基于網絡藥理學探討運脾化濁膏干預代謝綜合征的作用機制

林鵬展 金清龍 池美華

代謝綜合征（metabolic syndrome，MS）是一組以腹型肥胖、高血糖、高血壓、血脂代謝異常、胰島素抵抗（insulin resistance，IR）為主要特征的代謝紊亂癥候群，并能顯著增高罹患心腦血管疾病及糖尿病等疾病的風險[1]。因生活方式與飲食習慣的改變，我國中老年人MS 患病率高達33.9%，并呈逐年上升趨勢[2]。此外，肥胖兒童患MS 亦不在少數[3]。目前西醫治療MS 雖可采用干預生活方式并結合降糖、降壓、降脂等手段，但臨床療效有限[4]。中醫根據四診合參辨證論治，整體調節個體氣血陰陽，對改善MS 的癥狀及防治并發癥有良好效果[5]。運脾化濁膏由國醫大師王琦院士的體質膏方加減變化而來，具有健脾理氣，利濕化濁的功效[6]。本文從網絡藥理學方向分析運脾化濁膏的藥物活性成分、靶點與痰濕質MS 之間的作用關系，以期闡明其作用機制[7]。

1 材料與方法

1.1 數據來源網址及數據分析軟件 中醫藥系統藥理學平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）（https://tcmspw.com/tcmsp.php）、蛋白質數據庫（Universal Protein，Uniprot）（https://www.uniprot.org/）、GeneCards 數據庫（https://www.genecards.org/）治療靶標數據庫（Therapeutic Target Database，TTD）數據庫（http://db.idrblab.net/ttd/）、在線人類孟德爾遺傳數據庫（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM數據庫）（http://www.omim.org）、Disgenet 數據庫（https://www.disgenet.org/）、Draw Venn Diagram 平臺（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）、STRING11.5 數據庫（https://string-db.org）、Metascape平臺（https://metascape.org/）、生物信息在線作圖網站微生信(http://www.bioinformatics.com.cn/）、Cytoscape 3.8.2 軟件。

1.2 運脾化濁膏藥物成分靶點篩選 運脾化濁膏成分為蒼術、白術、厚樸、陳皮、姜半夏、茯苓、薏苡仁、炒白扁豆、瓜蔞、桔梗、大腹皮、枳殼、絞股藍、太子參、砂仁、澤瀉、木香、浙貝母、干姜。挖掘TCMSP 數據庫，依據口服利用度（oral bioavailability，OB）≥30%及類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18[8]初步篩選出藥物活性化合物及其作用的蛋白質靶點，將篩選出活性化合物靶點在Uniprot 蛋白質數據庫中轉化成規范化基因名稱。

1.3 構建藥物四氣五味歸經網絡 通過Cytoscape 3.8.2 軟件構建出藥物的四氣五味及歸經的網絡圖，將藥物四氣五味導入軟件并進行網絡特征分析。

1.4 構建運脾化濁膏“藥物-成分-作用靶點”網絡通過Cytoscape3.8.2 軟件構建運脾化濁膏“藥物-成分-作用靶點”網絡，將篩選出藥物有效成分與作用靶點導入軟件并以分析工具進行網絡特征分析。

1.5 MS 疾病靶點篩選 設代謝綜合征（Metabolic Syndrome）為關鍵詞，挖掘GeneCards、TTD、OMIM、Disgenet 數據庫等來獲取其疾病潛在靶點，整理靶點合并并刪除重復值后獲得MS 的疾病靶點。

1.6 構建運脾化濁膏-MS 靶點PPI 網絡 取運脾化濁膏與MS 兩者靶點通過Draw Venn Diagram 平臺繪制出韋恩圖，在String11.5 平臺中構建蛋白質互作網絡（protein-protein interaction networks，PPI），將物種限定為人，最低相互作用評分設置成最高置信度（0.900），構建出運脾化濁膏-MS 靶點PPI 網絡，并在Cytoscape3.8.2 軟件中進行優化與拓撲分析，預測關鍵靶點。

