自噬在糖尿病心肌病發生中的作用

陳佳翊，黨時鵬，吳瑩，王如興

(南京醫科大學附屬無錫人民醫院心血管內科，江蘇 無錫 214023)

糖尿病是一種慢性代謝性疾病，嚴重威脅人類的健康，目前已成為全球最受關注的疾病。糖尿病可導致無基礎疾病的心肌纖維化，導致心肌重構以及心室舒張功能障礙，隨后出現收縮功能障礙，進而引起心力衰竭,即糖尿病心肌病。有調查數據顯示，1型糖尿病和2型糖尿病的心力衰竭住院率均顯著高于無糖尿病患者，且1型糖尿病男性患者30 d病死率更高[1-2]。線粒體在生理和病理情況下參與心肌細胞的多種活動，而糖尿病心肌病的發生發展過程中存在高血糖、胰島素抵抗等一系列應激，引起線粒體功能障礙，加劇心肌細胞損害，最終導致心肌組織舒張、收縮功能障礙。因此，清除受損的線粒體或許是延緩糖尿病心肌病進展的一個重要靶點[1-3]。通過溶酶體系統高度特異性地清除功能異常的線粒體，即線粒體自噬，在神經系統退行性疾病(如帕金森病、阿爾茨海默病)中已有廣泛的研究，近年來，其在惡性腫瘤、細胞衰老、骨關節炎等中的作用也逐漸被認識[4-8]。目前，線粒體自噬在糖尿病心肌病中的作用尚未完全清楚。現就線粒體自噬在糖尿病心肌病中的作用機制予以綜述，以期為臨床糖尿病心肌病的防治提供新思路。

1 自 噬

1.1自噬和線粒體自噬 自噬是一個去除異常蛋白質和細胞器的過程[9]，通過溶酶體清除錯誤折疊蛋白質、損傷的細胞器以及入侵的微生物以維持細胞自身穩態[10]。按照待降解物質運送到溶酶體的方式不同，細胞自噬分為大自噬、小自噬和分子伴侶介導的自噬[11]，此外，還有特異性的線粒體自噬、過氧化物酶體自噬、聚集體自噬、內質網自噬和核糖體自噬等。無論自噬特異性高低，均包括起始、延伸、自噬體與溶酶體融合及降解和終止等階段[12]。這些過程涉及一些相關蛋白質，如自噬相關蛋白(autophagy-related protein，ATG)6、ATG12、ATG5和ATG8、微管相關蛋白1輕鏈3和接頭蛋白等[13]。自噬的特征是形成胞內雙/多膜囊泡，即自噬小體，自噬小體包裹細胞質、蛋白質、細胞器和入侵的微生物，用于溶酶體遞送和降解[13]。線粒體對細胞內環境的改變非常敏感，內環境的劇變導致線粒體膜電位的改變，結構的完整性破壞，近年來研究發現，自噬小體對相關靶點的螯合具有高度特異性，是清除異常線粒體的主要機制，選擇性地將受損的線粒體運往溶酶體降解的過程稱為線粒體自噬，線粒體自噬是特殊的大自噬，已證明是重要的心臟保護過程。哺乳動物體內線粒體自噬常見的調控途徑主要有3種:PTEN誘導假定激酶1(PTEN-induced putative kinase 1,PINK1)/Parkin信號通路、B細胞淋巴瘤/白血病-2/腺病毒E1B相互作用蛋白3(B-cell lymphoma/leukemia-2/adenovirus E1B interacting protein 3,BNIP3L/Nix)途徑和攜帶FUN14結構域蛋白1(FUN14 domain containing 1,FUNDC1)途徑[13]。

1.1.1PINK1/Parkin信號通路 PINK1/Parkin信號通路是經典的線粒體自噬通路，PINK1是Pink1基因編碼的一種絲/蘇氨酸激酶,定位于線粒體外膜。Parkin是由PARK2基因編碼的“環間環”型泛素連接酶(E3酶)家族成員[14]。其中上游的PINK1和下游的Parkin協同介導線粒體自噬。線粒體受損時，PINK1進入內膜受阻而在線粒體外膜積聚，PINK1自身發生磷酸化同時使線粒體外膜上的泛素位點磷酸化，繼而招募胞質的Parkin，活化后的Parkin將泛素連接到線粒體外膜蛋白質上，為PINK1募集更多的磷酸化底物，形成正反饋，誘導線粒體自噬[14]。PINK1/Parkin信號通路在心臟線粒體質量控制中起重要作用，Mu等[15]發現，在高脂飲食喂養誘導的2型糖尿病小鼠心肌細胞中，PINK1蛋白的表達顯著降低，自噬受到抑制，可見明顯的心室肌肥厚、心室肌細胞肥大、間質纖維化、脂質堆積以及心肌細胞凋亡。然而，在食物加入含溴結構域蛋白抑制劑三苯甲烷三異氰酸酯后，PINK1表達可恢復到正常水平，上述病理學改變顯著改善。Guo等[16]在細胞實驗中模擬2型糖尿病時胰島β細胞受損的狀態，也發現通過PINK1/Parkin信號通路依賴性線粒體自噬可有效抑制脂毒性誘導的胰島β細胞衰竭，增加胰島素分泌，改善線粒體功能障礙和炎癥反應。

