高脂飼料對不同月齡小鼠骨質疏松的影響

陽玉珍 馮湘玲 張妍薇 孫玥 許菁菁 陳繼華

中南大學湘雅公共衛生學院，湖南 長沙 410078

骨質疏松癥(osteoporosis，OP)是一種以骨量低、骨組織退化和骨結構破壞為特征的常見骨骼疾病，容易導致骨質疏松性骨折[1-2]。骨質疏松與年齡增長有關，隨著我國人口老齡化日趨嚴重，其已成為我國嚴重的公共衛生挑戰[3]。有研究預測，在2050年我國骨質疏松性骨折患者將接近600萬人，這將成為我國沉重的經濟負擔[4]。因此越來越多研究關注老年人骨健康。

近年來有研究表明肥胖可加劇骨質疏松，高脂飲食可抑制老年人和大鼠骨骼系統中成骨細胞形成，降低骨礦物質含量，從而對骨質量產生負作用[5-6]。也有研究發現高脂飼料喂養的小鼠骨小梁較正常飼料組稀疏，小鼠內臟脂肪/體重的值與骨密度呈負相關，提示高脂飲食所致的肥胖可能會引起骨質破壞，而高脂飲食引起的炎癥介質表達上調及氧化應激增加可能是骨質破壞的原因之一[7]。但高脂飲食在不同年齡階段對機體骨骼系統的影響是否一致，目前尚無明確結論。因此，本研究擬用正常和高脂飼料喂養2月齡和8月齡小鼠，觀察不同飼料對不同月齡小鼠血脂、氧化應激和炎癥水平、骨代謝及骨微觀結構等指標的變化，比較高脂飼料對不同月齡小鼠骨骼健康的影響，為進一步明確高脂飲食對不同月齡小鼠骨質量的影響提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1實驗動物及材料：SPF級2/8月齡雄性C57BL/6J小鼠購于北京維通利華動物實驗技術有限公司，動物許可證號SCXK(京)2016-0006。動物飼料購買于Research Diets公司，高脂和正常飼料分別采用60%脂肪供能(D12492)和10%脂肪供能(D12450J)的小鼠飼料。所有程序經中南大學湘雅公共衛生學院動物倫理委員會批準(倫理編號：XYGW-2018-14)。

1.1.2主要實驗試劑與設備：EDTA脫鈣液(Boster，美國)；甘油三酯測定試劑盒、總膽固醇測定試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇測定試劑盒、低密度脂蛋白膽固醇測定試劑盒(南京建成，中國)。全波段酶標儀(賽默飛，美國)；倒置熒光顯微鏡(Invitrogen，美國)等。

1.2 實驗方法

1.2.1動物飼養：2月齡和8月齡雄性C57BL/6J小鼠各16只，適應性喂養2周后，均隨機分為兩組，每組8只，分別為6月齡正常飼料組、6月齡高脂飼料組、12月齡正常飼料組、12月齡高脂飼料組。喂養16周后處死，進行后續實驗。

1.2.2標本的采集與處理：小鼠喂養結束后摘眼球取血，全血在4 ℃靜置8 h，于3 000 r/min離心15 min后收集上層血清。小鼠左側股骨用含生理鹽水紗布包裹后置于-20 ℃，右側股骨用4%多聚甲醛固定。

1.2.3血脂指標檢測：用生化檢測試劑盒檢測總膽固醇(TG)、甘油三酯(TC)、低密度脂蛋白肝固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白肝固醇(HDL-C)水平。取血清加至96孔板，加入工作液后37 ℃水浴，于510 nm或546 nm波長下檢測吸光度值。

1.2.4葡萄糖耐量試驗和胰島素耐量試驗：小鼠飼養第15周時進行葡萄糖耐量試驗(GTT)和胰島素耐量試驗(ITT)：小鼠禁食12 h后自由飲水，以2 g/kg體重腹腔注射葡萄糖溶液和0.6 U/kg體重腹腔注射胰島素溶液，分別在注射前和注射后15、30、60、120 min進行尾靜脈采血，血糖試紙檢測血糖濃度。

1.2.5氧化應激、炎癥和骨代謝標志物檢測：用ELISA試劑盒檢測小鼠血清中白細胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和Ⅰ型前膠原N端前肽(PINP)、Ⅰ型前膠原C端肽(CTX-1)的水平。用生化試劑盒檢測血清中超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)。將血清樣品或標準品加至96孔板，37 ℃孵育2 h，加入各工作液和洗滌液并棄掉，加入終止液混勻后于450 nm波長下檢測吸光度值。

1.2.6微計算機斷層掃描技術：使用微計算機斷層掃描技術(Micro-CT)對小鼠左側股骨遠端進行掃描。設定掃描參數：60 kV，133 uA，單次曝光時間500 ms，掃描分辨率9 μm，掃描角度間隔0.5度。掃描完成后分析骨體積分數(BV/TV)、骨表面密度(BS/TV)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁間隙(Tb.Sp)等指標。

