循環腫瘤細胞的鑒定分析方法研究現狀及進展

馬 瑩 綜述，寧大為，于華杰，王振丹，李 勝，夏 梅，李 浩△ 審較

1.山東省藥物研究院，山東濟南 250062；2.山東第一醫科大學附屬腫瘤醫院/山東省腫瘤防治研究院/山東省腫瘤醫院肝膽外科，山東濟南 250117；3.山東第一醫科大學/山東省醫學科學院，山東濟南 250117；4.山東省濟南市章丘區人民醫院急診外科，山東濟南 250200

惡性腫瘤的復發及轉移是世界范圍內惡性腫瘤患者病死率升高的重要原因[1-2]。近期研究表明，循環腫瘤細胞(CTC)可能是惡性腫瘤侵襲、轉移的重要原因之一[3]，因CTC具有稀有性、異質性等特點，對鑒定分析造成困難。針對以上問題，本文對CTC的鑒定分析方法及應用現狀及進展進行綜述。

1 CTC的生物學特性

CTC是指自發或因診療操作從原發或轉移腫瘤中脫落進入外周血液循環的一類腫瘤細胞[3]。1869年ASWORTH[4]在轉移性惡性腫瘤患者的外周靜脈血涂片中發現了大小、外觀與腫瘤細胞完全相同的細胞，首次提出了CTC的概念。研究發現，在轉移性惡性腫瘤患者中，進入血液的大部分CTC短期內被吞噬或發生凋亡，存活的CTC在血液中經過一段時間的潛伏，侵入組織中形成可檢測到的病變[5-8]。極少數具有高活性和轉移性的CTC相互聚集，形成循環腫瘤微栓子(CTM)，從而具有更強的侵襲和抗吞噬能力[9]。CTC的稀有性和其本身的異質性，對CTC的檢測提出了挑戰性。

2 CTC的檢測方法

由于外周血中CTC水平較低，其檢測過程可分為對外周靜脈血中CTC的分離富集和鑒定分析。富集是利用腫瘤細胞的生物、物理特性分離CTC與血細胞，以提高其檢測靈敏度，其中無需特殊標志物的富集方法包括膜濾過分離腫瘤細胞技術(ISET)、密度梯度離心技術和介電泳技術等[10]。依據生物親和原理的富集方法，還包括基于細胞表面腫瘤標志物上皮細胞黏附分子(EpCAM)和細胞角蛋白(CK)表達的免疫磁性陽性篩選法和陰性篩選法等[11]。但是因富集方法不同，富集后的CTC中?；祀s著白細胞、單核細胞，甚至循環內皮細胞，需要進一步鑒別區分。CTC的鑒定分析是利用腫瘤細胞的形態學特征或表面抗原、遺傳物質等對CTC進行區分和研究。

3 基于細胞病理學原理鑒定分析CTC

CTC從腫瘤原發灶或轉移灶脫落進入循環系統，與原發腫瘤細胞在形態學上相似，與正常血細胞在形態學上有所差異。通過細胞化學染色方法，依據細胞病理學原理，由光鏡下的細胞形態學判定異常細胞。光鏡下判別的參考項目主要包括細胞或細胞核直徑、核質比、細胞核性狀與染色情況等[12-13]。VONA等[14]利用ISET對外周血中摻入的腫瘤細胞株(HepG2、Hep3B、MCF-7、HeLa和LNCaP)進行分離鑒別，在濾膜上觀察到了與所用腫瘤細胞株相似的細胞。LU等[15]使用8 μm孔徑濾膜對61例食管鱗狀細胞癌患者及22例健康志愿者的外周血進行富集，依據細胞病理學標準對采集到的細胞進行分析發現，食管鱗狀細胞癌患者CTC檢出率為32.8%(20/61)，而健康志愿者外周血中未發現CTC。

但HOFMAN等[16]利用ISET研究了良性腫瘤患者、惡性腫瘤患者和健康志愿者外周血中的CTC，依據細胞病理學標準判別分離得到細胞的良惡性，發現具有惡性特征的細胞在良性腫瘤患者和惡性腫瘤患者中分別占5.3%和43.1%。而NANOU等[17]通過掃描電鏡發現前列腺癌細胞株在使用孔徑為5 μm的濾膜過濾時，由于壓力、濾孔數目和分布密度等原因可能受到損傷，導致相應的細胞表面特征丟失，甚至核的形狀發生改變，診斷出的假陽性結果使細胞病理學標準在CTC檢測中的應用仍需進一步研究。