1.7 運脾化濁膏-MS 關鍵靶點GO、KEGG 分析 將已預測的關鍵靶點提交至Metascape 平臺中進行基因本體（geno ontology，GO）與京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）分析通路富集分析，運用Cytoscape 3.8.2 軟件構建運脾化濁膏-MS 關鍵靶點-通路網絡圖，并利用微生信平臺繪制GO-BP 通路與KEGG 通路的條形圖。

1.8 構建運脾化濁膏活性成分-重合靶點-MS-通路網絡圖 通過Cytoscape 3.8.2 構建出運脾化濁膏活性成分-重合靶點-MS-通路靶點網絡圖，利用“network analyzer”分析工具進行網絡特征分析，節點程度以連接度值調節，連接度值越大表明其生物活性越高，功能越齊全，重要性越高。

2 結果

2.1 運脾化濁膏藥物成分信息 挖掘TCMSP 數據庫獲得運脾化濁膏藥物有效成分及作用靶點，其中蒼術有效成分4 種，作用靶點57 個；白術有效成分7種，作用靶點20 個；厚樸有效成分2 種，作用靶點27個；陳皮有效成分5 種，作用靶點63 個；姜半夏有效成分12 種，作用靶點86 個；茯苓有效成分6 種，作用靶點19 個；薏苡仁有效成分6 種，作用靶點28個；炒白扁豆有效成分7 種，作用靶點68 個；瓜蔞有效成分10 種，作用靶點15 個；桔梗有效成分4 種，作用靶點66 個；大腹皮有效成分6 種，作用靶點25個；枳殼有效成分5 種，作用靶點85 個；絞股藍有效成分14 種，作用靶點146 個；太子參有效成分6 種，作用靶點85 個；砂仁有效成分9 種，作用靶點49個；澤瀉有效成分7 種，作用靶點5 個；木香有效成分5 種，作用靶點29 個；浙貝母有效成分5 種，作用靶點48 個；干姜有效成分5 種，作用靶點42 個；合并并刪除重復值后可獲得藥物有效成分共99 個，作用靶點共261 個。其中β-谷固醇與豆甾醇為較多藥物共有化合物。見表1。

表1 運脾化濁膏主要成分表

2.2 運脾化濁膏藥物四氣五味歸經網絡 將運脾化濁膏藥物及其四氣五味與歸經導入Cytoscape3.8.2軟件進行分析，構建運脾化濁膏“藥物—四氣”“藥物-五味”“藥物-歸經”網絡圖見圖1。全方藥物四氣以溫性為主，占藥物的47.36%，五味主要以辛甘苦味為主，占藥物的94.73%，歸經主歸肺胃二經，占總藥物的84.12%。

圖1 “藥物-四氣”“藥物-五味”“藥物-歸經”網絡圖

2.3 運脾化濁膏“藥物-成分-作用”網絡 將運脾化濁膏中99 個有效成分及261 個作用靶點導入Cytoscape3.8.2 軟件進行分析，構建出運脾化濁膏“藥物-成分-作用”網絡圖，圖中節點表示靶點信息，邊表示節點間的作用聯系。網絡圖中共有379 個節點，1460 條邊，其網絡度中心性均值為5.97，介度中心性均值為5.60E-03，緊密中心度均值為0.29。見圖2。

圖2 運脾化濁膏“藥物-成分-作用”網絡圖

2.4 MS 疾病靶點 通過挖掘Genecards 數據庫可獲得15716 個MS 疾病靶點，根據相關性得分由大致小進行排序，選取前八分之一的靶點作為目標靶點，可獲得1964 個靶點，繼續挖掘OMIM 數據庫、Disgenet 數據庫與TTD 數據庫補充相關靶點，共獲得MS 疾病靶點2464 個。

