乳源性外泌體減少新生兒腸道損傷

李鴻鳴，廖海蓉

（岳陽(yáng)市婦幼保健院新生兒科，湖南 岳陽(yáng) 414000）

1 概述

壞死性小腸結(jié)腸炎（necrotizing enterocolitis，NEC）是新生兒最具破壞性的腸道疾病，是導(dǎo)致新生兒死亡的重要原因，不同的研究中NEC的發(fā)病率不同，最新研究顯示，極低出生體質(zhì)量?jī)海╲ery low birth weight，VLBW），NEC 的發(fā)病率為 16.7%～20.7%，嚴(yán)重NEC病死率可高達(dá)50%，是新生兒緊急腸道手術(shù)的主要原因，且幸存者也常伴有短腸綜合征、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常等多種并發(fā)癥，嚴(yán)重影響新生兒生存質(zhì)量[1-4]。雖然目前NEC 的發(fā)病機(jī)制尚未明確，但國(guó)內(nèi)外研究表明主要有以下方面的原因：腸道免疫系統(tǒng)發(fā)育不成熟、腸道微生物失衡、腸道缺血缺氧及不合理腸內(nèi)喂養(yǎng)[3，5-7]。

母乳是公認(rèn)的生命早期的最佳營(yíng)養(yǎng)來(lái)源，其中的營(yíng)養(yǎng)素含量會(huì)隨著成長(zhǎng)中嬰兒的需求而變化，保障兒童時(shí)期免受傳染性及炎性疾病的侵害[8-12]。母乳中含有很多生物活性因子，如獨(dú)特的微生物組、寡糖、低聚糖、免疫球蛋白（SIgA）、乳鐵蛋白、生長(zhǎng)因子（IL-6，IL-10）等，這些生物活性成分能調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)發(fā)育，減輕炎癥反應(yīng)，尤其是在早產(chǎn)兒腸道生物學(xué)中具有至關(guān)重要的作用，但其對(duì)NEC的保護(hù)機(jī)制目前尚未明確[13-18]。有研究指出，其主要的潛在保護(hù)機(jī)制之一可能與母乳中存在大量的外泌體有關(guān)。國(guó)外研究者已發(fā)現(xiàn)外泌體在細(xì)胞間通訊、防御病毒等方面具有關(guān)鍵作用，且最近的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，母乳來(lái)源的外泌體可支持新生兒胃腸道及免疫系統(tǒng)的發(fā)育[19-23]。

2 外泌體

1983 年 ，Harding 和 Pan and Johnstone 報(bào) 道 指出，轉(zhuǎn)鐵蛋白受體通過(guò)大小為50 nm 的小囊泡在血液中運(yùn)輸，而在當(dāng)時(shí)，對(duì)細(xì)胞之間傳遞信息的機(jī)制尚未了解，直到4 年后，Rose Johnstone 將這類在細(xì)胞間起到信號(hào)傳導(dǎo)作用的囊泡定義為外泌體。2013 年，有學(xué)者揭示了外泌體轉(zhuǎn)運(yùn)的機(jī)制，并觸發(fā)了外泌體作為疾病診斷和治療的生物標(biāo)志物的潛在用途[24]。此后，外泌體的生物學(xué)功能逐漸引起各個(gè)領(lǐng)域?qū)W者的關(guān)注。

外泌體是從細(xì)胞質(zhì)膜釋放的內(nèi)吞囊泡，直徑為30～200 nm，包含有多種生物活性因子，存在于唾液、尿液、血液、母乳等眾多體液中[25]。這些膜囊泡由細(xì)胞主動(dòng)分泌，細(xì)胞通過(guò)膜囊泡在細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞器 之 間 傳 遞 microRNA（miRNA），信 使 RNA（mRNA），蛋白質(zhì)和其他蛋白，膜囊泡包含受體以確保運(yùn)輸特異性[26]。幾乎所有哺乳動(dòng)物細(xì)胞類型均釋放外泌體，且外泌體是起源細(xì)胞所特有的，具有其來(lái)源的患病細(xì)胞的生物標(biāo)志性特質(zhì)，因此，應(yīng)用于診斷治療學(xué)具有重要作用[24]。外泌體可通過(guò)調(diào)節(jié)AKT/ERK增殖轉(zhuǎn)錄途徑增加包括軟骨和內(nèi)皮細(xì)胞在內(nèi)的不同細(xì)胞類型的增殖和存活率，同時(shí)，還能調(diào)節(jié)NF-kB炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及T細(xì)胞啟動(dòng)和激活的能力[27-31]。外泌體細(xì)胞來(lái)源不同，功能各不相同。如來(lái)自免疫細(xì)胞的外泌體可以參與免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)；來(lái)源于干細(xì)胞的外泌體，能降低大鼠嚴(yán)重壞死性小腸結(jié)腸炎的發(fā)生率，還可以增加小鼠心臟的收縮力并降低其舒張壓，加速小鼠骨折愈合，促進(jìn)神經(jīng)生長(zhǎng)等，表明外泌體有益于健康[29，32-34]。不同細(xì)胞來(lái)源的外泌體跨細(xì)胞交流功能也較廣泛，受體細(xì)胞類型較多，為外泌體發(fā)揮各種生物調(diào)節(jié)功能奠定基礎(chǔ)。關(guān)于外泌體在NEC中的作用已有部分研究，在體外和體內(nèi)已發(fā)現(xiàn)源自骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的外泌體可以容納受損的腸段并保護(hù)腸道免受NEC感染[35]，然而關(guān)于母乳來(lái)源的外泌體對(duì)NEC的影響尚不清楚。

