二甲雙胍聯合飲食干預對高脂飲食肥胖大鼠膝骨關節炎的影響

陳行堯 項佳 魯琛

骨關節炎（osteoarthritis，OA）是致殘率高的慢性骨關節病。目前對骨關節炎的確切病因仍不清楚，其主要的相關致病因素有：年齡，肥胖，創傷，關節負重改變，感染，基因突變等［1］。隨著人口老齡化及肥胖癥患者人數逐年增多，肥胖和老齡化成為了OA發生發展主要的致病因素［2］。二甲雙胍臨床應用60余年，是全球應用最廣泛的口服降糖藥之一，其具有良好的單藥/聯合治療降血糖作用。最近研究表明，二甲雙胍具有抗OA作用，主要表現為保護軟骨基質的降解、抑制軟骨細胞的肥大分化、保持軟骨細胞的正常生理功能、阻止軟骨下骨的硬化及重塑［3］。并且，現代研究發現飲食干預可以調節膝關節的代謝及其炎癥，從而起到改善膝關節骨關節炎癥狀的作用［4］。目前，研究表明二甲雙胍和飲食干預都分別對OA具有一定的緩解作用，但兩者聯合干預對OA的影響未見報道。因此，本研究結合高脂高糖及Hulth法建立大鼠OA模型，并通過二甲雙胍聯合飲食干預探討對肥胖型OA大鼠氧化應激及炎癥因子分泌的影響，揭示二甲雙胍聯合飲食干預對肥胖型OA的輔助治療作用，以期為臨床護理OA患者提供一定的治療方向。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 低溫高速離心機來自Thermo公司；電泳儀電泳槽，轉膜儀，化學發光儀均來自天能公司；全自動脫水機，石蠟切片機，烤片臺，水浴缸，加熱石蠟包埋系統，正置熒光顯微鏡均來自Leica公司。BCA蛋白定量試劑盒（批號：KGP903），化學發光檢測試劑，預染蛋白marker均來自Solarbio公司；蘇木素染液來自MDL公司；伊紅染液來自珠海貝索生物技術有限公司。二甲雙胍（貨號B1970）購自美國APExBIO公司。水合氯醛（批號：MB4202）購自大連美侖生物技術有限公司。

1.2 實驗動物 72只5周齡清潔級雄性SD大鼠，體質量（170~180）g，購買于上海斯萊克實驗動物有限責任公司，實驗動物許可證號：［SCXK（滬）2017-0005］。保持溫度（22±2）℃，濕度50%~60%，在12 h晝夜節律的環境下自由飲水與進食，由浙江中醫藥大學實驗動物中心飼養，實驗方案經浙江中醫藥大學倫理委員會批準，批準號為 20210205。