綜上所述，PINK1/Parkin信號通路與糖尿病心功能不全相關，可能是糖尿病心肌病治療的一個重要靶點。

1.1.2BNIP3L/Nix途徑 線粒體自噬的另一個重要途徑是BNIP3L/Nix途徑，BNIP3L/Nix屬于抗凋亡蛋白Bcl-2家族成員[17]。BNIP3L/Nix途徑與PINK1/Parkin信號通路可相互調節，介導線粒體自噬[18]。BNIP3L/Nix作為蛋白受體在線粒體外膜上表達，與微管相關蛋白1輕鏈3相互作用介導自噬[19]。此外，BNIP3L/Nix可通過破壞Bcl-2與Beclin1基因編碼的卷曲螺旋蛋白Beclin1結合誘導自噬[17]。據報道,Beclin1是ATG6的同源蛋白，參與誘導線粒體自噬[17]。Bcl-2與Beclin1結合可抑制自噬。而BNIP3L/Nix同Beclin1競爭，與Bcl-2結合，從而釋放出游離的Beclin1，誘導自噬。但是也存在一些矛盾現象，在BNIP3L/Nix途徑缺陷的網織紅細胞中并不影響自噬的形成，提示一些細胞中的BNIP3L/Nix途徑可能不影響Beclin1的作用[17]。在BNIP3L/Nix敲除后的衰老心肌細胞中發現了異常的線粒體自噬，自噬囊泡的形成過程也出現了異常，而BNIP3L/Nix途徑介導的自噬通過激活哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)依賴的胰島素信號脫敏而保護心肌細胞免受營養儲存應激的影響[19-20]。

1.1.3FUNDC1途徑 心肌細胞富含線粒體，FUNDC1是定位于線粒體外膜的一種受體蛋白，與BNIP3L/Nix相同，它能與微管相關蛋白1輕鏈3特異性結合觸發線粒體自噬。FUNDC1-微管相關蛋白1輕鏈3相互作用區域中第17位絲氨酸、第13位絲氨酸和第18位酪氨酸的磷酸化與去磷酸化決定了FUNDC1與微管相關蛋白1輕鏈3結合的緊密程度。一般情況下，FUNDC1中的第13位絲氨酸和第18位酪氨酸被相應的激酶磷酸化，兩者的高度磷酸化抑制其與微管相關蛋白1輕鏈3的相互作用，從而防止線粒體自噬發生。應激狀態下，第17位絲氨酸發生磷酸化，同時使第13位絲氨酸和第18位酪氨酸去磷酸化，增強了FUNDC1與微管相關蛋白1輕鏈3的相互作用并誘導線粒體自噬[18]。FUNDC1似乎是維持正常心臟功能所必需的，但在應激條件下FUNDC1增加會導致心肌病變。Wu等[21]發現，1型糖尿病小鼠心肌細胞中FUNDC1蛋白水平顯著升高，增加了線粒體對Ca2+的攝取，導致線粒體內Ca2+增加和線粒體功能障礙。而FUNDC1的缺失可以防止高血糖誘導的線粒體Ca2+增加和線粒體碎裂等。有研究顯示，線粒體自噬是成人心臟祖細胞分化的關鍵環節，且這種線粒體自噬由線粒體蛋白受體BNIP3L/Nix和FUNDC1調節，不依賴PINK1/Parkin途徑，而敲除BNIP3L/Nix和FUNDC1受體會導致線粒體受損，增加細胞凋亡的易感性[22]。

