絲氨酸/絲氨酸激酶信號通路與腦出血關系的研究進展

張 策，鄒 偉

腦出血(intracerebral hemorrhage，ICH)指非外傷性的腦實質內出血，發病后多遺留嚴重的神經功能損傷[1]。神經元死亡是其中重要的病理因素。絲氨酸(Rho)/Rho激酶信號通路是可調節細胞骨架關鍵蛋白-肌動蛋白聚合解聚狀態的重要信號通路，參與一系列的細胞生理過程且與多種腦血管疾病的發病過程密切相關。現對Rho/Rho激酶信號通路的基本生物學特征、生理學作用及其與腦出血的關系進行綜述。

1 Rho/Rho激酶信號通路基本生物學特征

1.1 Rho A Rho蛋白-Ras相關單體鳥嘌呤-5′-三磷酸(GTP)酶可被多個上游分子所活化，調節細胞外刺激介導信號傳導系統，參與肌動蛋白的組織和周期的調節。Rho A是Rho家族(Rho A、Rho B、Rho C等)中最重要、最直接的一個Rho激酶，上游刺激信號調控如神經突、軸突生長、樹突形成、神經元遷移等，還影響著細胞分化、黏附、遷移、增殖、凋亡等細胞功能[2]。在中樞神經系統中肌動蛋白的聚合重組作用是神經元軸突的延伸推動細胞膜向前移動的必要條件[3]，減少Rho A的表達可以降低其對神經受損后重塑的抑制作用。在軸突和突觸重塑的過程中Rho A能夠激活下游Rho相關激酶的信號傳導活化后的Rho A，可以與其下游信號通路上的10多種蛋白結合而產生不同的生物效應。

1.2 Rho相關激酶(Rho-associated kinase，ROCK)Ⅱ Rho下游通路上的信號分子ROCK，是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族成員，是細胞再生、增殖、凋亡、轉錄和分化的關鍵分子[4]。ROCK主要有兩個亞型，分別是ROCK Ⅰ或稱ROK β、ROCK-1、P160-ROCK，主要分布在心臟、血管和骨骼肌等[5]；另一個是ROCK Ⅱ或稱ROK α、ROCK-2[6]；主要在中樞神經系統的皮質、海馬中表達[7]。ROCK Ⅰ蛋白和ROCK Ⅱ蛋白的氨基酸同源率高達65%，與Rho蛋白結合域(Rho-binding domain，RBD)的同源率高達58%[8]。ROCK的激酶活性在靜息狀態下具有一定的自我抑制，其羧基端主要起抑制作用；其活性端主要位于氨基酸，活性端與Rho A結合后，空間結構暴露活性中心，從而表現出催化活性作用[9]。

1.3 Rho-kinase效應分子 Rho激酶的下游靶分子包括肌球蛋白輕鏈(myosin light chain，MLC)、肌球蛋白輕鏈磷酸酶(myosin light chain phosphatase，MLCP)等[10]。其中MLC是ROCK的作用點位之一，可直接作用于Rho激酶。一方面，MLCP在肌球蛋白結合亞基(myosin-binding subunit，MBS)參與的條件下，與磷酸化肌球蛋白輕鏈(phospho-myosin light chain，p-MLC)聯結[11]，或直接磷酸化MLC[12]，使其脫磷酸；另一方面，Rho激酶激活后磷酸化肌球蛋白結合亞基，使MLCP失活[13]，MLC磷酸化水平升高，血管痙攣[14]，但可被Rho激酶抑制劑所翻轉[15]。

