復(fù)方鐵皮石斛對自發(fā)性高血壓大鼠血壓及TRPV1 mRNA表達(dá)的影響

吳悅 吳人照 薛曉敏 李毓 陳贏智 王潔 陳仕永 黃抒偉

高血壓是一種以體循環(huán)動(dòng)脈血壓升高為主要特征，可伴有多種器官損害的心血管綜合征，其中約90%無法明確病因，被稱為原發(fā)性高血壓（essential hypertension，EH）。中國高血壓調(diào)查［1］顯示我國成人高血壓患病率為27.9%，據(jù)此估算，我國現(xiàn)患高血壓人數(shù)約3億，每年平均新增高血壓患者近1,000萬。降低血壓對于預(yù)防高血壓患者的器官損傷和降低心血管疾病死亡率至關(guān)重要。目前高血壓治療僅僅為對癥治療，隨著高血壓患病率不斷提高以及人類壽命的增加，用藥時(shí)間不斷加長。近年已有研究報(bào)道長期服用如血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑一類的降壓藥物，可能增加患者用藥后的副作用［2］。因此，如何在降壓的同時(shí)減少其副作用已成為當(dāng)前高血壓治療方面的研究熱點(diǎn)及趨勢。鐵皮石斛屬多年生草本植物，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有益胃生津、滋陰清熱的功效，為補(bǔ)陰之要藥，是我國傳統(tǒng)名貴中藥材之一。鐵皮石斛性微寒，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，其具有抗氧化、抗疲勞、抗腫瘤、降血糖、增強(qiáng)免疫力等多方面藥理作用［3］。已有研究提示，鐵皮石斛及其提取物對高血壓大鼠均有很好的降壓作用［4］。近年來大量研究發(fā)現(xiàn)瞬時(shí)受體電位香草酸受體亞型1（transient receptor potential vanilloid type 1，TRPV1）在血管收縮功能調(diào)控過程中發(fā)揮重要作用，可能與高血壓的病理過程有關(guān)，然而在藥物開發(fā)領(lǐng)域，TRPV1通道的研發(fā)價(jià)值仍主要作為鎮(zhèn)痛和抗炎藥物靶點(diǎn)，尚未出現(xiàn)以其為靶點(diǎn)的抗高血壓藥物［5］。本研究擬觀察復(fù)方鐵皮石斛的降壓效果，以及其對心肌組織中TRPV1 mRNA表達(dá)的影響，也為抗高血壓藥物開發(fā)提供新的靶點(diǎn)及思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取8月齡雌性自發(fā)性高血壓大鼠（spontaneous hypertensive rats，SHR）24只，同齡雌性Wistar-Kyoto（WKY）5只：SHR大鼠體質(zhì)量185~210 g，WKY大鼠體質(zhì)量246~289 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2016-0006；合格證號：1100111911009832。本研究經(jīng)浙江省中醫(yī)藥研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（編號：KTSC2021058）。所有大鼠均飼養(yǎng)于浙江省中醫(yī)藥研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（許可證號：SCXK-（浙）2019-0010），溫度為（25±2）℃，相對濕度為55%~60%。大鼠采用標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料喂養(yǎng)，并保持12 h暗-光循環(huán)。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥物 復(fù)方鐵皮石斛：采用中試生產(chǎn)的復(fù)方鐵皮石斛咀嚼片（1.5 g/片），每1 g片劑含復(fù)方生藥約0.777 g，（批號：201905002），由浙江省中醫(yī)藥研究院提供。復(fù)方鐵皮石斛由鐵皮石斛、白芍（Paeoniae Radix Alba）按4∶3比例組成，研粉添加輔料壓片，目前處在創(chuàng)新中藥臨床前研究階段，已經(jīng)完成組方優(yōu)化研究、提取工藝和制劑研究、中試生產(chǎn)、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和穩(wěn)定性研究、降壓藥效研究。目前已有質(zhì)量穩(wěn)定可控的中試生產(chǎn)藥品，作為研究用樣品。

1.3 試劑與儀器 本實(shí)驗(yàn)與本課題組其他實(shí)驗(yàn)共同完成，相關(guān)試劑及儀器已有文獻(xiàn)報(bào)告［6］。

1.4 分組及給藥方法 SHR大鼠隨機(jī)分為復(fù)方鐵皮石斛低劑量組0.7 g/（kg·d）（以下稱“低劑量組”）、復(fù)方鐵皮石斛中劑量組2.1 g/（kg·d）（以下稱“中劑量組”）、復(fù)方鐵皮石斛高劑量組3.5 g/（kg·d）（以下稱“高劑量組”）、模型組，每組6只，5只WKY大鼠為正常組。各治療組大鼠經(jīng)口灌胃容量為1.84 mL·100 g-1，模型組和正常組予飲用水等容量灌胃，每日灌胃1次，連續(xù)灌胃8周。

