熱激蛋白與皮膚惡性黑色素瘤的研究進展

陳柯君，葉茜，方圣

(重慶醫科大學附屬第一醫院皮膚科，重慶 400016)

皮膚惡性黑色素瘤(cutaneous malignant melanoma，CMM)是皮膚惡性程度最高的一種皮膚腫瘤，其發病率呈逐年上升趨勢，雖然CMM在皮膚腫瘤中僅占5%，但其病死率占皮膚腫瘤的70%[1]。目前CMM的治療方法包括早期手術擴大切除、術后干擾素注射、新型靶向治療、免疫治療等，但部分黑色素瘤仍會出現轉移及局部復發，特別是對于已轉移的黑色素瘤，其預后極差。而熱激蛋白(heat shock proteins，HSPs)作為一種分子伴侶，在維持蛋白質的正確表達、細胞生長發育等方面發揮重要作用。其可以促進受控的細胞生長，避免凋亡，提高細胞存活率，并促進血管生成，而這種功能對于許多惡性腫瘤增殖、轉移不可或缺[2]。既往研究表明，在多種腫瘤(如結直腸癌、肺癌和口腔鱗狀細胞癌)中，HSPs的表達水平升高，大多數情況下表達水平升高預示預后較差[3]。由于HSPs與腫瘤關系密切，與HSPs相關的腫瘤疾病可稱為“伴侶病”。既往有文獻報道，與良性色素痣相比，CMM中HSP70/90/105表達水平明顯升高[4-6]。因此，HSPs可能成為鑒別良惡性腫瘤的新型標志物，也可能作為新型的腫瘤治療方法。現就HSPs與CMM研究進展予以綜述。

1 HSPs的生物學功能

HSPs在生物界普遍存在，從原核生物到真核生物均有HSPs的表達。作為一種急性反應蛋白，在正常情況下，其表達水平較低，但當機體受到高溫、缺氧、病毒、感染、紫外線照射等刺激時，會合成HSPs來保護機體，提高細胞的應激能力。伴侶蛋白不僅存在于組織，也可作為細胞分泌的產物存在于體液，且細胞內外均有HSPs的表達[7]。HSPs主要協助蛋白質的折疊和再折疊，降解錯誤折疊的蛋白質，同時也參與體外作用，如參與免疫系統調節、細胞分化、基因表達、DNA復制、信號轉導、程序性細胞死亡、細胞衰老等。依據分子量不同，HSPs可以分為5類，分別為小分子HSPs、HSP40、HSP70、HSP90及HSP105/110，其中HSP105/110是一種主要的哺乳動物HSPs，是HSP70家族的一個不同亞群[3]。

HSPs不僅在正常細胞中發揮作用，也參與腫瘤細胞的存活、增殖及轉移，其發病機制主要包括以下幾個方面：①腫瘤的無限增殖為其主要特性，而控制無限增殖的許多信號蛋白均為HSPs的客戶蛋白，因此HSPs的增加是腫瘤無限增殖的信號通路的基礎。另外，HSP90可抑制腫瘤細胞中端粒酶的活性，從而阻止端粒的縮減[2,8]。②由于腫瘤細胞增殖速度較快，蛋白需求量大，不可避免出現錯誤折疊，因此腫瘤細胞劫持了HSPs的保護功能來滿足腫瘤折疊需求的增加。③HSPs可協助腫瘤逃避細胞的程序性細胞死亡，如HSP27通過抑制凋亡蛋白Bid，HSP70通過抑制線粒體膜上的Bcl-2相關蛋白，從而抑制凋亡前蛋白的釋放。在線粒體的下游，HSP27通過與細胞色素C結合，而HSP70和HSP90與凋亡蛋白酶激活因子1結合，從而阻止胱天蛋白酶的激活和凋亡。④HSPs也可促進腫瘤血管的生成，如HSP27不僅可與血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)結合促進腫瘤血管生成，還可誘導缺氧因子生成，加快腫瘤毛細血管網的生長[2]。⑤HSPs可促進腫瘤的侵襲和轉移。作為客戶蛋白，HSP90可協助黏著斑激酶、整合素連接激酶和酪氨酸受體激酶ErbB2及原癌基因MET的合成，從而使腫瘤更易轉移[2]。因此，HSPs與腫瘤的關系十分密切，且這一類伴侶蛋白也可成為病因或致病因素，形成致病性蛋白。研究表明，HSPs的過表達與多種腫瘤有關，包括前列腺癌、膀胱癌、乳腺癌、結直腸癌、肺癌、食管鱗癌、腎細胞癌等[2,9]。目前，HSPs抑制劑是研究熱點，未來可根據HSPs相關機制研究，進一步研制出相關藥物用于腫瘤的治療。