1.2.7骨組織形態學觀察：將多聚甲醛固定后的股骨至于EDTA脫鈣液中，將成功脫鈣的骨組織送至武漢塞維爾生物科技有限公司進行包埋、切片及HE染色。將HE染色片置于顯微鏡下拍照。每組在骨小梁附近隨機選取3個100×鏡下視野對破骨細胞計數。

1.2.8質量控制：實驗中各小鼠均隨機分組，飼養溫室(22±2)℃，濕度50%～60%，12 h明暗交替，自由攝食、飲水。各指標隨機選取至少3只小鼠標本進行檢測，各組樣品檢測在同樣條件下進行。

1.3 統計學分析

采用SPSS 18.0進行統計學分析，結果用均數±標準差表示，采用單因素方差分析進行多組間的比較，LSD法進行兩兩比較，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 高脂飼料對不同月齡小鼠體型和體重的影響

飼養開始時，各年齡組中正常飼料組和高脂飼料組小鼠體重差異無統計學意義。飼養16周后，與正常飼料組相比，6月齡和12月齡高脂飼料組小鼠體型均增大。從不同飼料組看，6月齡和12月齡高脂飼料組小鼠的體重和體脂率均高于其正常飼料組(P<0.05)。見圖1、2。

圖1 高脂飲食對不同月齡小鼠體型的影響Fig.1 Effect of HFD on body size at mice at different months of age

圖2 小鼠體重變化(A)和小鼠體重增長(B)情況Fig.2 Changes in body weight (A) and weight growth (B) of mice注：n=6，與正常飼料組相比，*P<0.05；與6月齡組相比，#P<0.05；ns：P≥0.05。

2.2 高脂飼料對不同月齡小鼠血脂血糖的影響

從不同飼料組來看，6月齡高脂飼料組的TC、TG高于其正常飼料組，12月齡高脂飼料組的TC、TG、LDL-C也高于其正常飼料組(P<0.05)。從不同月齡組看，12月齡正常飼料組的TC、TG、LDL-C均高于6月齡正常飼料組，12月齡高脂飼料組的TC、LDL-C高于6月齡高脂飼料組(P<0.05)。血清FFA在各組間差異比較無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組小鼠血脂水平Table 1 Blood lipid levels of mice

6月齡和12月齡高脂飼料組小鼠GTT、ITT水平較正常飼料組升高，其曲線下面積均大于正常飼料組(P<0.05)。從不同月齡組看，12月齡正常飼料組的GTT曲線下面積高于6月齡正常飼料組(P<0.05)。GTT和ITT曲線下面積均在12月齡高脂飼料組最高。見圖3。

圖3 高脂飲食對小鼠ITT(A、B)、GTT(C、D)水平的影響Fig.3 Effect of HFD on ITT (A, B) and GTT (C, D) in mice注：n=3，與正常飼料組相比，*P<0.05；與6月齡組相比，#P<0.05；ns：P≥0.05。

2.3 高脂飼料對不同月齡小鼠骨微觀結構的影響

與6月齡和12月齡正常飼料組相比，高脂飼料組小鼠的骨量丟失明顯，骨質減少，骨微結構被破壞；且12月齡各飼料組小鼠骨量也較6月齡各飼料組減少。12月齡高脂飼料組小鼠骨微結構破壞最為明顯。見圖4。

圖4 小鼠股骨遠端干骺端三維重建圖Fig.4 3D reconstruction of the metaphysis of the distal femur in mice

從不同飼料組看，各月齡高脂飼料組BV/TV、BS/TV低于正常飼料組(P<0.05)；從不同年齡組看，12月齡正常飼料組和高脂飼料組BV/TV和BS/TV低于6月齡組。與正常飼料組相比，12月齡高脂飼料組小鼠Tb.Th、Tb.Sp增高，Tb.N、TBPf降低(P<0.05)；12月齡高脂飼料組DA值與12月齡正常飼料組和6月齡高脂飼料組相比均降低(P<0.05)。見表2。

表2 各組小鼠Micro-CT骨參數水平Table 2 Micro-CT bone parameter of mice

2.4 高脂飼料對不同月齡小鼠股骨遠端組織形態的影響

6月齡和12月齡高脂飼料組小鼠股骨遠端骨小梁數目較其正常飼料組減少，均可見圓形脂肪空泡。從不同年齡組看，12月齡各飼料組骨小梁均明顯比6月齡各飼料組少。比其他組相比，12月齡高脂飼料組小鼠股骨遠端脂肪空泡明顯最多，而骨小梁數目最少。見圖5。

圖5 小鼠股骨遠端HE染色圖(100×)Fig.5 HE staining of the distal femur of mice (100×)

圖6A中紅色框內即為破骨細胞，從不同飼料組看，6月齡和12月齡高脂飼料組破骨細胞數均比其正常飼料組增多(P<0.05)；從不同年齡組看，12月齡各飼料組破骨細胞數均多于6月齡組(P<0.05)。見圖6。