4 基于分子特征鑒定分析CTC

4.1基于遺傳物質鑒定分析CTC

4.1.1通過基因表達及突變鑒定分析CTC 熒光原位雜交 (FISH)能夠定位染色體上特殊DNA序列，或探測、定位RNA，可在基因組水平上檢測CTC中單個基因的變化[10]。ZHAO等[18]通過FISH技術將CTC分為3個亞組：上皮標志物(CK、EpCAM)陽性，CD45-細胞(上皮性CTC)；上皮表型/間充質標記陽性，CD45-細胞(混合表型CTC)；間充質標志物(Twist、Vimentin)陽性，CD45-細胞(間質性CTC)。有學者對具有特殊分子改變的腫瘤患者進行了研究，PAILLER等[19]采用FISH技術檢測了39例以克唑替尼作為間變性淋巴瘤激酶(ALK)抑制劑治療ALK重排非小細胞肺癌(NSCLC)患者，發現ALK拷貝數增加的CTC，CTC數量的變化可能是克唑替尼在ALK重排NSCLC患者療效的預測性生物標志物。

反轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)可檢測血液標本中是否存在CTC，用于PCR檢測的核酸片段主要來自于上皮或特異性表達組織，因此能夠降低白細胞對檢測結果的影響[20]。盡管RT-PCR檢測靈敏度高，但由于異常轉錄和假陽性，特異度可能較低，這限制了RT-PCR用于CTC的鑒定。

4.1.2通過染色體畸變鑒定分析CTC 人類染色體異常包括染色體數目畸變、結構異常，幾乎所有腫瘤患者都出現染色體異常[21]。研究人員試圖通過鑒別染色體異常細胞從而區分CTC與其他細胞。XU等[22]分析發現胰腺癌患者外周血中，三倍體(8號染色體)CTCs≥3組的1年生存率和總生存率比三倍體CTCs<3組短，三倍體CTC計數而不是總CTC計數可以作為化療敏感性的預測因子。研究還發現惡性腫瘤患者血液中分離的CTC中多個染色體可能以多倍體形式存在，SWENNENHUIS等[23]用FISH探針標記了前列腺癌的1號、7號、8號和17號染色體著絲粒區域，發現以上染色體均存在多倍體現象。KIM等[24]通過基于細胞大小的過濾平臺，采用FISH技術檢測外周血標本中細胞染色體的異常拷貝數，在肺癌患者和良性肺病患者外周血中均檢測到非整倍體細胞，這些發現揭示了在使用FISH進行惡性腫瘤診斷時出現假陽性的可能性。

4.1.3通過測序技術鑒定分析CTC 測序技術通過堿基序列信息獲取特定基因組或該基因組中的目標區域的堿基，是分析惡性腫瘤特定基因組畸變的有力工具[25]。與其他技術相比，可以發現導致顯著的表型改變的微小遺傳突變，實現分析自動化，降低人工偏倚[26]。CAPPELLETTI等[27]通過下一代測序技術，發現在轉移性腎癌患者外周血中CTC存在異質性，部分CTC含有9p21.3缺失，證明CTC的分子特征能夠預測可能與腫瘤進展相關的亞克隆事件。LEE等[28]通過下一代測序技術，對婦科腫瘤患者無細胞循環DNA(cfDNA)和循環腫瘤DNA(ctDNA)的變異進行比較，認為聯合檢測腫瘤患者cfDNA和CTC可提高液體活檢診斷惡性腫瘤的靈敏度，這有望為指導惡性腫瘤的臨床治療策略提供更好的遺傳靶點信息。測序技術也有幾個明顯的缺點，例如測序成本、通量、深度、靈敏度及標本要求等方面的局限，使單細胞分析具有一定難度。

4.1.4通過微陣列技術鑒定分析CTC 基因表達譜和微陣列比較基因組雜交(aCGH)技術已被用來檢測CTC表達情況，基因表達譜能在RNA水平上提供有關標本的信息，特別是可疑和新轉錄物的上/下調節，而aCGH能在DNA水平上提供有關標本的信息，包括拷貝數變化、特定突變變體或全局基因組變化[29]。STEINERT等[30]通過aCGH、突變譜和微衛星檢測技術(MSI)，證實了結直腸癌來源的單個CTC的腫瘤細胞特性，CTC的突變譜與相應的腫瘤組織相似，但不完全相同，一些CTC在關鍵基因如KRAS或TP53上出現了在原發腫瘤灶中無法檢測到的突變。