HSPs也具有免疫原性，其可通過活化自然殺傷細胞、激活單核巨噬細胞系統等，引發固有免疫反應。另外，HSPs多肽復合物也可通過主要組織相容性復合體Ⅱ途徑來誘導CD4+T淋巴細胞的固有免疫反應[10-11]。HSPs多肽復合物主要有以下兩方面的作用：①作為多肽(包括抗原性腫瘤多肽)的伴侶，激活抗原特異性適應性免疫。②作為抗原呈遞細胞的佐劑，獨立于任何相關肽，促進先天免疫反應。因此基于其免疫原性，目前已有研究將HSPs作為基礎疫苗與免疫調節性單克隆抗體(如抗細胞毒性T淋巴細胞相關抗原-4和抗程序性細胞死亡受體1/程序性細胞死亡配體1)協同使用治療腫瘤[12]，且HSPs疫苗已成功應用于多種腫瘤(如黑色素瘤[11]、轉移性結腸癌[11]和膠質母細胞瘤[13])，并顯示出極好的安全性。綜上可知，HSPs作為分子伴侶既有促進腫瘤生長的作用，也可激活自身免疫起到治療腫瘤的作用。

2 不同類型的HSPs與CMM的關系

CMM是一種源自皮膚黑色素細胞的惡性腫瘤。早期通過手術切除原發腫瘤可完全治愈，但轉移性CMM患者預后較差。目前對于已轉移的患者，可選擇手術切除原發灶及淋巴結清掃，術后予以大劑量干擾素注射預防復發[12]。而HSPs作為新型治療方案為CMM患者治療提供了新選擇。以下分別介紹不同種類HSPs對CMM的影響。

2.1小HSPs與CMM HSP27是一種小HSPs，其通過管理錯誤折疊的蛋白和防止細胞凋亡來維持細胞在應激條件下的生存[14]。此外，HSP27在血管生成、腫瘤細胞遷移、抑制腫瘤凋亡以及細胞骨架組織中發揮重要作用。研究表明，HSP27與腫瘤相關，如在早期(Ⅰ期和Ⅱ期)結直腸癌中HSP27表達水平降低，而在晚期(Ⅲ期和Ⅳ期)及肺轉移結直腸癌患者中HSP27表達水平升高[15]，在口腔鱗狀細胞癌[16]患者中HSP27表達水平最高。然而，HSP27與胃癌、肝癌的預后無明顯相關性[17-19]。CMM在增殖時需要豐富的血供，而HSP27與血管生成密切相關。研究顯示，血管生長因子依賴HSP27的調控，在CMM中下調HSP27可使VEGF及堿性成纖維細胞生長因子分泌減少，而敲除HSP27后，涉及血管生成相關的轉錄因子表達明顯減少[2，19-20]。有研究表明，在HSP27表達水平較高的轉移性CMM患者中，靶向抑制VEGF的藥物貝伐珠單抗的療效更佳[21]。但目前關于HSP27與CMM的研究較少，HSP27促進腫瘤組織血管生成仍需要進一步研究，需要檢測多個反映血管新生的指標，如微血管密度、增殖微血管密度、血管增殖指數等。另外，也有HSP27抑制劑運用于臨床試驗。

2.2HSP70與CMM HSP70的含量十分豐富，與其他HSPs功能類似，其具有協助大量蛋白質折疊、協助錯誤蛋白質降解等作用[22]。研究發現，HSP70在多種腫瘤(如乳腺癌、肺癌、卵巢癌、結直腸癌、胰腺癌、CMM)中均高表達[4，23]。而HSP70促進CMM發生的機制可能包括：①HSP70可抑制胱天蛋白酶依賴的線粒體介導的內、外源性凋亡途徑，也可與促凋亡因子(凋亡誘導因子)結合抑制獨立凋亡通路，從而促進腫瘤的生長。②HSP70可與抑癌基因p53結合后抑制信號轉導，使腫瘤細胞逃脫死亡，促進細胞的存活。另一方面，HSP70能夠與腫瘤特異性抗原組成多肽復合物激活T、B淋巴細胞，從而引發一系列特異性免疫應答，同時也可激活固有免疫應答[24]。臨床研究表明，HSP70在黑色素瘤中過表達，其中CMM轉移病灶中的表達水平最高，但在色素痣、正常細胞及組織中表達較少[24]；另外，HSP70表達水平與Clark水平存在相關性，對預后判斷具有重要價值[4，25]。但有研究認為，HSP70在色素痣、CMM、正常皮膚中的表達未見明顯區別[26]，因此其作用仍有待進一步研究明確。此外，HSP70陽性/MEL-5陰性的標記組合可用于評估CMM的轉移潛能，同時也可作為預后危險因素的指標[4]。

