化膿性中耳炎病原譜分析及耐藥性檢測

劉瑞杰 王鑫霞 王露 趙梓堯 余馳昊 袁舒穎 陳妍雯 張紹興 楊雪靜 孫桂芹

化膿性中耳炎（suppurative otitis media，SOM）是一種臨床常見的中耳疾病，兒童發病率較高［1-2］，可導致聽力下降、耳痛以及流膿等臨床癥狀［3-4］，若不能及時接受有效的治療，會加重病情甚至可能威脅患者生命健康。引發SOM的主要因素是病原微生物感染［5-6］。隨著抗生素的廣泛使用，SOM患者分離到的病原菌對抗生素耐藥性增強，給臨床診療帶來較大困擾［7-8］。目前，臨床主要采用分離培養法檢測SOM患者的病原菌，但該方法不能檢出難培養和不可培養的微生物，而16S rDNA宏基因組技術能夠對樣本中微量、難培養的微生物進行檢測［9］。該研究將16S rDNA宏基因組測序與分離培養相結合，對SOM患者耳道分泌物進行病原菌菌群結構、豐度分析，以提高SOM的診斷效率，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象 收集2019年3月至2019年9月在浙江中醫藥大學附屬第一醫院就診的SOM患者耳道分泌物21例，另收集40例無耳道疾病健康大學生的耳道分泌物作為對照組。

1.2 儀器及試劑 儀器：生化培養箱（SPX-250B-Z，上海博迅實業有限公司）、生物安全柜（NU-425-400S，美國Nuaire公司）、全自動微生物鑒定儀（VITEK-2 COMPACT，法國生物梅里埃公司）及其配套的細菌鑒定卡（批號190213）等。試劑：水解酪蛋白（Mueller-Hinton，MH）培養基（批號181212）、血瓊脂培養基（批號190601），青霉素、頭孢呋辛等藥敏紙片（批號190523），均購自杭州濱和微生物試劑公司。

1.3 樣本采集 參考《臨床檢驗標本采集手冊》（2011年）。由臨床醫護人員在額鏡照明下，用75%乙醇清潔外耳道皮膚，再用經0.9%NaCl溶液濕潤的無菌棉拭子在SOM患者患側外耳道深部或鼓室內采集分泌物，置于無菌試管中。

1.4 細菌的分離培養及鑒定 將樣本接種于血平板，37 ℃培養24 h~48 h，挑選單菌落制備0.50~0.63麥氏單位菌懸液，采用梅里埃VITEK-2全自動微生物鑒定儀及其配套試劑進行菌種鑒定。

1.5 16S rDNA宏基因組測序分析 利用16S rDNA宏基因組技術，對耳道分泌物中可培養、難培養的細菌進行檢測。按照樣本DNA提取、PCR擴增、測序、數據分析等步驟分析樣本菌群，由杭州聯川生物股份有限公司完成。

1.6 藥物敏感試驗 采用紙片擴散法，對SOM患者耳道分泌物分離的細菌進行藥敏分析。將分離的病原菌制備成0.5麥氏單位菌懸液，均勻涂布于MH平板，將藥敏紙片貼在平板上，37 ℃培養18 h~24 h，測量抑菌圈直徑。結果判定參照美國臨床實驗室標準化委員會（2018）標準。

2 結果

2.1 SOM患者和健康人耳道分泌物分離培養結果 21例SOM患者耳道分泌物，10例培養出病原菌，檢出率為47.6%，共分離得到病原菌16株，其中革蘭陽性菌14株（87.5%），主要為金黃色葡萄球菌，革蘭陰性菌1株（6.25%），真菌1株（6.25%）。40例健康人耳道分泌物分離得到77株菌，前3種為頭葡萄球菌、耳葡萄球菌、表皮葡萄球菌。SOM患者和健康人耳道微生物分布有較大差異。見表1。

表1 SOM患者和健康人耳道分泌物病原菌分布［n（%）］

2.2 16S rDNA宏基因組測序結果 21例SOM患者耳道分泌物（其中有4例樣本未達到測序要求）和2例健康人耳道分泌物的16S rDNA宏基因組分析結果，見圖1和表2。SOM002、SOM008、SOM010等9例樣本分離培養與16S rDNA測序均檢出為葡萄球菌；SOM009、SOM016等8例樣本未培養出病原菌，而16S rDNA測序檢出葡萄球菌和伯克霍爾德菌等。另外，SOM011、SOM019樣本中檢測到韋榮球菌、普雷沃菌等厭氧菌。16S rDNA測序與分離培養結果基本一致，但其微生物的種類和豐度存在一定差異。