4.2基于免疫學方法鑒定分析CTC 該類方法通過細胞表面抗原的表達情況，利用免疫組化或免疫熒光技術，研究不同標志物在細胞表面的表達情況，如鑒別CTC和白細胞，對富集的CTC進行定量、定性分析。強生開發的CellSearch系統采用的檢測方法曾經是公認比較可靠的方法，利用CK8/18/19、4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)、CD45標志物組合對富集標本進行檢測，將CK8/18/19陽性、DAPI陽性、CD45陰性的細胞定義為上皮類型CTC[31]。LI等[32]通過對富集CTC進行E-Cadherin、Vimentin和Twist的三聯免疫熒光染色，46例CTC陽性患者中有32例(69.6%)共表達Twist和Vimentin，與門靜脈癌栓、TNM分級及腫瘤大小密切相關。部分研究人員引入了腫瘤相關抗原來鑒定分析富集到的細胞。BERGMANN等[33]使用CellSearch系統對49例晚期潰瘍性結腸炎(UC)的血液標本進行分析，發現16例CTC陽性患者中有10例(63%)表達PD-L1，患者體內和不同患者間CTC的PD-L1表達具有異質性，PD-L1表達的CTC與較差整體生存率相關。目前沒有特異性的標志物可徹底區分CTC與其他細胞，不同類別的組織表達的標志物可能不同，甚至相同類別的組織也可表達異質的標志物，腫瘤標志物在某些情況下的表達會升高[34]。因此，通過免疫學方法檢測特定標記物得到的結果不一定是CTC。

5 細胞病理學結合免疫學方法鑒定分析CTC

外周血中可能存在著數量稀少的單核細胞、巨核細胞及因炎癥等因素進入血液的內皮細胞，甚至正常的上皮細胞，這些細胞有時很難通過細胞病理學標準進行判斷。例如有研究者在乳腺癌和黑色素瘤患者中發現一些非常大的非典型細胞(>30 μm)具有多葉核，但血小板標記CD61的ICC染色證實了它們是巨核細胞[35]。因此，研究者在細胞化學染色與細胞病理學識別的基礎上，聯合了免疫組織化學法或免疫熒光法對結果進行驗證[36-37]。常用的方法是對難以通過形態特征判別的異常細胞，通過上皮細胞相關抗原(EpCAM、CK等)和白細胞特異性抗原CD45進行驗證。TSUTSUYAMA等[38]利用巴氏染色(Pap)法結合免疫細胞化學(ICC)法對CTC進行細胞學診斷，將CTC定義為CK陽性且具有惡性形態學特征的非典型細胞，單獨或結合Pap染色進行CD34(內皮細胞)、CD61(巨核細胞)、CD68(巨噬細胞)及CD45(白細胞)的ICC以供確認。隨著科技手段的進步，未來或許能夠將細胞病理學鑒定方法與遺傳學鑒定方法聯合應用，進一步明確鑒定CTC結果。

6 其他檢測鑒定CTC的方法

惡性腫瘤在轉移過程中，除使惡性腫瘤細胞進入血液參與循環系統外，會有部分惡性腫瘤細胞進入體液(尿液、胸腔積液等)，通過對該部分進行檢測，可以為腫瘤的轉移提供輔助診斷。尿液標本CTC檢測未見相關報告，有研究選取10例肺癌患者胸腔積液標本，利用糖酵解及單細胞測序技術檢測到存在惡性腫瘤細胞，建立了胸腔積液檢測CTC技術體系[39]。另有研究者選取50例肺腺癌患者，采集外周血、胸腔積液及腦脊液進行檢測，探究糖代謝用于CTC檢測的可行性，發現己糖激酶-2(HK2)是檢測CTC的代謝功能相關標記物，用于NSCLC可能在治療前確定患者的預后[40]。

7 展 望

美國癌癥聯合委員會(AJCC)在《AJCC腫瘤分期手冊(第7.8版)》中強調了CTC作為腫瘤cM0(i+)的重要意義，證明CTC的鑒定分析可為乳腺癌、前列腺癌、結直腸癌、肝癌等實體腫瘤的療效評價和預后評估提供實時監測信息。但是目前大多數的鑒定方法區分的是具有某些分子特征特定細胞群，嚴格意義上并不能稱為CTC。組織病理學是腫瘤診斷的金標準，細胞化學染色聯合免疫學方法通過細胞病理學形態標準初步識別富集細胞的良惡性，進一步結合細胞表面抗原區分CTC、脫落上皮細胞和血液細胞，能夠最大程度降低檢測結果的假陽性和假陰性。對CTC形態學鑒定的標準化及深入研究，以及對CTC的形式分析有助于揭示CTC與循環中血細胞、免疫細胞的相互作用，闡明CTC免疫逃逸和轉移播散的機制，有利于推動CTC鑒定領域的極大發展。