1.5 血壓測量 課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，在給藥后3 h各治療組降壓藥效最高，在下次給藥前即給藥24 h藥效最低，所以需要測量給藥后3 h和24 h的血壓，來評估降壓療效在一天中的穩(wěn)定和持久性。測量血壓前，將恒溫水浴鍋打開，溫度調(diào)至38℃，水面上平鋪放置一塊合適的不銹鋼板，將大鼠置于大小合適的空水杯中，杯底和杯蓋分別留有小孔以便大鼠頭部和尾巴置于外部，將裝有大鼠的杯子放于恒溫水浴鍋上的鋼板上加熱，為了避免各組大鼠因個(gè)體差異而產(chǎn)生的過度加熱影響血壓，首次加熱4 min，若未能獲得血壓數(shù)據(jù)則增加加熱次數(shù)，第二次及以上加熱均為2 min，并隨環(huán)境溫度的變化對加熱時(shí)間進(jìn)行調(diào)整。將加壓感應(yīng)器套在大鼠尾根部，加壓感應(yīng)器指示尖端與大鼠尾巴尖端方向保持一致，通過BP-98A型無創(chuàng)尾動(dòng)脈血壓測量儀配套軟件在電腦上獲取血壓數(shù)據(jù)。每只大鼠每次測量6~10次血壓，均值作為該鼠測量值。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）法檢測心臟基因表達(dá)。所有大鼠麻醉處死后取心肌組織于液氮中速凍后保存于-80℃條件下，用于檢測心肌組織TRPV1 mRNA的表達(dá)。使用試劑RNAisoPlus9109提取總RNA，取80~100 mg組織加液氮研磨4~5次成粉末狀，加1 mL Trizol繼續(xù)研磨至透明狀，轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管（Tube）中，室溫（4℃~25℃）靜置5 min。加入0.2 mL的三氯甲烷，充分混勻呈乳濁液，室溫靜置5 min；在4 ℃以12,000×g速度離心15 min。吸取400μL上清至新1.5 mL Tube中，加 600~800 μL異丙醇，混勻，室溫靜置10 min；12,000×g 4℃離心10 min。棄上清液，加入1 mL 75%乙醇（DEPC水配制）洗滌沉淀，室溫靜置3 min；在4℃以12,000×g速度離心10 min。盡量棄干凈上清液，室溫干燥（不可加熱）5~10 min。用適量DEPC水溶解樣品，測量濃度和OD260/OD280。用試劑盒 PrimeScript? RT Master Mix（Perfect Real Time）RR036A進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。在Tube中（RNase free）配制混合液：模板RNA500ng；5×PrimeScript RT Master Mix 2 μL；RNase free ddH2O Up to 10 μL。將混合液吹打混勻，反應(yīng)條件：37 ℃，15 min（反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)）85 ℃，5 s，4 ℃，∞。cDNA產(chǎn)物稀釋5倍后用于qPCR。用試劑盒SYBR?Premix Ex Taq? II（Tli RNaseH Plus）RR820A 檢測 TRPV1 mRNA的表達(dá)量，內(nèi)參引物為β-actin。基因的引物序列，見表1。

表1 各基因的引物序列

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料符合正態(tài)分布以（）表示，采用單因素方差分析（ANOVA）、LSD-t、Dunnett T3、獨(dú)立樣本t檢驗(yàn);不符合正態(tài)分布以［M（P25，P75）］表示，采用秩和檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 復(fù)方鐵皮石斛對SHR大鼠血壓的影響 本實(shí)驗(yàn)的模型組及正常組與本課題組其他實(shí)驗(yàn)共同完成，相關(guān)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)已有文獻(xiàn)報(bào)告［7］；實(shí)驗(yàn)治療前，模型組及各治療組SBP均顯著高于正常組（P＜0.05）［6］，各治療組之間及與SHR模型組SBP相比均無顯著差異（P＞0.05）。

治療第8周給藥3 h后：中劑量組SBP降壓幅度與高劑量組接近；與低劑量組比較，中劑量組SBP降幅增加8.2 mmHg（P＜0.01），高劑量組降幅增加8.13 mmHg（P＜0.01）。治療第8周給藥24 h后：與模型組比較，各治療組SBP均顯著降低（P＜0.01）；中劑量組SBP降壓幅度與高劑量組接近；與低劑量組比較，中劑量組SBP降幅增加9.89 mmHg（P＜0.01），高劑量組降幅增加 11.48 mmHg（P＜0.01）。

各治療組SBP在治療3 h均有顯著下降，在治療24 h均有所回升，但仍低于給藥前SBP；在整個(gè)治療過程中，高劑量組及中劑量組降壓（SBP）效果顯著高于低劑量組，見表2。

表2 復(fù)方鐵皮石斛對SHR大鼠SBP的影響［mmHg，（）］

表2 復(fù)方鐵皮石斛對SHR大鼠SBP的影響［mmHg，（）］

注：各組與模型組比較，■P＜0.01；復(fù)方低、中劑量組與復(fù)方高劑量組比較，★P＜0.01；復(fù)方低劑量組與復(fù)方中劑量組比較，●P＜0.01