圖1 SOM患者（17例）和健康人（2例）耳道分泌物細菌豐度和物種分布圖

表2 分離培養與16S rDNA測序結果比較

2.3 藥物敏感性 SOM患者分離的金黃色葡萄球菌對頭孢呋辛、頭孢吡肟、苯唑西林等多種臨床常用抗生素呈現較高的敏感率（＞75.0%），對青霉素的耐藥率為100%，其中有1株金黃色葡萄球菌對萬古霉素耐藥。SOM患者分離的耳葡萄球菌、表皮葡萄球菌和健康人分離的頭葡萄球菌、耳葡萄球菌、表皮葡萄球菌對大多數抗菌藥物敏感性較高，見表3和表4。

表3 SOM患者耳道分泌物主要革蘭陽性菌的藥物敏感性結果［n（%）］

表4 健康人耳道分泌物主要革蘭陽性菌的藥物敏感性結果［n（%）］

2.4 青霉素耐藥株的β-內酰胺酶檢測結果 SOM患者分離的葡萄球菌對青霉素耐藥率較高，采用頭孢硝噻吩紙片法檢測耐藥株產β-內酰胺酶情況，金黃色葡萄球菌青霉素耐藥株的β-內酰胺酶陽性率為50.0%，里昂葡萄球菌、緩慢葡萄球菌均為陰性，見表5。

表5 頭孢硝噻吩紙片法檢測β-內酰胺酶

3 討論

病原菌感染是引發SOM的重要因素，可導致患者中耳黏膜化膿病變［10］。研究表明，不同地區SOM患者的病原菌類別及其耐藥性存在差異［11］。熊素芳等［12］在508例SOM患者耳分泌物中分離到金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌等病原菌。UDDéN等［13］在184例SOM患者耳分泌物中分離到變形桿菌、銅綠假單胞菌及腸球菌等。由于抗生素在臨床上的廣泛應用，致使病原菌對抗生素的耐藥性增加，給SOM治療帶來較大困擾［14］。

該研究通過分離培養方法分析SOM患者耳道分泌物的病原菌種類，其中革蘭陽性菌檢出率高于革蘭陰性菌。SOM患者以金黃色葡萄球菌為主，健康人以頭葡萄球菌為主，兩組均分離到耳葡萄球菌、表皮葡萄球菌，提示其為耳道正常定植菌，但在一定條件下可能成為致病菌。傳統分離培養方法是經典方法，但對不易培養和不可培養的微生物難以檢出，可通過16S rDNA宏基因組技術提高樣本的檢出效率［15］，該研究52.9%樣本兩種方法均檢出葡萄球菌，與相關研究結果一致［9］。另外，部分樣本培養結果為陰性，但是16S rDNA測序為陽性，考慮是因為苛氧菌或厭氧菌等不易培養的微生物、患者經過抗生素治療或樣本采集和送檢過程中細菌死亡導致，因此可采用16S rDNA宏基因組技術彌補分離培養方法的缺陷，豐富SOM病原譜，或者通過調整難培養細菌的生長條件即培養基的營養物質，從而提高陽性檢出率。16S rDNA宏基因組技術具有廣泛的臨床應用前景［16］，但易造成假陽性，檢測過程中要嚴格避免雜菌污染。

該研究藥敏試驗結果顯示，SOM患者分離的金黃色葡萄球菌對臨床常用的頭孢菌素類和氨基糖苷類藥物的敏感率＞75.0%，對青霉素耐藥率為100%，耐藥菌株的β-內酰胺酶陽性率為50.0%，可能由其他耐藥機制介導，如青霉素結合蛋白異構體（PBP2′）［17］。雖然金黃色葡萄球菌藥物敏感率較高，未檢出耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）菌株，但檢出1株萬古霉素耐藥，應關注其耐藥性。

綜上所述，臨床應積極開展對SOM的病原菌檢測及藥敏分析，并依據實驗數據合理用藥，提高治療效果，可減緩細菌耐藥的發生。