酮體β-羥基丁酸減輕癲癇持續狀態模型大鼠離體海馬神經元的損傷

耿俊紅 凌云 張青 王寶輝 侯群 蔣艷

癲癇持續狀態（status epilepticus，SE）可導致神經元丟失、膠質細胞增生和神經網絡的重組，因此尋找一種能阻止癲癇發作后神經元損傷的治療手段阻止癲癇的進一步形成或癥狀的惡化，具有重要意義。β-羥丁酸（β-hydroxybutyric acid，BHB）是生酮飲食（ketogenic diet，KD）的主要代謝產物，具有抗癲癇和神經保護作用。研究發現，BHB能夠通過抑制活性氧簇和神經元凋亡對腦部相關疾病起作用，但是否對SE所致的海馬神經元損傷具有保護作用，尚未完全清晰。本研究采用體外培養大鼠海馬神經元，通過無鎂灌流構建SE模型，采用MTT法檢測細胞死亡，采用流式儀檢測細胞活性氧簇（reactive oxygen species，ROS），以期為BHB的神經保護機制研究提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 動物及主要試劑 出生24 h內的SPF級新生SD大鼠90只，雌雄不限，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司【SCXK（滬）2012-0002】提供，于浙江中醫藥大學實驗動物中心細胞實驗室進行實驗操作。所有動物實驗均嚴格按照浙江中醫藥大學實驗動物倫理規定，實驗過程中，按實驗動物使用的3R原則給予人道主義關懷。β- 羥丁酸（BHB）、MgCl2、NaCl、KCl、HEPES、CaCl2、葡萄糖、甘氨酸、多聚L賴氨酸購于美國Sigma公司，Neurobasal培養基、B27、胎牛血清購于Gibco公司，DMEM/F12（1∶1）培養基、谷氨酰胺（Gln）、0.25%胰酶＆0.02%EDTA購于浙江森瑞科技有限公司。ROS檢測試劑盒購于上海碧云天生物技術有限公司，PE Annexin V凋亡檢測試劑盒購于美國BD公司。

1.2 海馬神經元培養 海馬神經元培養方法［1］將新生大鼠采用75%酒精清洗后，置于消毒的冰板上。斷頸取大腦，分離海馬組織，置入事先準備的DMEM/F12+胰酶=1∶1溶液中用槍頭充分吹打至無明顯團塊，放入37 ℃培養箱中孵育，消化20 min后加入含10%胎牛血清的DMEM/F12培養液終止消化，1,000rpm/min離心后，用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養液重懸并過200目篩，轉至細胞培養瓶中，差速貼壁1.5 h，收獲貼壁速度慢的神經元，以2.5×104個/cm2的密度種植于事先用0.1 mg/mL多聚L賴氨酸包被的24孔板中，放入CO2培養箱中培養24 h后全量換液，更換為Neurobasal+2% B27+1% Gln培養基，以后每周2~3次半量換液。隔天在倒置相差顯微鏡下觀察神經元的生長情況。海馬神經元的鑒定按試劑盒說明書進行。

1.3 無鎂灌流離體癲癇模型及分組 無鎂灌流造模方法［2］：神經元維持培養2周后，將維持培養基更換為含不同濃度BHB，但不含1 mmol/L MgCl2的生理記錄溶液（physiological recording solution，pBRS），由145 mmol/L NaCl、2.5 mmol/L KCl、10 mmol/L HEPES、2 mmol/L CaCl2、10 mmol/L葡萄糖和0.002 mmol/L甘氨酸組成，pH 7.3，用蔗糖將滲透壓調節至（290±10）mOsm。在不含MgCl2（無Mg2+）的情況下將培養的神經元暴露于pBRS會誘導高頻癲癇樣爆發（SE）。實驗總共分5組，包括對照組（含有1 mmol/L MgCl2的pBRS）、無Mg2+處理組（不添加MgCl2的pBRS處理），無Mg2+處理+BHB 2 mmol/L組，無Mg2+處理+BHB 4 mmol/L組，無Mg2+處理+BHB 8 mmol/L組。持續6 h后，將含有1 mmol/L MgCl2的pBRS添加回培養液中，繼續培養4 h，進行后續實驗。

1.4 MTT法測定神經元活性 所有組別培養細胞均予以MTT法測定細胞活性。將差速貼壁后取得原代海馬神經元細胞，調節細胞懸液濃度為2×105/cm3，種植于96孔板，每孔100 μL，每組6個復孔。維持培養14 d，分別給予無Mg2+和不同濃度BHB處理6 h后，給予含有1 mmol/L MgCl2的pBRS維持培養4 h，各孔加入2 mg/mL MTT 50 μL，37℃繼續培養4 h，離心后去除上清液，每孔加入150 μL DMSO，震蕩至藍色顆粒全部溶解，用酶標儀在570 nm波長測定其吸光值，可間接反映活細胞數量。目標組細胞活力（%）=目標值OD值/正常對照組OD值×100%。