中劑量組（n=6）療程 低劑量組（n=6）高劑量組（n=6）模型組（n=6）正常組（n=5）給藥8周3 h 184.27±1.94■★● 176.07±2.34■ 176.14±1.36■ 194.69±2.91 122.43±3.75給藥8周24 h 190.60±1.26■★● 180.71±4.49■ 179.12±4.36■ 197.20±3.28 122.86±5.32

2.2 復(fù)方鐵皮石斛對SHR大鼠TRPV1 mRNA的影響 與正常組比較，模型組TRPV1 mRNA表達(dá)顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，低劑量組及中劑量組均顯著下降（P＜0.05），高劑量組有下降趨勢。將復(fù)方三個(gè)劑量組合計(jì)（復(fù)方高+中+低組）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，TRPV1 mRNA表達(dá)較模型組顯著下降（P＜0.05）。見圖1。

圖1 各組大鼠治療第8周心臟TRPV1 mRNA表達(dá)量

3 討論

高血壓作為我國心腦血管疾病的首要危險(xiǎn)因素，可導(dǎo)致如心肌梗死、腦卒中等多種致命性心腦血管疾病［7］。高血壓也可導(dǎo)致一個(gè)或多個(gè)靶器官損害，具體定義為血壓升高引起的動(dòng)脈血管系統(tǒng)和/或其供應(yīng)器官的結(jié)構(gòu)或功能改變，靶器官包括大腦、心臟、腎臟、中央和外周動(dòng)脈以及眼［7］。多項(xiàng)研究結(jié)果提示，中藥輔助降壓不僅能夠減少降壓藥的使用劑量，在達(dá)到有效控制患者血壓、改善臨床癥狀的同時(shí)，還能夠減輕藥物不良反應(yīng)及靶器官損害。本研究結(jié)果表明，給予SHR大鼠復(fù)方鐵皮石斛灌胃治療8周，具有顯著降低血壓的作用。

瞬時(shí)受體電位（transient receptor potential，TRP）通道是介導(dǎo)Ca2+和Na+等單價(jià)和二價(jià)陽離子的一類跨細(xì)胞膜非選擇性陽離子通道，在體內(nèi)細(xì)胞增殖、分化、感知溫度、pH值、滲透壓、牽張力等理化刺激方面具有重要價(jià)值［7］。瞬時(shí)受體電位香草酸受體亞型1（TRPV1）是TRPV家族中研究最廣泛的成員，在心、肝、肺、腎、背根神經(jīng)節(jié)、感覺神經(jīng)元中均有分布［7］。TRPV1對多種化學(xué)和物理刺激原敏感，因辣椒素（香草酸類物質(zhì)）為TRPV1通道的激動(dòng)劑，TRPV1又被稱為辣椒素受體。中藥及其復(fù)方具有多成分，多途徑，多靶點(diǎn)協(xié)同作用的特點(diǎn)［7］。已有前期研究表明，復(fù)方鐵皮石斛與單用厄貝沙坦降壓作用接近，提示復(fù)方鐵皮石斛對減少西藥降壓藥的用量具有一定貢獻(xiàn)，其降壓療效可能與AT2R的mRNA表達(dá)升高有關(guān)［6］。隨著近年來研究的不斷深入，大量研究發(fā)現(xiàn)TRPV1在心血管系統(tǒng)的表達(dá)主要集中于心肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞，激活表達(dá)于血管平滑肌的TRPV1通道可導(dǎo)致大鼠頸動(dòng)脈明顯收縮［7］，辣椒素通過提高動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平，可以使小鼠及大鼠的體內(nèi)外小動(dòng)脈均收縮，顯著且劑量依賴性地減少冠狀動(dòng)脈血流，導(dǎo)致冠狀動(dòng)脈、骨骼肌和脂肪小動(dòng)脈收縮，持續(xù)升高全身血壓［7］。且TRPV1通道是一類瞬時(shí)開放而易于脫敏的離子通道，長期給予其激活劑使其活化后脫敏，阻斷劑抑制其功能可產(chǎn)生相似的阻斷信號傳導(dǎo)的效應(yīng)［8］；通過長期激活TRPV1通道，使該通道活化后脫敏可有效減少血管平滑肌增生，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生NO，引發(fā)血管舒張，降低小鼠血壓［7］。本研究發(fā)現(xiàn)，治療組的SHR大鼠TRPV1 mRNA表達(dá)水平較模型組顯著降低，與正常組大鼠的表達(dá)水平接近，猜測復(fù)方鐵皮石斛的降壓療效可能與下調(diào)TRPV1的mRNA表達(dá)有關(guān)，但尚需進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

綜上所述，復(fù)方鐵皮石斛對SHR大鼠降壓療效良好；其作用機(jī)制可能與降低SHR大鼠的TRPV1轉(zhuǎn)錄水平有關(guān)，提示或可通過抑制TRPV1通道從而降低血壓，以TRPV1或其作用通路為靶點(diǎn)開發(fā)抗高血壓藥物或?qū)⒕哂兄匾呐R床應(yīng)用價(jià)值。