線粒體自噬可能涉及基于細胞的療法，有修復和再生受傷的心肌組織以防止進展為心力衰竭的可能。

1.2替代性自噬 典型的大自噬如線粒體自噬始于自噬小體的形成，自噬小體的形成需要包括Atg5和Atg7在內的一組基因。替代性自噬是形成自噬小體過程中不依賴于Atg5和Atg 7基因的一種特殊的自噬。Nishida等[23]發現，在同時缺乏Atg5和Atg 7基因后，細胞內仍有自噬小體形成，并將線粒體運輸到溶酶體降解[24]。非典型自噬的自噬小體形成取決于ras樣小鳥苷三磷酸結合蛋白9(ras-like small GTP-binding protein 9，Rab9)，也受到unc-51樣自噬激活激酶1和Beclin1的調控[25]。Xu等[26]研究表明，Beclin1是啟動典型自噬所必需的蛋白，在敲除Beclin1基因的1型糖尿病小鼠心肌細胞中，Rab9表達增加，Rab9與溶酶體的共定位增加。因此，當經典自噬被抑制時，替代自噬可能會被上調，這可能是糖尿病心肌的保護機制之一。此外，小自噬與分子伴侶介導的自噬在糖尿病心肌病發生發展中的具體作用尚未明確。替代性自噬與其他高度選擇性自噬之間的聯系以及糖尿病心肌中其他非典型自噬途徑的作用還有待探索。

2 自噬與糖尿病心肌病

糖尿病伴隨著能量代謝紊亂，葡萄糖氧化減少而脂肪酸氧化增加[27]，這意味著心臟活動的主要能量幾乎均源自線粒體脂肪酸氧化，氧化底物的改變導致脂肪酸代謝失衡，進而發生線粒體功能障礙[28]。同時，糖尿病高血糖環境產生大量自由基，誘導線粒體發生氧化應激，線粒體功能障礙進一步促使心肌細胞凋亡。心肌細胞作為心肌組織的收縮單位，其凋亡觸發細胞肥大、纖維化等一系列反應，引起心肌舒張和收縮功能障礙，加劇心力衰竭[29-30]。細胞凋亡又稱程序性細胞死亡，是一種可調節的、非炎癥性的細胞死亡途徑。細胞凋亡主要有兩條途徑，即外源性凋亡途徑和內源性凋亡途徑。內源性途徑又稱為線粒體途徑，線粒體蛋白如細胞色素C釋放到胞質中，與凋亡蛋白酶激活因子-1結合促使其發生寡聚，接著招募胱天蛋白酶9形成稱為“凋亡體”的復合體，作為切割和激活下游細胞凋亡蛋白酶的平臺，隨之而來的是廣泛的蛋白質水解，進而導致細胞凋亡。線粒體介導的細胞凋亡受線粒體膜蛋白Bcl-2和Bcl-2相關X蛋白調節，其分別起到抑制和激活凋亡作用[31-32]。糖尿病心肌病發生發展中細胞凋亡和線粒體自噬是普遍現象[33]。He等[34]發現，高血糖誘導心肌細胞凋亡并抑制自噬是通過促進Beclin1和Bcl-2之間的相互作用而調節凋亡的細胞能量感受器，AMP活化的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)激活使處于高糖環境中心肌細胞的自噬增加，同時減少心肌細胞凋亡。總之，心肌細胞凋亡和自噬密切關聯，自噬及線粒體自噬可能作為減少心肌細胞凋亡，延緩糖尿病心肌病進展的重要中間介質。

不同類型的糖尿病心肌細胞中的自噬不同。1型糖尿病中胰島素缺乏伴隨的高血糖抑制自噬[26]，而不同條件誘導的2型糖尿病中自噬的表現更加復雜，如高脂飲食誘導的2型糖尿病與果糖誘導的2型糖尿病自噬活性相反[25]。