近年來，HSP70在腫瘤治療中的應用越來越廣泛。依據致病機制，其治療方法主要包括以下兩種：①靶向治療。目前已有多個HSP70抑制劑，主要靶向N端結構域和C端結構域，包括天然產物和合成小分子[27]。研究發現，腫瘤細胞表面出現HSP70家族的基因編碼的蛋白質，并攜帶免疫原性物質，因此更易成為抗體治療的靶點[28]。另有研究表明，HSP70抑制劑PET-16可降低磷酸化黏著斑激酶及突變基因BRAF的表達水平，從而阻斷腫瘤的遷移、侵襲和轉移。因此，HSP70抑制劑與BRAF抑制劑可協同作用，在一定程度上增加黑色素瘤對BRAF抑制劑的治療效果[29]。②免疫治療。有研究表明，使用HSP70水凝膠合成物外用或直接瘤內注射于黑色素瘤小鼠可在激活CD4+、CD8+T細胞和自然殺傷細胞的同時產生強烈的免疫反應，從而發揮抗腫瘤作用[30]。另外，HSP70疫苗與sBTLA基因轉染的腺相關病毒聯合使用激活免疫應答，可縮小CMM小鼠肺轉移灶，延長小鼠的生存時間[31]。未來進一步明確HSP70在黑色素瘤中的作用機制對腫瘤的預防和治療均具有重要意義。

2.3HSP90與CMM HSP90是目前研究最多、依賴ATP的分子伴侶，參與數百種蛋白質的適當折疊和成熟。其可以分為HSP90α、HSP90β、腫瘤壞死因子受體相關蛋白1及葡萄糖調節蛋白94四種不同的亞型[32]。研究顯示，HSP90在黑色素瘤中的表達水平高于痣，且表達水平隨著Clark分級升高及Breslow深度增加而增高，但HSP90的高表達與生存率之間無明顯相關性[5]。另外，CMM患者血清中的HSP90水平明顯高于健康對照者，表明血清HSP90可能是CMM進展的生物標志物[33]。CMM的發生發展主要依賴促分裂原活化的蛋白激酶、磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B、BRAF、核因子κB、Wnt/β聯蛋白等信號通路，而這些通路中的關鍵蛋白均是HSP90的客戶蛋白[34]。因此，HSP90在CMM的增殖、分化、轉移、調節細胞周期、血管生成等方面發揮重要作用[35-37]。與HSP27和HSP70類似，HSP90也可通過調控p53、核因子κB、蛋白激酶B、Raf-1、c-Jun氨基端激酶等多種凋亡因子在細胞凋亡中發揮重要作用[2]。有研究表明，HSP90抑制劑可通過降解缺氧誘導因子-1α抑制下游VEGF的表達，抑制腫瘤血管生成，從而在CMM血管生成中發揮作用[38]。

此外，黑色素瘤細胞表面也發現了HSP90表達增加，提示HSP90是一個潛在的免疫相關靶點[39]。因此，已有很多選擇性HSP90抑制劑靶向用于腫瘤治療，其中HSP90靶向C端的抑制劑有新生霉素及其衍生物；N端抑制劑有苯醌類、間苯二酚類抑制劑，包括格爾達霉素、17-丙烯氨基-17-去甲氧基格爾德霉素(17-allylamino-17-demethoxygeldanamycin，17-AAG)、根赤殼菌素等；靶向中間結構域的抑制劑有Sansalvamide A及其衍生物[34]。由于HSP90在信號轉導、細胞周期控制和凋亡的調節中發揮重要作用，同時可以從多環節、多途徑影響癌細胞生長和存活，避免了單靶點治療可能產生的耐藥性，所以HSP90在CMM的靶向治療中具有良好的應用前景。對于BRAF v600突變黑色素瘤患者，雖然初始使用BRAF抑制劑時效果較佳，但會出現耐藥現象，而有臨床試驗表明，使用HSP90抑制劑XL888聯合維莫非尼治療基因突變患者療效時間增加，且不良反應可耐受[40]。目前，熱消融或激光治療較大的CMM可能引起局部復發，而使用HSP90抑制劑(17-DMAG)可以增強高溫條件下黑色素瘤細胞的凋亡效應，通過蛋白激酶B和p38促分裂原活化的蛋白激酶途徑降解HSP90，抑制SK-MEL-2黑色素瘤細胞的生長，促進細胞凋亡。因此在高溫狀態下，使用HSP90抑制劑可能是黑色素瘤的一種輔助治療方法[41]。有研究表明，HSP90抑制劑17-AAG外用能有效預防紫外線誘導的表皮增生和鱗狀細胞癌，考慮17-AAG可配制成乳膏用于預防紫外線暴露人群或器官移植人群的皮膚鱗狀細胞癌[42]。因此，HSP90抑制劑的運用可能拓寬CMM的治療途徑。