1.3 實驗方法 （1）動物分組及給藥：72只SD大鼠隨機選取分為6組：健康組、OA模型組、肥胖模型組、肥胖OA模型組、飲食干預組、飲食干預+二甲雙胍組，每組12只。除健康組及肥胖模型組外，其余各組采用改良Hulth法建立膝骨關節炎大鼠模型，大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉（2 mL /kg），于大鼠左髕骨上方正中做一切口，切除內側半月板及內側副韌帶。術后連續3 d予青霉素20萬單位肌內注射以預防感染。術后1周，健康組及OA模型組給予常規飼料，肥胖模型組及肥胖OA模型組飼以高脂飼料（10%蛋黃、10%蔗糖、10%豬油、0.5%膽固醇）與糖水（10%蔗糖）；飲食干預組飼脫脂飼料與自來水；飲食干預+二甲雙胍組飼脫脂飼料與自來水的同時，給予二甲雙胍2 mg/kg灌胃，均連續干預3月。（2）一般生理學觀察：每天早晚觀察各組大鼠精神狀態、行為活動狀態、毛發狀態。每日觀察各大鼠飲食飲水及排泄等情況。（3）大鼠的體質量及BMI值的測定：飲食干預3個月后，稱重并量取體長，計算體質量指數（BMI），BMI=體質量/身高的平方（kg/m2）。（4）大鼠自主活動，抓力及疼痛閥值的測定：飲食干預結束后，應用大鼠自主活動程序儀測定大鼠的自發活動并計數，當計算機進入測定程序后，將大鼠放入箱中自由活動，每個活動箱中1只，由計算機自動記錄大鼠的活動情況。實驗時，把每只大鼠依次放入活動箱內，3 min適應期后，記錄每只大鼠5 min內的活動次數；抓力測定則是在飲食干預及聯合二甲雙胍干預結束后用抓力測定儀對老鼠進行抓力測試，多次測量，并記錄最大值。飲食干預3個月后，進行大鼠疼痛閥值水平測量，使用Electric Von Frey電子測痛儀，大鼠足掌心部放置探頭，然后緩慢加壓至出現縮足或抬腿，為疼痛閾值表現。每只重復測量3次，每次間隔15 min，3次測量結果的平均值作為疼痛閾值。（5）ELISA法檢測大鼠關節液中炎癥因子的含量：各組大鼠以10%水合氯醛0.3 mL/100 g麻醉后，注射器吸取膝關節關節液，用PBS按1∶9的比例稀釋后，2,000 r/min離心10 min，取上清液，-20℃保存待測。TNF-α、IL-1β、IL-6、MCP-1、SOD、MDA、GSHPx表達水平檢測，嚴格按照試劑盒操作說明進行，最后在酶標儀上檢測并分析其含量。（6）肥胖型OA大鼠TC、TG、LDL-C、HDL-C的含量測定：心臟采血后，使用3,500 r/min，離心機離心15 min后，分離出上層血清，保存待檢。用全自動血生化儀對血樣的血生化指標（TC、TG、HDL-C、LDL-C）進行分析。采用酶聯免疫吸附試驗檢測Aggrecan、Collagan II水平。（7）HE法觀察肥胖型OA大鼠膝關節病理的改變：10%多聚甲醛固定膝關節標本48 h，20% EDTA脫鈣4周。常規石蠟包埋、切片。石蠟切片60℃烤箱20 min，二甲苯 I、II、III各5 min，無水乙醇，95%、85%、75%乙醇各 3 min，水洗，蘇木素2 min，水洗，鹽酸乙醇分化5 s，水洗，1%氨水返藍30 s，伊紅2 min，水洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。切片于光學顯微鏡下進行觀察。（8）WB法檢測肥胖OA大鼠膝關節中Nrf2、HO-1、NF-κB p65、IκBα蛋白表達：膝關節組織混合裂解液放入預冷的玻璃勻漿器中進行研磨，提取膝關節總蛋白，并采用BCA法檢測蛋白濃度。取樣本蛋白30 μg于十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳中分離，隨后轉至聚偏二氟乙烯膜上。10%脫脂奶粉封閉，隨后加入一抗Nrf2（1∶1,000）、HO-1（1∶2,000）、NF-κB p65（1∶1,000）、IκBα（1∶2,000）和β-actin（1∶10,000）稀釋液，4℃條件下過夜孵育，TBST洗膜后，加入二抗（1∶5,000）室溫孵育1 h后。ECL化學發光顯色、拍照，并進行蛋白條帶灰度檢測。

1.4 統計學方法 采用SPSS 16.0統計軟件。計量資料多組間用One-way-ANOAY單因素方差分析，組間比較采用LSD或SNK分析。方差不齊者采用Kruskal-Wallis H檢驗。所有數據以（）表示，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠一般生理狀態 健康組大鼠生長良好，精力旺盛，活動頻繁，毛發順滑有光澤。肥胖OA模型組大鼠精神萎靡，活動減少，毛發蓬松無光；飲食干預組和飲食干預+二甲雙胍組較肥胖OA模型組，活動有一定程度的增加。

2.2 飲食干預聯合二甲雙胍對肥胖型OA大鼠體質量及BMI的影響 各組大鼠體長并無顯著區別，肥胖模型組大鼠體質量相較于健康組有顯著增加（P＜0.01）。飲食干預組，飲食干預+二甲雙胍組大鼠與肥胖OA模型組比，體質量和BMI值均顯著下降（P＜0.05）。見圖1。