3 乳源性外泌體

近年來(lái)，人類母乳中檢測(cè)到的免疫學(xué)成分列表顯著增加，母乳中富含大量的分泌性免疫球蛋白（尤其是IgA）、抗微生物因子（如溶菌酶、乳鐵蛋白和寡糖）等，這些與免疫相關(guān)的因素不僅可以為嬰兒提供被動(dòng)免疫，還可以促進(jìn)和調(diào)節(jié)嬰兒自身免疫系統(tǒng)的發(fā)育[13-18]。外泌體是存在于各種體液中的小的內(nèi)吞性囊泡小體，在母乳中含量尤其高。乳汁來(lái)源的外泌體包裹了各種類型的生物活性因子，如蛋白質(zhì)、mRNA 和miRNA，并保護(hù)他們免于酶促和非酶促降解，這種穩(wěn)定性可使外泌體內(nèi)容物完好無(wú)損地到達(dá)新生兒的腸腔并被吸收，從而發(fā)揮其作用[36]。Alison 等[37]收集產(chǎn)后 7～14 d 大鼠乳汁 ，通過(guò)試劑盒提取外泌體，將提純后外泌體0.5 μg/μl 處理IEC18細(xì)胞5 h后，外泌體組IEC18細(xì)胞活性較無(wú)外泌體組明顯提高[（0.24±0.01）vs.（0.18±0.01），P＜0.05]，且研究結(jié)果顯示經(jīng)外泌體處理后，IEC18細(xì)胞的腸道干細(xì)胞標(biāo)志物G蛋白偶聯(lián)受體5（Lgr5）基因表達(dá)水平增加[（6.96±2.66）vs.（1.00±0.59），P＜0.05]，該研究結(jié)果表明，外泌體可以顯著促進(jìn)腸上皮細(xì)胞的活力，增強(qiáng)腸上皮細(xì)胞增殖能力，并可刺激腸干細(xì)胞的活性。研究發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是大鼠乳汁中的外泌體還是牛乳來(lái)源的外泌體均可以促進(jìn)腸上皮細(xì)胞增生，并刺激腸道干細(xì)胞活性，這也就可以解釋為什么母乳喂養(yǎng)可以有助于預(yù)防NEC 的發(fā)生[37-38]。Colin Martin 等對(duì)母乳外泌體進(jìn)行純化分析，純化的外泌體的大小＜200 nm，平均大小（74.6±48.0）nm。使用不同濃度外泌體培養(yǎng)IECs細(xì)胞，當(dāng)濃度達(dá)到10 μg 時(shí)，對(duì)細(xì)胞活性有直接影響，用H2O2處理IEC-6 細(xì)胞導(dǎo)致細(xì)胞缺氧損傷后，分別使用外泌體1、10 μg 處理的細(xì)胞細(xì)胞，細(xì)胞損傷被修復(fù)，與對(duì)照組（不含外泌體的細(xì)胞死亡率達(dá)到50%）比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），該研究結(jié)果顯示，人類母乳來(lái)源的外泌體可以減少腸道細(xì)胞的氧化應(yīng)激相關(guān)的損傷[24]。病原菌的入侵和未成熟的腸道屏障是導(dǎo)致NEC 發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵因素，杯狀細(xì)胞負(fù)責(zé)黏蛋白及糖蛋白的產(chǎn)生，而黏蛋白及糖蛋白是防止細(xì)菌滲透的黏液性屏障，近年來(lái)，幾項(xiàng)研究已經(jīng)確定了杯狀細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)性NEC中恢復(fù)腸屏障的有效治療靶點(diǎn)，而Bo 等[38]研究結(jié)果顯示，乳汁來(lái)源的外泌體增加了體內(nèi)杯狀細(xì)胞的表達(dá)，在NEC 小鼠模型中，給予牛乳來(lái)源的外泌體后，杯狀細(xì)胞的數(shù)量增加，可防止NEC 引起的腸道損傷[39-43]。

綜上所述，乳源性外泌體參與代謝過(guò)程、發(fā)育過(guò)程、免疫系統(tǒng)過(guò)程，與生物粘附和細(xì)胞增殖有關(guān)，可以促進(jìn)腸道上皮細(xì)胞的活力，增強(qiáng)其增殖能力，并刺激腸道干細(xì)胞的活性，具有廣闊的應(yīng)用價(jià)值，補(bǔ)充外源性外泌體可以為有發(fā)生疾病風(fēng)險(xiǎn)的嬰兒提供一種有效的預(yù)防方法，尤其在無(wú)法母乳喂養(yǎng)的情況下，可有效預(yù)防NEC 的發(fā)生，減少新生兒的發(fā)病率、病死率及致殘率，為新生兒提供更好的營(yíng)養(yǎng)。