表觀遺傳調控及其在支氣管哮喘中的作用機制研究進展

楊 漾 蘇 暢 張秋雁 黃舒淳 匡慧芳

1.湖南中醫藥大學中醫學院，湖南長沙 410208；2.湖南中醫藥大學湘杏學院，湖南長沙 410208；3.湖南中醫藥大學校醫院，湖南長沙 410208

支氣管哮喘（簡稱“哮喘”）是一種以氣道高反應性和可逆性的氣流受限為基本特征的慢性炎癥性疾病，由多種細胞（嗜酸性粒細胞、肥大細胞等）和細胞組分參與。中國最新哮喘流行病學調查結果顯示，我國成人（≥20 歲）哮喘患者超過4 000 萬[1]。環境因素與哮喘的發生密切相關，研究已證實接觸過敏原、空氣污染物、病毒感染等環境因素在哮喘發病過程中扮演著重要角色[2]。表觀遺傳學是指除基因序列改變之外，基因功能可逆的、可遺傳的改變，主要有DNA 甲基化、組蛋白甲基化、組蛋白乙酰化、微小RNA（microRNA，miRNA）的改變等。近年來，越來越多的證據表明，環境因素影響哮喘的發病可能通過改變表觀遺傳學機制來實現。在細胞分化和發育過程中，表觀遺傳變化與細胞的程序性基因表達及可塑性有關，使細胞重新編程并對環境作出改變。總之，表觀遺傳機制可從細胞水平上整合遺傳與環境因素，闡明哮喘發生的表觀遺傳調控，有助于闡明哮喘發生的病理基礎。

1 DNA 甲基化

組蛋白甲基化包括寫入、擦除和讀取3 個過程，分別由相關的甲基轉移酶、去甲基化酶、甲基化識別蛋白主導。表觀基因組關聯分析發現，哮喘患者與正常人群的DNA 序列存在大量差異化的甲基化位點，且與哮喘效應細胞（如淋巴細胞、氣道內皮細胞及平滑肌細胞）和哮喘相關基因FOXP3、γ 干擾素（interferonγ，IFN-γ）及白細胞介素4（interleukin，IL-4）等的表達密切相關[3]。然而，現有研究多針對哮喘患者的全血細胞或外周血單核細胞（包含淋巴細胞和單核細胞），存在的問題就是如果表觀遺傳標記特定的組織/細胞類型，且帶有標記的細胞在病例組和對照組間以不同的比例存在，這種分析可能會出現明顯偏差[4]。因此，研究者開始對單一細胞群體（如T/B 淋巴細胞、嗜酸性粒細胞、單核細胞、氣道上皮細胞以及氣道平滑肌細胞等）進行甲基化差異研究。研究發現，哮喘患者嗜酸性粒細胞中的膠原蛋白相關基因、視網膜母細胞瘤基因1、SLC25A33 等與氣道功能和免疫系統密切相關的基因存在明顯的低甲基化狀態，而單核/巨噬細胞中的神經調節蛋白1、SYNM、TBX5 及序列相似家族19 成員A4 等則顯示出明顯的高甲基化狀態[5]；氣道上皮細胞中IL-33[促進2 型輔助型T 細胞（Th2）分化發育]啟動子區域的甲基化是明顯減少的，其IL-33分泌明顯增多[6]；轉錄激活因子5 基因鳥嘌呤島的高甲基化則導致轉錄激活因子5 表達明顯降低[7]。

DNA 甲基化也參與T 細胞亞群的分化與發育，而Th0 細胞向Th2 細胞分化是哮喘發病的重要環節。研究發現，哮喘患者和非哮喘患者的IL-4 和IFN-γ基因存在甲基化差異，IL-4 基因在幼稚T 細胞及Th1細胞中通常為高甲基化[8]，過敏源可以誘導Th0 細胞IL-4 基因啟動子區域的去甲基化而促進IL-4 表達，促使Th0 細胞向Th2 細胞分化，引起炎癥因子的進一步表達，促進哮喘的發生發展[9]。早期營養不良可增加哮喘的易感性，其機制可能與誘導Th0 細胞中Th2 相關細胞因子位點的低甲基化，引起Th0 細胞向Th2 細胞分化有關[10]。轉錄因子FOXP3 調控原始T 細胞向調節性T 細胞（Treg）分化發育，其啟動子區域鳥嘌呤島的甲基化可以影響Treg 細胞的形成和活性，驅動FOXP3 表達的cAMP 效應元件結合蛋白/錄激活因子結合位點附近鳥嘌呤島的甲基化與FOXP3 表達呈負相關，而下調DNA 甲基轉移酶1 或使用DNA 甲基化酶抑制劑可以抑制鳥嘌呤甲基化而促進FOXP3 的表達[11]。