2.5 運脾化濁膏-MS 靶點PPI 網絡 將運脾化濁膏與MS 獲得靶點通過Draw Venn Diagram 平臺繪制出韋恩圖（見圖3），可見兩者共存126 個共同靶點，通過String11.5 平臺構建出PPI 網絡圖（見圖4），本研究置信度設為0.900，并隱藏斷開連接節，該網絡圖中可視其PPI 中節點數為126，預期邊數133，邊數382，PPI 富集P 值為＜1.0e-16，平均節點數6.06，平均局部聚類系數0.344，于Cytoscape 3.8.2 軟件中勾畫網絡圖（見圖5），經分析可知該網絡度中心性均值為7.01，介度中心性均值1.85e-02，選取均大于均值的度中心性與介度中心性可篩選出26 個核心靶點（見表2），占共同靶點的20.63%

表2 核心靶點拓撲屬性參數

圖3 運脾化濁膏-MS 韋恩圖

圖4 運脾化濁膏-MS 靶點PPI 網絡（1）

圖5 運脾化濁膏-MS 靶點PPI 網絡（2）

2.6 GO 與KEGG 通路分析 將核心靶點置于Metascape 數據庫進行GO 及KEGG 通路富集分析，分析以P＜0.01 為標準，將P 值由小到大進行排序，選擇前20 條GO 及KEGG 進行分析。通過Cytoscape 3.8.2 軟件、生物信息在線作圖網站微生信進行繪制其網絡圖與條形圖，整理可獲得圖6、圖7、表3。經分析，運脾化濁膏改善MS 的細胞成分主要為內質網內腔、膜筏、膜微區、囊腔、質膜蛋白復合物、小窩、質膜筏、分泌顆粒腔、胞質泡腔、血液微粒、主軸、RNA 聚合酶Ⅱ轉錄調節復合物、轉錄調節復合物、粘著斑、質膜的外在成分、細胞-基底連接、蛋白質DNA 復合物、胞體、細胞基部、膜側等；生物過程主要涉及有機環化合物、生長因子、氧化應激、類固醇激素、激素刺激、細胞死亡、活性氧、無機物、脂質、DNA 結合轉錄因子活性、細胞程序性死亡等的反應；分子功能包括結合DNA 結合轉錄因子、磷酸酶、染色質、轉錄因子、、細胞因子受體、轉錄協同調節因子、一氧化氮合酶調節、核心啟動子序列特異性DNA、蛋白激酶、蛋白質結構域特異性蛋白磷酸酶，并調節信號受體激活劑、受體-配體、核受體、配體激活轉錄因子等活性。KEGG 通路分析可視，其主要通路可能為AGERAGE 信號通路、IL-17 信號通路、Toll 樣受體信號通路相關。

表3 KEGG 前20 條通路表

圖6 富集分析通路條形圖

圖7 富集分析通路網絡圖

2.7 構建運脾化濁膏-MS-通路網絡圖 將運脾化濁膏藥物成分，活性化合物、重合靶點、核心靶點，KEGG 通路信息通過Cytoscape 3.8.2 軟件進行構建網絡圖（見圖8）。

圖8 運脾化濁膏-MS-通路網絡圖

3 討論

MS 病情多樣冗雜，常常以腹型肥胖、高血糖、高血壓、血脂代謝異常、IR 為主要特征，MS 發病機制雖進行多方面的研究，目前仍未完全闡明。中醫根據MS 的臨床癥狀，將其歸納為“肥胖”“消渴”“眩暈”等諸證[9]，多由于患者飲食不節、安逸少動、情志失調或稟賦不足等，導致出現痰濕等病理產物，繼而影響脾臟的生理功能[10]。脾者，后天之本也，主運化，運化失常無力輸布水谷精微，則濕邪內生，痰濁內阻，痰濕與脾虛互相影響，表現為一系列MS 癥狀。王琦教授首次提出痰濕體質，并構建出痰濕體質理論體系[6]，并擅長以體質膏方調理MS 患者，運脾化濁膏為體質膏方改制而來。

