是由于我們尚不完全了解其具體作用機制。 因此對于鎘影響雄性生殖系統的機制研究以及拮抗藥物的研究有待深入進行， 以期完善臨床上針對鎘暴露的預防和治療方案。