1.4 Rho/Rho激酶信號通路的生物學作用 Rho/Rho激酶信號通路中的主要信號分子為Rho GTP酶、ROCK和MLCP。Rho激酶激活途徑主要有兩種：一是通過異源三聚體G蛋白偶聯受體(G protein coupled prot，GPCR)、受體酪氨酸激酶(receptor protein tyrosine kinase，RPTKs)及細胞因子受體(cytokine receptor)的活化[16]；二是通過細胞黏附(cell adhesion)及整合素/整聯蛋白(integrin)的激活及鳥苷酸交換因子(guanine nucleotide exchange factors，GEFs)、GTP 酶激活蛋白(GTPase activating proteins，GAP)和GDP解離抑制蛋白(GDP dissociation inhibitor，GDI)的共同調節作用完成[17]。三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)作用于Rho激酶后，使其磷酸化，促使Rho釋放二磷酸鳥苷(guanosine diphosphate，GDP)，活化成Rho GTP酶后與ROCK的Rho蛋白結合，改變了Rho激酶的空間構型，暴露活性點位，激活Rho激酶[18]，從而導致血管收縮，引發相關腦血管疾病。Rho/Rho激酶信號通路通過Rho與GTP酶結合激活下游ROCK，并進一步磷酸化ROCK下游底物，重塑細胞骨架、誘導肌動蛋白絲(actin filament)穩定和肌動蛋白-肌球蛋白收縮組合肌動蛋白網和肌球蛋白纖維調節微管動力[19]。

2 Rho/Rho激酶信號通路的生理學作用

2.1 Rho/Rho激酶信號通路對炎性因子的影響 分子免疫學和分子生物學研究認為，腦水腫的形成可在顱腦損傷后急性期/神經源性炎癥反應下持續加重[20]。中樞神經系統(CNS)的細胞釋放或聚集具有神經毒性的內源性炎性因子[如白細胞介素-1β(1L-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等][21]，引起血-腦屏障破壞，加重腦水腫和神經元凋亡[22-24]。Li等[25]發現神經系統炎癥反應、細胞死亡和腦水腫可由1L-1β、TNF-α引起。龔浩等[26]的研究發現，血清TNF-α水平能輔助判斷急性腦出血病人近期預后情況，且與其神經功能損傷密切相關。

Rho/Rho激酶信號通路激活后，通過與炎癥反應的相互作用使血管內皮通透性增高，單核巨噬細胞和炎性因子穿過腦血管[27]，加重炎癥反應及腦水腫程度。TNF-α可直接破壞細胞間緊密連接，增加血-腦屏障通透性，也可通過其受體激活Rho GTP酶，促進MLC磷酸化，提高平滑肌對Ca2+的敏感性，血管平滑肌收縮，加重腦水腫細胞毒性。Chen 等[28]研究發現，Rho GTP激酶抑制劑可轉錄白細胞介素-6(IL-6)mRNA，減少1L-1β、TNF-α、IL-6等炎性因子的產生。Rho激酶還參與白細胞與內皮細胞間“對接”結構的形成等炎癥反應過程[29-30]。Rho激酶通過調節炎癥反應參與了血腦屏障的破壞和顱腦損傷后腦水腫。

2.2 Rho/Rho激酶信號通路對血管和組織內皮通透性的影響 ROCK介導的細胞骨架收縮性可調控緊密連接蛋白claudin-5的連接點位和連接穩定性，由此保護淋巴內皮屏障的完整性[31]。磷酸化MLC(p-MLC)水平升高及去磷酸化均可導致血管屏障的破壞，p-MLC受細胞內Ca2+濃度影響，通過內源性(如組胺、凝血酶、血管內皮生長因子及脂多糖)和外源性(如機械作用)刺激而被激活后的RhoA與ROCK結合促進鈣調蛋白(calmodulin，CaM)形成[32]，從而增加細胞內Ca2+濃度，活化肌球蛋白輕鏈激酶(myosin light chain kinase，MLCK)，由此升高了p-MLC水平[33]；磷酸化的MLCP抑制p-MLC去磷酸化，增加血管內皮通透性，破壞血管屏障[34-35]。此外，Rho/Rho激酶信號通路激活后可以破壞緊密連接，表現在血管時可有血管屏障受損，表現在腸內皮細胞時可有腸壁通透性增加、屏障受損[36]。