本研究基于網絡藥理學預測運脾化濁膏治療MS 的潛在機制。挖掘TCMSP 數據庫獲得藥物有效成分99 種，作用靶點261 個，主要有效成分包括β-谷固醇與豆甾醇等；繪制出組成藥物四氣五味歸經網絡圖，分析可知，全方以溫性，辛甘苦味為主，主歸脾胃二經；挖掘各項疾病數據庫獲得MS 靶點2464個，繪制出韋恩圖獲得交集靶點126 個。通過String11.5 數據庫構建PPI，以Cytoscape 3.8.2 軟件進行拓撲分析篩選出26 個核心靶點，占總靶點數的20.63%，關鍵靶點為TP53、AKT1、MAPK1、CTNNB1、TNF、ESR1、EGFR、CAV1、IL6、FOS、STAT1、AR、CASP3、IL10、IL4、INS、PPARA、F2、PLG、PPARGC1A、EDN1、FN1、NR3C1、PPARG、CASP8、IGFBP3。將核心靶點通過Metascape 數據庫進行GO 及KEGG 分析，經分析，運脾化濁膏可通過結合DNA 結合轉錄因子、磷酸酶、染色質、轉錄因子、細胞因子受體、轉錄協同調節因子、一氧化氮合酶調節、核心啟動子序列特異性DNA、蛋白激酶、蛋白質結構域特異性蛋白磷酸酶，并調節信號受體激活劑、受體-配體、核受體、配體激活轉錄因子等活性來改善MS 相關癥狀，及主要通路可能與AGE-RAGE 信號通路、IL-17 信號通路、Toll樣受體信號通路相關。

早在1988 年研究者已發現β-谷固醇具有降血糖與胰島素釋放的功效[11]。Cicero Arrigo 等[12]研究發現低劑量β-谷固醇可降低血脂水平，且安全性與有效性良好。Babu 等[13]研究發現，β-谷固醇是通過IRS-1/Akt 介導的胰島素信號通路減輕胰島素抵抗。近年來研究證實豆甾醇是通過抑制腸道相關轉運蛋白表達[14]、抑制各項酶類活性[15]，增加膽固醇逆向轉運相關轉運蛋白[16]來提高膽固醇的排泄，并且通過干擾腸道脂肪酸吸收[17]、調節肝臟脂質代謝來降低三酰甘油的水平[18-19]。

金代醫家張元素所著《醫學啟源》曰：“脾胃：味甘補，苦瀉，氣溫熱補，寒涼瀉[20]。”又有《輔行決》言：“脾德在緩，故經云：以甘補之，辛瀉之[21]。”性溫善行氣化濕又兼補脾，味苦則燥濕，味辛則發散濕邪，味甘則補脾，又走脾胃二經，因而本方可行健脾理氣，利濕化濁之功。

根據GO 及KEGG 分析，運脾化濁膏可能是通過結合DNA 結合轉錄因子、磷酸酶、染色質、轉錄因子、細胞因子受體、轉錄協同調節因子、一氧化氮合酶調節、核心啟動子序列特異性DNA、蛋白激酶、蛋白質結構域特異性蛋白磷酸酶，并調節信號受體激活劑、受體-配體、核受體、配體激活轉錄因子等活性來改善MS 相關癥狀，作用通路可能與AGE-RAGE信號通路、IL-17 信號通路、Toll 樣受體信號通路相關。AGE-RAGE 信號通路與MS 息息相關，患者一旦發生胰島素抵抗，則血糖升高，繼而蛋白質、脂質等出現非酶糖基化，形成糖基化終末產物，通過與細胞膜上的晚期糖基化終末產物受體結合發揮生物效應[22]。研究表明IL-17 信號通路與胰島素抵抗也存在相關性，并且對限制性肥胖相關性胰島素抵抗與驗證控制方面均有積極作用[23]。Toll 樣受體2 作為一種識別受體，可通過識別病原相關分子模式和損傷相關分子模式而啟動機體的免疫防御反應同時引發炎癥，與胰島素抵抗的發生密切相關[24]。

綜上所訴，本次網絡藥理學初步分析預測了運脾化濁膏治療MS 的潛在機制，但后期仍需要分子層面及臨床試驗研究佐以驗證，為其臨床運用提供有效的理論依據。