圖1 各組大鼠的體質量，體長及BMI指數

2.3 飲食干預聯合二甲雙胍對肥胖型OA大鼠自主活動，抓力，疼痛閾值的影響 與健康組大鼠相比，OA模型組，肥胖模型組及肥胖OA模型組大鼠的自主活動次數，疼痛閥值和抓力均顯著下降（P＜0.05）。與肥胖OA模型組大鼠相比，飲食干預組和飲食干預+二甲雙胍組的自主活動次數，抓力和疼痛閥值有顯著上升（P＜0.01），其中飲食干預+二甲雙胍組的上升趨勢更為突出。見圖2。

圖2 各組大鼠自主活動次數，抓力及疼痛閥值的比較

2.4 飲食干預聯合二甲雙胍對肥胖型OA大鼠脂代謝和Aggrecan、Collagan II水平的影響 與健康組大鼠相比，OA模型組大鼠TC、TG、LDL-C、HDL-C的含量無顯著變化，Aggrecan、Collagan II水平則顯著下降（P＜0.01），肥胖模型組的TC、TG、LDL-C含量顯著上升（P＜0.01），HDL-C 含量顯著下降（P＜0.01），Aggrecan、Collagan II水平無明顯變化，肥胖OA模型組大鼠的TC、TG、LDL-C含量顯著上升（P＜0.01），HDL-C含量顯著下降（P＜0.01），Aggrecan、Collagan II水平也顯著下降（P＜0.01）。與肥胖OA模型組大鼠相比，飲食干預組，和飲食干預+二甲雙胍組的TC、TG、LDL-C含量顯著下降（P＜0.05），HDL-C 含量顯著上升（P＜0.01），Aggrecan、Collagan II水平顯著上升（P＜0.05）。見圖 3。

圖3 大鼠血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C、Aggrecan及Collagan II的含量水平

2.5 飲食干預聯合二甲雙胍對肥胖型OA大鼠關節液TNF-α，IL-1β，IL-6，MCP-1含量水平的影響 與健康組大鼠相比較，OA模型組，肥胖模型組，肥胖OA模型組大鼠膝關節中的TNF-α，IL-1β，IL-6，MCP-1含量均有顯著升高（P＜0.01）；與肥胖OA模型組大鼠相比，飲食干預組，飲食干預+二甲雙胍組膝關節中TNF-α，IL-1β，IL-6，MCP-1的含量則均有明顯下降（P＜0.01）。見圖 4。

圖4 大鼠膝關節液中TNF-α，IL-1β，IL-6，MCP-1的含量

2.6 飲食干預聯合二甲雙胍對肥胖型OA大鼠膝關節液的SOD，MDA，GSH-Px含量水平的影響 與健康組相比較，OA模型組，肥胖模型組，肥胖OA模型組大鼠膝關節中的SOD，GSH-Px含量顯著下降（P＜0.01），MDA則顯著上升（P＜0.01）；與肥胖OA模型組大鼠相較，飲食干預組，飲食干預組+二甲雙胍組的大鼠膝關節中的大鼠膝關節中的SOD，GSH-Px含量顯著上升（P＜0.01），MDA 則顯著下降（P＜0.01）。見圖 5。

圖5 大鼠膝關節液中SOD，MDA，GSH-Px的含量

2.7 飲食干預聯合二甲雙胍對肥胖型OA大鼠膝關節病理的影響 健康組大鼠膝關節軟骨細胞形態正常，排列緊密，軟骨層厚度適宜，無軟骨脫失現象，骨小梁結構與形態緊密正常。與健康組相比，OA模型組大鼠膝關節軟骨表面明顯缺損，軟骨基質降解、軟骨細胞丟失，蛋白聚糖降解，呈現典型OA退變。與OA模型組比較，肥胖模型組有輕微變化，肥胖OA模型組缺損最嚴重；與肥胖OA模型組比較，飲食干預組和飲食干預+二甲雙胍組有所緩解，飲食干預+二甲雙胍組比飲食干預組緩解更多。見圖6。

