循環腫瘤細胞的檢測方法

宋宇航 楊小林 劉 康 宋桂芹

1.南充市中心醫院 川北醫學院第二臨床醫學院組織工程與干細胞研究所，四川南充 637000；2.川北醫學院基礎醫學院生物教研室，四川南充 637000

循環腫瘤細胞（circulating tumor cells，CTCs）是從腫瘤部位脫落的腫瘤細胞，在腫瘤發育過程中侵入外周血。其被認為攜帶著腫瘤發生、發展和轉移的重要信息，與腫瘤轉移密切相關[1]。CTCs 檢測作為新興的液體活檢技術，具有取樣方便、侵入性小、信息全面、無放射性污染、成本低等優勢，是目前最具發展潛力的腫瘤無創診斷和實時療效監測手段之一，已成為當前癌癥診斷領域的前沿熱點[2]。由于外周血中CTCs的數量稀少，以及隨著腫瘤轉移CTCs 亞型不斷變化，所以對CTCs 捕獲及鑒定技術的研究是關鍵環節。舊技術的不斷革新及新技術的不斷挖掘，使得CTCs 的富集率進一步提高。本文簡述了CTCs 的體內外檢測方法，并分析了當前CTCs 檢測面臨的挑戰及策略。

1 CTCs 的體外檢測方法

CTCs 的富集方法是基于物理或生物特性的。前者取決于腫瘤細胞的尺寸、電性能等其他物理特性，而后者主要依賴于抗原抗體結合[3]。近年來，聯合物理和生物特性檢測的新型微流控芯片技術具有自動化、微型化、高通量、可集成下游分析等優點，在CTCs 檢測分析中顯示了巨大優勢[2]。

1.1 基于物理特性的富集方法

研究表明，CTCs 比造血細胞更大、更硬[4]。基于這些物理特性的差異，已經開發了許多技術來提高CTCs 富集率[5]，其中膜過濾分離腫瘤細胞技術（isolation by size of epithelial tumor cells，ISET）系統是最早基于尺寸過濾的CTCs 分離的技術之一。在該系統中，血液被稀釋，然后用8 μm 孔徑過濾器過濾。CTCs 由于體積較大而被過濾器保留，紅細胞和白細胞由于體積小于孔徑而可以通過隨機分布的孔。但由于CTCs和白細胞的大小重疊，依賴大小的過濾系統捕獲目標細胞的效率有限[4]。因此，Sun 等[6]提出了一種增加細胞大小的策略，即在細胞過濾前利用修飾過的微珠來特異性結合CTCs，以提高捕獲效率。使用該微流體捕捉系統以1 ml/min 的流速可以從全血樣本中分離出高達91%的靶細胞[6]。

與ISET 系統類似，Screen Cell 系統通過使用微孔膜過濾器，通過篩孔大小分離CTCs[7]。該系統基于微過濾技術的過濾膜，可以使有核細胞通過，而CTCs被攔截。Screen Cell 系統具有高通量持續處理大量血液的潛力，并且具有相關的細胞和分子生物學技術，以及與CTCs 及其潛在基因異常的圖形和鑒定相關的技術，可以方便地分析提取到過濾器上的腫瘤細胞[3]。此外，從血液中分離出來的細胞能最大程度地保存其活性和完整性，為CTCs 的體外培養奠定了基礎。

流體輔助分離技術（fluid-assisted separation technique，FAST）是一種新型的離心微流控系統[8]。在這種方法中，基于尺寸的分離發生在離心微流控裝置中的液-液界面上，而不是傳統的液-氣界面上。FAST 能夠直接從全血中分離出高靈敏度、選擇性、快速和無標記的CTCs，并且無需事先進行樣本操作。

與血液中的白細胞比較，CTCs 具有更多的負電荷、更低的細胞質電導率及更高的單位膜電容[9]。介電泳場流分離技術采用的膜電容是基于細胞的大小和極化率，可以在30 min 內處理3000 萬個細胞，回收率高[10]。但是其需要提前獲知細胞的特定參數，如細胞類型和電場頻率等。