2.4HSP105與CMM HSP105是一種大分子量蛋白，具有多種功能，如防止蛋白質錯誤折疊過程中的聚集，提供細胞耐熱性以及穩定熱變性蛋白質，目前有關HSP105在黑色素瘤中的作用研究較少[43]。HSP105可以保護細胞免于凋亡，對癌細胞的生存和增殖至關重要。HSP105在多種人類癌細胞中均有過表達，而其在鱗狀細胞癌[44]、肺腺癌[45]、口腔鱗狀細胞癌[46]中的過表達與疾病進展和不良預后有關。有研究表明，乳腺癌、直腸癌及CMM臨床研究中HSP105過表達的患者總體生存期短[47]。但HSP105過表達與膀胱癌的良好預后相關[48]。在皮膚腫瘤中，HSP105在乳房外佩吉特病、鱗狀細胞癌中高表達，在基底細胞癌中表達較少[49]。在正常人皮膚、良性黑色素細胞、色素痣中HSP105幾乎不表達，然而在原發、晚期及轉移的CMM中HSP105高表達。有研究表明，與HSP70相比，HSP105被認為是與CMM相關性更強的腫瘤相關抗原[6]。

此外，HSP105也在腫瘤生長方面發揮作用，如Wnt/β聯蛋白信號通路在結腸癌等腫瘤中可發揮重要作用，β聯蛋白分子在細胞質中的累積，可引起細胞核內異常基因的轉錄，而HSP105可促進β聯蛋白分子的累積和核內基因表達，從而促進腫瘤的增殖、分化。另有研究表明，在抑制凋亡方面，HSP105不僅可通過抑制Bcl-2相關X蛋白轉位到線粒體，從而阻止細胞色素C的釋放，還可使蛋白激酶通路中的p38表達減少[3]。因此，HSP105可以抑制腫瘤細胞凋亡，促進腫瘤的持續克隆增殖。

HSP105是高效的分子伴侶，具有強大的多肽結合力，其效率為HSP70的40倍[50]。目前，已有多種HSP105多肽復合物疫苗、干擾小RNA進行試驗并取得一定成效。如用HSP105 DNA疫苗免疫小鼠，可使適應免疫中的CD4+T及CD8+T細胞激活，從而激活免疫系統對抗腫瘤(如結直腸癌和黑色素瘤)，但這種疫苗卻不會引起自身免疫[51]。有學者對HSP105疫苗進行Ⅰ期臨床試驗發現，HSP105可誘導細胞毒性T細胞反應激活免疫反應[52]。因此，HSP105疫苗有望成為治療CMM的新方式。目前關于HSP105與CMM的研究較少，但其能夠作為優勢的免疫佐劑研發抗腫瘤疫苗，因此需要深入研究HSP105在CMM發生發展中的相關作用機制。

2.5其他類型HSPs與CMM 目前，關于其他類型的HSPs與CMM的研究較少。HSP40家族分布于不同細胞器，并在蛋白質的翻譯、折疊、轉運和降解等過程中發揮重要作用。HSP40的J結構域負責與HSP70相互作用，作為分子伴侶存在，兩者常共定位于相同的亞細胞區域，HSP40在HSP70活性調節中起著關鍵作用[53]。HSP40預先識別要轉移到HSP70的底物，并刺激HSP70的ATP水解，從而使得底物與HSP70穩定結合，因此HSP40-HSP70的相互作用可能對腫瘤的治療具有重要意義，可為藥物定位或免疫療法提供可行目標，但HSP40在CMM中的相關作用機制尚不明確，仍需進一步研究。HSP60是重要的應激蛋白，其廣泛存在于原核細胞和真核細胞，具有高度保守性和序列同源性。HSP60參與應激反應中蛋白質合成、多肽折疊、受損線粒體蛋白運輸等生理過程，且具有免疫原性和免疫調節功能。HSP60表達水平的變化可為腸癌、胃癌等腫瘤的早期發現、流行病學調查提供依據[54]。研究表明，用HSP65免疫小鼠可激發免疫反應，抑制小鼠黑色素瘤生長，延長腫瘤小鼠的生存時間[55]。

3 小 結

既往研究表明，HSPs家族中的HSP70、HSP90和HSP105在CMM中均呈高表達，且其高表達常與預后較差有關[56]。同時，HSPs的表達水平升高可促進CMM的增殖、轉移以及血管生成。目前,腫瘤的免疫及靶向治療是研究熱點，而HSPs具有雙重調節作用，不僅能夠激活免疫系統，也有抗凋亡作用。在治療方面HSPs能夠刺激天然免疫、細胞免疫和體液免疫應答起到治療作用，而靶向使用HSPs抑制劑輔助其他靶向藥物，可預防耐藥性。但HSPs與CMM關系密切，未來通過不斷研究可為后續CMM的診斷、差異性治療提供新方向。