圖6 飲食干預聯合二甲雙胍對肥胖型OA大鼠膝關節病理的影響（HE染色×100）

2.8 飲食干預聯合二甲雙胍對肥胖型OA大鼠膝關節蛋白表達水平影響 與OA模型組相比，健康組膝關節組織中Nrf2、HO-1與IκBα蛋白的表達水平顯著上升（P＜0.05），NF-κB p65蛋白的表達水平顯著下降（P＜0.05），肥胖模型組膝關節組織中Nrf2、HO-1與IκBα蛋白的表達水平顯著下降（P＜0.05），NF-κB p65蛋白的表達水平無顯著變化（P＞0.05）；肥胖OA模型組膝關節組織中Nrf2、HO-1與IκBα蛋白的表達水平顯著下降（P＜0.05），NF-κB p65蛋白的表達水平顯著上升（P＜0.05）。與肥胖OA模型組相比，飲食干預組與飲食干預+二甲雙胍組Nrf2、HO-1與IκBα蛋白的表達水平顯著上升（P＜0.05），NF-κB p65蛋白的表達水平顯著下降（P＜0.05）。見圖7。

圖7 大鼠膝關節中Nrf2、HO-1、NF-κB p65、IκBα蛋白表達水平的比較

3 討論

OA是致殘率較高的慢性骨關節病，其中以膝骨關節炎（kneeosteoarthritis，KOA）的發病率最高。KOA是一種以關節軟骨基質崩解、減少、骨贅形成、滑膜無菌性炎癥為特征的關節退行性疾病，其病變涉及整個滑膜關節，包括軟骨、滑膜和軟骨下骨［5］。流行病學調查表明，體質量指數與KOA的發生發展具有顯著關系，同時，肥胖相關檢測指標如血甘油三酯（triglyceride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、低密度脂蛋白膽固醇（low density liptein cholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（high density liptein cholesterol，HDL-C）可作為觀測KOA的重要指標［6］。此外，研究表明炎性因子在KOA的疼痛發生過程中被認為是重要影響因素。TNF-α、IL-1β、IL-6是目前研究最為成熟的三種促炎細胞因子，其中IL-1β在骨關節炎發生發展過程中處于核心地位，進一步促進滑膜炎癥發展，滑膜壁增生，從而促進KOA的進展。TNF-α與IL-1β具有相似的生物學作用，并且在KOA的發病中與IL-1β起著協同作用［7-8］。再者，NF-κB是與炎癥因子產生、細胞增殖、細胞外基質交聯和細胞凋亡密切相關的轉錄因子，參與多種炎癥的信號轉導［9］。同時，炎癥經常伴隨著大量自由基的產生，自由基與不飽和脂肪酸相互作用后產生的脂質過氧化物 MDA會使細胞膜流動性降低、通透性增加，膜功能受損［10］。SOD和GSH-Px則是人體內維持氧化還原平衡的一類重要的酶，其能夠有效地抵抗氧化作用，防御氧化應激損傷。Nrf2則可以調節抗氧化劑蛋白的表達，從而防止因炎癥引起的氧化損傷，當有氧化應激因素存在時，Nrf2的表達增加，在氧化應激因素消除后，Nrf2表達逐漸恢復。有效降低OA炎癥因子的含量并減少氧化應激損傷，可改善KOA的發展［11］。二甲雙胍作為安全，有效的口服降糖藥之一，因具有良好的降糖效果及其減輕體質量和其他心血管危險因素的特點，成為眾多糖尿病指南推薦的T2DM一線治療藥物［12］。隨著更多臨床應用數據的獲得，表明二甲雙胍具有廣泛的藥理作用，如調血脂、治療多囊卵巢綜合征和非酒精性脂肪肝等［13］。現代研究發現，二甲雙胍除了可以抑制膽固醇的生物合成和貯存，從而降低TG、TC水平［14］，還對OA具有雙重保護作用。OA早期，二甲雙胍能延緩軟骨細胞老化。OA晚期，二甲雙胍能促進軟骨細胞自噬，避免OA病程的進展［15］。

本研究結果表明，飲食干預及飲食干預聯合二甲雙胍可顯著降低大鼠血脂指標，膝關節中炎癥因子TNF-α，IL-1β，IL-6，MCP-1，MDA的含量，并上調膝關節中SOD，GSH-Px含量。此外，飲食干預聯合二甲雙胍顯著促進膝關節中Nrf2、HO-1與IκBα的蛋白表達，而抑制NF-κB p65蛋白表達水平。綜上所述，飲食干預聯合二甲雙胍可能通過改善炎癥，減輕肥胖程度，從而改善高脂飲食介導的膝骨關節炎。