1.2 基于生物特性的富集方法

Cell Search?系統是一種基于上皮細胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecules，EpCAM）免疫檢測的CTCs 富集方法，是目前食品藥品監督管理局批準的第一種也是唯一一種用于結直腸、乳腺、前列腺等腫瘤的CTCs 檢測方法[11]。Cell Search?系統的原理是由于EpCAM 在多種腫瘤細胞高表達，用磁珠標記的抗體特異性地結合這些抗原，隨后通過施加磁場富集細胞[10]。然而Cell Search?系統無法檢測出失去EpCAM 表達的細胞，而這些細胞通常在上皮細胞-間充質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）期間產生[12]。EMT 對腫瘤細胞轉移過程至關重要，這意味著使用該系統檢測會漏檢許多參與腫瘤轉移的重要CTCs。由于Cell Search?系統僅適用于少數類型的癌癥，且檢測靈敏度不高，無法分離活的CTCs，因而較大程度地限制了其在臨床檢測中的有效應用[13]。

與Cell Search?系統類似，磁細胞分離（magnetic cell separation，MACS）利用涂有EpCAM 抗體的磁珠吸附表達EpCAM 的細胞。通過聯合細胞角蛋白等標記可以提高CTCs 的檢出率。同樣地，MACS 無法檢測到所有的CTCs，特別是那些缺乏上皮標志物的、具有高度惡性潛能的CTCs[14]。此外，使用MACS 富集與事先透化EpCAM 染色并不排除檢出癌癥相關巨噬細胞的可能性[14]。

1.3 微流控芯片技術

利用CTCs 的尺寸大于血細胞的物理特性及細胞表面標志物的表達差異，Ahmed 等[15]設計了DLD 式微柱陣列，并在微柱表面修飾抗EpCAM 抗體，進而構建了CTCs 高效率、高純度富集的微流控芯片。根據DLD 原理，大尺寸的CTCs 會在微通道內不斷與微柱碰撞并發生側向位移，而小尺寸的血細胞則沿著層流水平前進不與柱子碰撞，選擇性增強了CTCs 與微柱的碰撞概率。實驗證明，在全血環境下，CTCs 的富集效率為（92.2±6.4）%，純度高達（82.3±3.8）%[15]。

1.4 富集細胞鑒定

以上方法富集得到的CTCs 還需要后續實驗進行檢測鑒定，富集方式即使不同檢測方法也可以相同[16]。目前CTCs 的鑒定方法有很多，其中最常用的是免疫熒光染色、逆轉錄聚合酶鏈反應（reverse transcription-PCR，RT-PCR）。

1.4.1 免疫熒光染色 固定富集的細胞后，用角蛋白熒光抗體（cytokeratin，CK）、抗CD45 和DAPI 等熒光染料標記對細胞進行免疫熒光染色，其中DAPI+/CK+/CD45-的細胞被鑒定為CTCs[17]。其優點是在熒光顯微鏡下可觀測細胞蛋白表型及形態。缺點是蛋白標志物的表達缺乏穩定性，不能區分活細胞和死細胞[16]。

1.4.2 RT-PCR RT-PCR 可通過檢測外周血中特定的逆轉錄DNA 片段來間接證實CTCs 的存在[18]。RTPCR 具有靈敏度高、可重復性好、無創等諸多優勢[19]。但由于RT-PCR 只是從基因層面上鑒別CTCs，所以無活力的CTCs 在此方法中同時被鑒定出來。由于在細胞變形性分析和藥物反應測定方面需要取活細胞，使其應用受限。

2 CTCs 的體內檢測方法

在臨床檢查中，前述幾種檢測血液樣本中CTCs的體外方法是基于一個基本假設，即外周血中CTCs計數不會隨時間發生顯著變化，但最近的研究對這一假設提出了挑戰[20]。即CTCs 在循環中的分布可能不是均勻的，在給定時間點未檢測到CTCs 的患者可能不是無CTCs[21]。但是，反復抽取患者血液以明確CTCs的時間分布是不現實的。因此，研究該問題的一個可行策略是通過體內檢測方法監測CTCs。體內流式細胞術（in vivo flow cytometry，IVFC）能夠以無創和連續的方式直接檢測活動物模型中的移動細胞。根據原理不同，IVFC 可分為熒光IVFC 和光聲流式細胞術（photoacoustic flow cytometry，PAFC）。