2.3 Rho/Rho激酶信號通路對組織收縮及生長的影響 Rho/Rho激酶信號通路可以誘導組織對Ca2+敏感性增加，增強平滑肌細胞收縮[37]并誘導MLCP和MLC磷酸化，ROCK Ⅱ是該過程中起主導作用的亞型[38]。在病理情況下這種多重效應可能導致血管痙攣，誘發腦出血。ROCK Ⅱ通過黏著斑(focaladhesion)的形成和成熟調節成肌細胞的定向移動，促使骨骼肌的生長和再生[39]。Rho/Rho激酶信號通路還可調控神經細胞生長錐和軸突再生和突觸的數目結構[40]。因此，Rho/Rho激酶信號通路的失活，神經生長抑制因子釋放減少，中樞神經損傷后突觸再生，減輕軸突損傷，神經細胞軸突生長錐(growth cone)的體積增加、運動性提高、軸突延伸過程啟動，對治療腦出血中神經損傷有重要意義。

3 Rho/Rho激酶信號通路對血-腦屏障的破壞

血-腦屏障能控制腦內物質交換，維持腦內穩態，保證中樞神經系統功能的正常發揮，而內皮細胞間的緊密連接(tight junctions，TJs)對于微環境的改變更加敏感，是血-腦屏障功能變化的基礎，使腦微血管內皮細胞(brain microvessel endothelia cells，BMECs)緊密相連發揮血-腦屏障的屏障作用。Rho/Rho激酶信號通路的激活，與血-腦屏障內皮功能損傷有重要聯系，對緊密連接和內皮細胞屏障有反向調節作用[41]。參與構成血-腦屏障緊密連接成分的閉合蛋白-5(claudins-5)，在腦血管內皮細胞中高度表達，對調節血-腦屏障通透性起關鍵作用。研究表明，ROCK活化后，使p-MLC水平上調，緊密連接屏障功能降低，claudin-5蛋白表達減少，或上調基質金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinases-9，MMP-9)的表達，降低基底膜導致的血-腦屏障通透性增加，擴大腦水腫，促進炎性細胞浸潤及不斷進展[33，42]。在腦微血管內皮細胞中抑制該通路能誘導咬合蛋白(occludins)和claudin-5的磷酸化[43]。因此，Rho/Rho激酶信號通路對維持血-腦屏障結構完整性具有重要作用[44]。

4 Rho/Rho激酶信號通路與腦出血

血-腦屏障被破壞是腦出血所致腦損傷的重要標志[45]。腦出血后血腦屏障被破壞，白細胞的流入以及潛在的神經活性物質進入大腦組織可導致腦損傷[46]。炎癥介質反應(如炎性細胞和趨化因子)、凝血酶的釋放、血紅蛋白降解產物、氧自由基的活性、補體系統的平衡以及基質金屬蛋白酶的水平升高，并在數小時內在血腫周圍引起水腫[47]。此外，腦出血后Rho/Rho激酶信號通路被激活，Rho A與ROCK Ⅱ結合，使p-MLC水平升高，血-腦屏障功能減弱，緊密連接蛋白發生解體，腦微血管內皮細胞通透性增加進而形成腦水腫[48-49]。在中樞神經系統中[50]，Rho/Rho激酶信號通路還可介導氧化應激，使氧自由基的生成增多、抑制神經細胞再生。腦出血后，Rho/Rho激酶信號通路對內皮細胞黏附分子的表達，血管平滑肌的收縮與舒張以及相關細胞遷移等作用動態和持續，促進腦血管重構[51-52]。因此，Rho/Rho激酶信號通路在血-腦屏障被破壞的病理過程中扮演了重要角色。