圖6 小鼠股骨遠端HE染色圖中破骨細胞形態(A)和100×視野下破骨細胞數目(B)Fig.6 Morphology (A) and number in 100× field (B) of osteoclasts in HE staining of the distal femur of mice注：n=3，與正常飼料組相比，*P<0.05；與6月齡組相比，#P<0.05；ns：P≥0.05。

2.5 高脂飼料對不同月齡小鼠氧化應激和炎癥水平的影響

從不同飼料組看，6月齡高脂飼料組血清IL-6、TNF-α、 MDA水平均高于其正常飼料組，12月齡高脂飼料組血清IL-6、TNF-α、MDA水平也高于其正常飼料組(P<0.05)。見表3。

表3 各組小鼠氧化應激和炎癥水平Table 3 Oxidative stress and inflammation levels of mice

2.6 高脂飼料對不同月齡小鼠骨代謝指標的影響

從不同飼料組看，6月齡高脂飼料組CTX-1、PINP水平均高于其正常飼料組；12月齡高脂飼料組CTX-1低于其正常飼料組，PINP卻明顯升高(P<0.05)。從不同月齡組看，與6月齡正常飼料組相比，12月齡正常飼料組CTX-1水平升高，PINP降低。見圖7。

圖7 高脂飲食對小鼠CTX-1(A)和PINP(B)的影響Fig.7 Effect of HFD on CTX-1 (A) and PINP (B) in mice注：n=3，與正常飼料組相比，*P<0.05；與6月齡組相比，#P<0.05。

3 討論

近年來調查顯示，我國居民脂肪供能比超過中國居民膳食指南(2016年)推薦的人越來越多[8]。長期攝入高脂飲食易導致脂肪蓄積而引起肥胖[9]。本研究通過16周的高脂飼料喂養小鼠以模擬高脂飲食誘導的肥胖現象，飼養結束時發現高脂飼料組小鼠體重和體脂率增加，血脂水平也增加。有研究發現在超重和肥胖的健康人群中，骨密度會隨之下降[10-11]。與上述研究結果一致的是，本研究發現在肥胖小鼠骨組織中脂肪空泡明顯增加，各月齡高脂飼料組小鼠較正常飼料組骨質破壞明顯，骨小梁減少，且在12月齡高脂飼料組小鼠最為明顯，這提示高脂和高齡均可損害小鼠骨健康，且高脂與年齡增加同時存在時損害作用更明顯。

血清PINP是Ⅰ型膠原合成過程中產生的骨形成標志物；CTX-1是以破骨細胞活性增強為特點的代謝性骨病常用的骨吸收標志物[12]。本研究中各月齡高脂飼料組小鼠血清PINP水平均較正常飼料組升高，且在12月齡高脂組中最高，提示高脂飲食和增齡可使小鼠體內的PINP水平升高。有學者認為PINP增高與髖部皮質骨間隙增大、厚度減小有關，這可能是骨膜貼壁和皮質重建增加所致，這些骨骼結構變化容易致骨折[13]。6月齡高脂飼料組小鼠的CTX-1水平高于其正常飼料組，但在12月齡高脂飼料組中該值卻低于其正常飼料組，這可能與小鼠的性別和年齡有關。有研究對多名24～76歲對象檢測后發現年齡與CTX-1濃度降低有關，30～59歲各年齡段男性CTX-1與腰椎BMD無相關性[14-15]。雖然12月齡高脂飼料組中CTX-1值低于其正常飼料組，但HE染色顯示破骨細胞數目在12月齡高脂飼料組中最多，提示高脂飲食和高齡均促使小鼠破骨細胞增多，即高脂和年齡增加可破壞骨代謝平衡，增強骨吸收，使骨量減少。

在人群和動物中均有研究發現IL-6和TNF-α與骨密度呈負相關[16-17]。TNF-α可通過調節機體氧化應激、炎癥反應等來調控骨代謝，如刺激IL-6、M-CSF等因子釋放或參與PI3K/Akt信號通路促進破骨細胞產生和成熟，從而致骨質疏松[18-19]。MDA可反映體內過氧化程度，Zhao等[20]發現氧化應激與絕經后骨質疏松有關，骨質疏松組的MDA水平要高于非骨質疏松組。高脂飲食可通過影響IL-6和TNF-α等氧化應激和炎癥因子水平而影響骨骼健康[21]。本實驗發現，高脂飼料組與正常飼料組相比，小鼠血清IL-6、TNF-α和MDA水平均升高，破骨細胞數目也明顯增加，且在12月齡高脂飼料組中最高。以上結果均提示高脂飼料和高齡均可損害骨健康，且同時存在時損害作用更大。

本研究通過比較正常和高脂飼料喂養不同月齡小鼠后其骨骼系統的健康水平，來探究高脂飼料對不同月齡小鼠骨骼的影響。研究結果表明，高脂飼料會使小鼠血脂水平升高，炎癥因子表達上調，對骨健康產生負作用，且該負作用與年齡有關，即高脂和高齡同時存在時對骨骼健康的負作用更加顯著。