2.1 熒光IVFC

在使用熒光IVFC 檢測CTCs 之前，需要對感興趣的細胞進行標記。熒光IVFC 的基本原理與傳統的流式細胞術相似，只是使用生物體內的天然血管代替常規流式細胞儀中的流動室[22]。當熒光標記的細胞通過聚焦在血管上的激光束的狹縫時，可以激發其發射熒光。熒光IVFC 可以在幾分鐘到幾小時內連續測量最近標記的CTCs，并提供時間信息[23]。與體外檢測CTCs 方法比較，熒光IVFC 不僅避免了抽血，還避免了體外檢測方法中涉及的其他過程，如細胞裂解、離心和富集。這些體外過程會干擾CTCs 的生物環境，顯著影響CTCs 檢測的準確性。

2.2 PAFC

PAFC 利用CTCs 與血液背景的光吸收差異可以實現CTCs 在體檢測[24]。其原理是使用高頻脈沖激光照射血管，通過放置在組織表面的超聲波探測器檢測流經血管的靶細胞產生的瞬時超聲波信號。當組織受到輻射時，目標細胞吸收光能，然后將光能轉化為熱能。這導致局部溫度升高，引發組織的熱彈性變化，產生超聲波（即光聲信號）。由于PAFC 是基于光吸收的對比，因此其只適用于特定吸收類型的細胞，如黑色素瘤細胞[22]。PAFC 不僅能實時檢測體內黑色素瘤CTCs，還能消滅黑色素瘤細胞，具有顯著的治療效果[3]。

3 CTCs 檢測面臨的挑戰及策略

3.1 CTCs 的稀缺性

研究表明[25]，腫瘤患者外周血中每毫升血液只有0～10 個CTCs，這對CTCs 富集設備的要求極為苛刻。越來越多的新方法使CTCs 的富集效率大大提高，新的標志物組合有效降低了假陽性率、假陰性率，但仍難以覆蓋隨疾病進展不斷發生縱向變化的所有CTCs[26]。基于物理特性的富集方法具有免標記、高通量、不依賴細胞表面抗原表達水平等優勢，但特異性差、富集效率和純度低。基于生物特性的富集方法靈敏度高、特異性好，但成本高、耗時長。聯合多種原理的富集方法各取所長、互補所短，能進一步提高富集效率。IVFC 雖然能在體內實時檢測CTCs，但目前還停留在動物模型階段，真正實現床旁監測還有很長的距離。發展具有更高靈敏度和特異性的CTCs 檢測技術仍然是未來發展趨勢。

3.2 CTCs 的異質性

腫瘤細胞的異質性是指同類腫瘤的瘤間，以及同一腫瘤組織的瘤內，存在形態、功能差異的癌細胞亞群[27]。對CTCs 而言，其異質性主要體現在細胞表面特征標志物種類及數量的動態變化，這將對設備的CTCs 捕獲效率產生較大影響[28]。研究表明[29]，EMT 在CTCs 的生物學中起著至關重要的作用，并有助于CTCs的異質性。此外，EMT 不僅促進了CTCs 的擴散，而且在促進其從非干細胞進入干細胞狀態方面發揮了關鍵作用[30]。對此，聯合多種EMT 和干細胞標記鑒定CTCs 亞型不失為一種有效手段。對CTCs 亞型的深入認識是未來指導個體化、精準化醫療的關鍵環節。

4 現狀及展望

作為一種新興的診斷和治療方法，CTCs 提供了在影像學方法使用前發現癌癥的可能性，并結合其他腫瘤標志物指導治療，監測患者術后治療情況，預測患者預后。目前阻礙深入認識CTCs 的兩個重要障礙仍然是其稀缺性與異質性。因此，發展具有更高靈敏度和特異性的檢測技術是實現CTCs 精準捕獲的第一步。對CTCs 亞型的深入認識則是未來指導個體化、精準化醫療的關鍵環節。盡管已經取得了很大的進展，但在以CTCs 為基礎的液體活檢廣泛應用于臨床應用的常規檢測之前，還有很長的路要走。