5 Rho/Rho激酶信號通路抑制劑與腦出血

5.1 Rho/Rho激酶信號通路抑制劑的作用機制 Rho/Rho激酶參與腦出血病理機制的發生發展過程，血鈣離子濃度異常能夠激活細胞表面受體，使Rho蛋白從胞漿轉位至細胞膜并與三磷酸鳥苷結合后活化，損傷神經與內皮細胞。Rho/Rho激酶信號通路抑制劑可作用于多個靶點，通過降低炎癥反應、氧自由基產生提升Ca2+濃度拮抗凝血等作用，實現逆轉神經元損害，改善輕度認知功能障礙；通過調節血管內皮細胞氧化應激和緊密連接，保護血管內皮細胞的通透性，修復血-腦屏障功能等[53-54]。法舒地爾是異喹磺酰胺類藥物，是目前唯一應用于臨床的新型Rho激酶抑制劑，其他類抑制劑僅限于實驗研究。

法舒地爾作為Rho/Rho激酶信號通路抑制劑，是治療腦血管痙攣的一種強效血管擴張劑，能雙重抑制磷酸化，包括Rho激酶系統、MLCP等，進而抑制炎癥反應、自由基形成，促進神經損傷后修復。法舒地爾易與Rho激酶催化結構中的ATP結合位點相結合，因此，對Rho的選擇抑制性較強并且能在無Ca2+的情況下，抑制腎上腺素受體(adrenergic receptors，ARs)活化引起的血管痙攣[55]。

5.2 Rho/Rho激酶信號通路抑制劑在腦出血中的作用 目前，腦出血內科治療措施主要包括安靜臥床，避免情緒波動；以脫水、降顱壓為治療基礎，亞低溫治療為輔；保持呼吸道通暢、調整血壓與血糖、止血等。但臨床療效不佳，總體預后差。多項關于腦出血臨床療效及動物實驗研究證明，法舒地爾一方面能有效縮小腦水腫體積，維護血-腦屏障[56]；另一方面改善腦出血后遺癥期腦內物質能量代謝，減少有害代謝產物堆積[57]。

2011年，宋明浩等[58]對78例腦出血病人的研究發現，法舒地爾組病人格拉斯哥昏迷量表評分、格拉斯哥預后量表評分、腦水腫體積明顯優于常規治療組。2015年，Lee等[59]建立腦出血大鼠模型，采用Wharton氏膠質源性骨髓間充質干細胞，證明法舒地爾可促進腦出血后神經功能的恢復。該過程可能是通過促進膠質源性神經營養因子的表達從而使其向類神經元細胞分化。2017年，Dang等[60]研究發現，法舒地爾能保持腦出血大鼠模型血腦屏障的完整性，以及MMP-9引起血管基質降解。2018年，Akhter等[5]的實驗研究表明，法舒地爾對Rho激酶參與腦出血病理過程存在一定的保護作用。Zhou等[61]的實驗研究證實法舒地爾通過抑制Rho/Rho激酶信號通路，使內皮細胞穩定，減少出血發生和縮小出血面積，從而改善腦出血病人預后。2019年，游海鋒[62]對74例高血壓腦出血術后病人采用醒腦靜聯合鹽酸法舒地爾治療，結果顯示，可改善神經功能和認知功能，促進意識恢復。2019年日本卒中中心的一份關于質量指標及其測量的可行性一文中指出，法舒地爾可減輕腦血管痙攣[63]。

6 小 結

腦出血發病機制復雜[47]。在其病理變化過程中，腦水腫是否發生及其發生程度極大地影響了病情發展及轉歸。腦出血發生后，通過降低Rho/Rho激酶信號通路的活性，可改善血流狀態，抑制炎癥介質的釋放，改善神經細胞功能，調節認知障礙。以Rho/Rho激酶信號通路作為腦出血后神經元損傷的干預靶點，分析Rho/Rho激酶信號通路抑制劑(法舒地爾)的作用機制，對腦出血的治療具有重要的臨床意義。