2.1自噬對1型糖尿病心肌病的影響 1型糖尿病由于缺乏胰島素導致血糖控制不佳，有較高的糖尿病心肌病發生傾向。雖然最初引發1型糖尿病心臟氧化代謝失衡的機制尚未清楚，但已有學者認為叉頭框蛋白O1在其中起了重要作用。叉頭框蛋白O1在糖尿病心臟中十分活躍，一方面通過上調丙酮酸脫氫酶激酶4使丙酮酸脫氫酶磷酸化失活，進而降低葡萄糖氧化率。另一方面，通過上調相關脂肪酸轉運酶和脂肪酸氧化酶表達增加線粒體對脂肪酸的攝取，提高脂肪酸氧化率，最終導致氧化代謝失衡，觸發線粒體氧化應激、線粒體功能障礙和心肌細胞凋亡[35]。功能障礙的線粒體和心肌細胞觸發自噬被溶酶體系統選擇性地清除，研究表明，1型糖尿病動物心肌細胞中自噬受到抑制[36-37]。但自噬減少似乎是一種適應性反應，可減輕1型糖尿病的心肌損傷[25]。Xu等[26]通過評估微管相關蛋白1輕鏈3Ⅱ水平發現，Beclin1和Atg16基因敲除的1型糖尿病小鼠心肌自噬受到抑制，但小鼠的心肌細胞中氧化應激減輕，引起心肌細胞凋亡水平降低和間質纖維化的減少，從而改善心功能。相反，Beclin1過表達使糖尿病小鼠死亡率升高。這些作用與Rab9在線粒體內的定位及其與溶酶體共定位有關，Rab9是非經典替代自噬途徑的基本調節劑。另外，Huang等[37]發現高血糖抑制1型糖尿病小鼠心肌細胞中自噬的降解階段而非起始階段。以上研究表明，自噬活性減弱是一種適應性反應，可緩解心肌損傷，而非典型自噬的上調可改善1型糖尿病的心肌功能障礙。

2.2自噬對2型糖尿病心肌病的影響 2型糖尿病時，心臟暴露在胰島素抵抗、高血糖、高血脂的環境中，心肌線粒體氧化脂質不斷堆積，線粒體功能降低，早期心肌舒張功能受損，細胞水腫、炎癥以及凋亡，而后逐漸進展為心功能不全乃至心力衰竭[38-39]。目前自噬對2型糖尿病心肌損傷作用的研究結果尚不一致[25]。研究發現，高脂飲食誘導的肥胖和代謝綜合征可抑制心臟自噬[25,40-42]。給Atg7敲除小鼠和Parkin敲除小鼠喂食高脂飲食2個月，評估心臟功能發現，與正常對照組小鼠相比，Atg7和Parkin缺失減少了心肌細胞內線粒體自噬并加劇2型糖尿病心肌病變，在高脂飲食的最后2周對小鼠注射可誘導自噬的轉錄反式激活因子Beclin1肽，發現自噬增加可改善心室舒張功能和線粒體耗氧率，并減少心肌細胞內脂質積聚[40,42]。以上研究提示在高脂飲食誘導的2型糖尿病小鼠中，適度增強線粒體自噬可減輕高脂飲食的細胞毒性作用，減緩糖尿病心肌病進展，從而保護心肌。此外，蛋白激酶B(protein kinase B,PKB/Akt)2基因敲除可抑制高脂飲食的小鼠自噬負調控因子mTOR復合物1(mTOR complex 1,mTORC1)活化，增強心臟自噬，并使心室肌肥厚減少和心功能改善[25,43]。脂聯素缺乏會增加高脂飲食誘導的p62積累，并加劇高脂飲食誘導的心臟重構和功能障礙，雷帕霉素治療可緩解這些有害作用[40]。這些研究結果表明，在喂食高脂飲食的2型糖尿病小鼠中，抑制心肌細胞mTORC1活化可增強自噬，從而起到保護心肌的作用。

在果糖喂養誘導的2型糖尿病小鼠中，胰島素抵抗和高血糖可激活心肌細胞線粒體自噬[44]。Russo等[45]報道，以乳脂為基礎的飲食可激活小鼠的心肌細胞自噬并誘發心肌肥厚。這兩項研究提示，自噬的增強可能會加劇2型糖尿病中的心肌損傷，然而這一研究結果尚須通過使用自噬缺陷型小鼠模型進行驗證。