1.5 流式細胞儀檢測凋亡及ROS測定 原代大鼠海馬神經元細胞維持培養14 d后，分別給予無Mg2+和不同濃度BHB處理6 h，每組2個復孔，再給予含有1 mmol/L MgCl2的pBRS維持培養4 h。之后將細胞于6孔板中消化，制成細胞懸液，分別進行流式凋亡和ROS測定的制備。流式凋亡檢測的制備：PBS清洗兩次后，加入1×結合緩沖液調整細胞懸液濃度為1×106個/mL，取100 μL溶液（含1×105個細胞）置于5 mL培養管，加入5 μL PE Annexin V和5 μL 7-ADD，25℃避光孵育15 min，繼續加入400 μL 1×結合緩沖液，混勻后于1 h內用流式細胞儀完成測試。流式ROS檢測的制備：用無血清DMEM/F12培養液按1∶1,000稀釋DCFHDA至終濃度為10 μmol/L。將細胞用PBS清洗后離心，分別用稀釋的DCFH-DA和Rosup（試劑盒自帶陽性試劑）重懸，37℃培養箱孵育20 min。再用無血清細胞培養液洗滌3次，以不加染料組作為陰性對照，Rosup處理組作為陽性對照，用流式細胞儀進行檢測。

1.6 統計學方法 采用SPSS 22.0統計軟件。計量資料符合正態分布以（）表示，組間數據比較采用單因素方差分析（One-Way-ANOVA），組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 形態學觀察 使用熒光倒置顯微鏡觀察神經元，隨時間延長，神經元形態變大，突起逐漸增多，互相接觸，可以看到清晰的軸突和樹突等典型的神經細胞結構特征，見圖1。

圖1 神經元培養過程中形態學改變（×200）

2.2 MTT法檢測細胞死亡 與對照組比較，無鎂處理后神經元細胞活力顯著下降（P＜0.01），給予BHB 2 mmol/L組（P＜0.05），4 mmol/L 組（P＜0.01）神經元力仍較對照組減低，而BHB 8 mmol/L組和對照組相比無統計學差異（P＞0.05）。BHB不同濃度組間比較顯示高濃度組（8 mmol/L）較0 mmol/L組，2 mmol/L組，4 mmol/L組細胞活力高，差異有統計學意義（P均＜0.01）。見圖2。

圖2 各組神經元細胞活力（n=5）*P＜0.05，與對照組比較，**P＜0.01，組間比較，##P＜0.01

2.3 流式細胞儀檢測細胞凋亡 神經元在無鎂環境下早期凋亡（P＜0.05）、晚期凋亡（P＜0.01）及凋亡總數（P＜0.01）均增加。加入8 mmol/L的BHB后，早期凋亡及凋亡總數較不加入BHB組下降，差異有統計學意義（P均＜0.05）。見圖 3。

圖3 BHB影響神經元凋亡

2.4 流式細胞儀檢測ROS ROS水平在無鎂BHB 0 mmol/L組較含鎂對照組明顯增高（P＜0.01），無鎂BHB 8 mmol/L組較無鎂BHB 0 mmol/L組下降，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖 4。

圖4 各組ROS陽性計數

3 討論

癲癇是一種不可預測的、反復發作的神經系統疾病，嚴重危害人類身心健康［3］。KD是一種高脂肪、低碳水化物的飲食，長期以來一直被用作治療阿爾茨海默病、帕金森病、腦缺血缺氧、難治性癲癇的非藥物治療方法［4］，但它的作用機制仍不完全清楚。本研究團隊既往的研究顯示KD具有明確抗癲癇及減輕認知功能損傷［5］的作用。

BHB是最重要的酮體之一，它被認為很可能是KD的有效作用形式［4］。多項實驗性研究認為BHB具有明確的抗癲癇作用［6-7］和神經保護作用。BHB能減少膠質細胞凋亡［8］，它能改變神經元GABA轉運體的活性，對抗谷氨酸誘導的細胞死亡［9］，對AMPK和PPARα存在激活作用［10］，還能通過刺激ATP及減少ROS以對抗低血糖導致的神經元損傷［11］，此外，在慢性退行性疾病的HT22海馬細胞系中，BHB還通過減少氧化應激、改善線粒體功能實現神經保護作用［12］。這些可能的作用機制和KD的神經保護作用存在重要關聯。在急性癲癇模型中，BHB能減少匹羅卡品致癇小鼠模型中神經元丟失，促進凋亡通路的主要蛋白表達［10］。在癲癇模型的神經保護方面，BHB減輕癲癇小鼠的神經元損傷［10］，減少學習功能缺損［13］。本研究證實在葡萄糖供應正常的情況下，高濃度BHB增加癲癇大鼠海馬神經元細胞模型細胞的活力，具有保護神經元作用。流式檢測結果直接顯示BHB影響無鎂灌流模型中神經元細胞凋亡，且8 mmol/L的BHB預處理能降低無鎂灌流所致的ROS升高，提示在SE模型中，BHB能影響氧化應激過程。發作后缺氧是癲癇發作后的重要病理生理改變［13］，尤其在SE模型中更為明顯。升高的ROS水平被認為是癲癇神經元損傷的關鍵致病因素。BHB可能通過減少ROS的產生，繼而減少細胞凋亡，從而起到神經保護的作用。

綜上所述，高濃度BHB能增加神經元活力，減少神經細胞凋亡，對SE模型中體外培養海馬神經元活性有保護作用，并可能通過影響ROS途徑起作用。