2.3糖尿病心肌病中自噬的調節機制 AMPK是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，通常稱為細胞“代謝主開關”，普遍存在于心臟、腎臟、肝臟、大腦和骨骼肌等器官組織，研究表明AMPK與糖尿病心肌代謝和線粒體自噬關系密切[46-48]。抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bcl-2細胞死亡相互作用調節因子可通過與Beclin1的結合破壞自噬小體的形成，從而抑制Beclin1依賴的自噬，而這一過程可被c-Jun氨基端激酶1所阻斷，該激酶誘導Bcl-2或Bcl-2細胞死亡相互作用調節因子磷酸化，使其與Beclin1解離，促進自噬。Yao等[36]發現激活的AMPK作為c-Jun氨基端激酶1的上游激酶，誘導Bcl-2或Bcl-2細胞死亡相互作用調節因子與Beclin1解離，進而調節糖尿病心肌組織中的凋亡和自噬。此外，激活的AMPK還通過磷酸化mTORC1及其下游p70核糖體蛋S6K1和4E結合蛋白1來抑制mTOR信號轉導,mTOR是一種負向調節自噬的蛋白激酶。Xu等[49]的研究也表明，激活的AMPK對糖尿病心臟有保護作用。總之，在糖尿病心肌病中AMPK/mTORC1/磷酸化70核糖體蛋S6K1/4E結合蛋白1和AMPK/Jun氨基端激酶1/Bcl-2(或Bcl-2細胞死亡相互作用調節因子)-Beclin1是調節自噬的兩條重要信號通路，AMPK調節已在糖尿病及其心血管并發癥中顯示出有益作用，其激動劑在糖尿病和糖尿病并發癥中具有潛在的治療作用。另一條通路，磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)/Akt/mTOR信號通路對于細胞的成活、凋亡和自噬至關重要，近年有學者發現，糖尿病過程中晚期糖基化終末產物通過晚期糖基化終產物受體抑制PI3K/Akt/mTOR通路,誘導大鼠心肌細胞自噬，并通過細胞實驗證實抑制自噬對晚期糖基化終末產物誘導的心功能障礙起保護作用[50]。而去乙酰化酶3(Sirtuin 3,Sirt3)主要位于線粒體內，調節受損細胞器的清除和保持能量平衡[51-52]。通過上調Sirt3，增加自噬，可減輕鏈脲佐菌素誘導的糖尿病小鼠的心功能障礙。Sirt3對AMPK的活化具有積極調節作用，但Sirt3是否可以通過激活AMPK/mTOR途徑來刺激心肌細胞線粒體自噬尚不清楚[51,53-54]。哺乳動物無菌20樣激酶1已被證實可在上游抑制Sirt3，調節自噬和凋亡，參與糖尿病心肌病的進展，Wang等[3]認為哺乳動物無菌20樣激酶1/Sirt3通過PINK1/Parkin信號通路可增強線粒體自噬，改善心功能不全。因此，哺乳動物無菌20樣激酶1/Sirt3可能是糖尿病心肌病的潛在治療靶點。

AMPK、mTOR、Sirt3是線粒體自噬在糖尿病心肌病進展過程的重要調節蛋白，這3種蛋白涉及的信號通路是否有更多的交集尚待實驗證實。

3 自噬在糖尿病心肌病研究中的意義

目前，越來越多的研究關注線粒體自噬及其相關信號通路在糖尿病心肌病發生發展中的作用及其機制。通過PINK1/Parkin信號通路、BNIP3L/Nix途徑和FUNDC1途徑以及近年新發現的替代性自噬清除受損的線粒體，改善糖尿病能量代謝紊亂，可減少心肌細胞凋亡，從而對心肌細胞具有重要保護作用。例如免疫抑制劑雷帕霉素抑制2型糖尿病小鼠心肌細胞mTORC1活化，增強自噬可達到心肌保護目的，但過多的mTORC1抑制會對其他器官產生有害的影響，因此雷帕霉素的確切作用尚待探索。二甲雙胍作為臨床常見降糖藥，也是AMPK激動劑，具有自噬激活潛力，發揮心臟保護作用，延緩糖尿病心肌病發生發展的確切作用有待進一步證實[55]。而粒細胞集落刺激因子的抗心肌細胞凋亡作用可能與糖尿病心肌病中自噬的上調顯著相關[56]。目前在糖尿病心肌病中尚缺乏明確的自噬靶向藥物，且如何控制線粒體自噬處于一種合理且平衡的水平還有待進一步研究。因此，開發一種安全有效、心臟高度選擇性的自噬干預藥物或許能在糖尿病初期預防糖尿病心肌病，改善糖尿病心肌病預后，降低病死率。

4 小 結

糖尿病時持續高血糖導致能量代謝紊亂，破壞線粒體的結構和功能，線粒體自噬高度選擇性地清除受損的線粒體。然而典型自噬在1型糖尿病心臟中受抑制，自噬的減少在1型糖尿病是一種適應性變化，對心肌細胞有一定的保護作用。而在高脂飲食誘導的2型糖尿病中，典型自噬增加有一定的心肌保護作用，與之相對的是果糖和乳脂誘導的2型糖尿病中，典型的自噬增加會加劇心肌損傷。因此在不同類型糖尿病中適當地抑制或誘導自噬，可減少心肌細胞凋亡，從而延緩糖尿病心肌病的發生發展。