2 組蛋白修飾

核小體是由DNA 和組蛋白形成的染色質基本結構單位，其通過物理阻隔和改變染色體構象阻礙轉錄因子與DNA 的結合，可抑制基因表達[12]。然而，組蛋白的翻譯后修飾，如乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化、ADP 核糖化和脫胺化等可改變染色質的疏松程度和可及性，影響DNA 轉錄[13]。其中，組蛋白的乙酰化常常導致基因表達上調，而組蛋白的甲基化則有激活或抑制基因轉錄的雙重作用，取決于修飾氨基酸的位置、狀態等。

2.1 組蛋白甲基化

組蛋白甲基化修飾就是在組蛋白甲基轉移酶的作用下，以硫腺苷甲硫氨酸為甲基供體，在組蛋白的賴氨酸發生單、雙甚至三甲基化或者精氨酸單或雙（對稱或非對稱）甲基化（如H3K4me3 表示組蛋白H3 的第4 位賴氨酸的三甲基化，以此類推）[14]。不同組織和細胞的組蛋白甲基化修飾各有不同。氣道平滑肌細胞（airway smooth muscle cells，ASMCs）在哮喘病理過程的發展和維持中（炎癥、重塑和收縮/高反應性）發揮著重要作用，其通過分泌包括組胺、類前列腺素、白三烯、細胞因子、趨化因子和內皮素等多種炎癥因子參與哮喘的發生發展[15]。哮喘患者的肺組織及分離的ASMCs中PRMTs 明顯增高，抑制PRMTs 可減少ASMCs 的增殖、遷移、膠原沉積和細胞外基質的形成[16]。哮喘患者ASMCs 的血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）基因啟動子區域缺乏G9A 和SUV39H1等轉錄抑制復合物的形成，反而形成由H3K4me3、RNA 聚合酶Ⅱ、腫瘤血管生長因子和高水平的Sp1 組成的轉錄激活復合物，使VEGF 的表達上調，促進哮喘的發生發展[17]。單核細胞來源的樹突狀細胞（dendritic cells，DCs）受到過敏原刺激后會活化，通過抗原提呈并分泌Th2 型細胞因子刺激Th0 細胞向Th2 細胞分化，H3K4me3 及H3K27me3對DCs 的活化及其在炎癥狀態下的基因表達發揮重要作用[18]。

Th0 細胞分化為Th 亞群是哮喘的典型特征，而T細胞的分化發育也受組蛋白甲基化的表觀遺傳調控[19]。研究發現，H3K4me3 與啟動子激活相關，H3K4me1/2與基因增強子相關，H3K36me3 在激活基因的轉錄區域被發現，而H3K9me3 及H3K27me3 被發現與基因表達沉默相關[20]。H3K27me3 水平升高與基因表達抑制相關，這些基因包括Th2 細胞中的IFN-γ 和Tbx21，Th1 細胞中的IL-4 和Gata3[21]。Zeste 基因增強子同源物2（Ezh2）是H3K27 位點的甲基轉移酶，Ezh2形成的PRC2 復合體可直接結合Tbx21 和Gata3 基因座，使Tbx21 和Gata3 在Th1 和Th2 細胞分化中正確表達，并伴有大量的H3K27me3[22]。Ezh2 通過調控H3K27me3 對IL-4、IL-13 等基因的轉錄沉默起重要作用[22]，其缺乏會導致IFN-γ 的分泌減少及Th2 型細胞因子的增加，加重哮喘的病理過程[23]。

2.2 組蛋白乙酰化

與組蛋白甲基化機制相似，組蛋白的乙酰化也存在寫入、擦除和讀取的過程，分別受組蛋白乙酰轉移酶（histone acetyltransferase，HATs）、組蛋白脫乙酰酶（histone deacetylase，HDACs）和Bromodomains 調控。研究表明，哮喘患者中組蛋白H4 的乙酰化上調與多種炎癥基因表達上調一致，支氣管組織中HATs 的活性上調，而HDACs（尤其是HDAC2）活性降低，其所導致的組蛋白乙酰化改變與氣道上皮細胞和ASMCs 中多種促炎因子（嗜酸性粒細胞趨化因子、IL-8/10 等）的生成密切相關[24]。趨化因子是吸引白細胞移行到感染部位的一些低分子量蛋白，包括IL-8、腫瘤壞死因子-α、內皮素-1 和IL-1β 等。其中，哮喘患者ASMCs 中由p300 介導其啟動子區域H3K18 的乙酰化導致IL-8大量分泌[25]；腫瘤壞死因子-α 可以誘導ASMCs 中嗜酸性粒細胞趨化因子基因啟動子區域H4 賴氨酸5和12 的乙酰化，促進其基因轉錄，β2 腎上腺素受體激動劑和糖皮質激素可通過逆轉其啟動子區域H4的乙酰化而發揮治療作用[26]。需要注意的是，其他非組蛋白成分，如GATA3 和NF-κB 的p65 組分，也可以成為乙酰化和去乙酰化的靶點，例如組蛋白乙酰基轉移酶CBP 可乙酰化p65 上的特定賴氨酸殘基，增加其與DNA 的結合，引起轉錄激活，而HDACs 則反轉這個程，HDAC1 和HDAC2 能夠將乙酰化的NF-κB去乙酰化，并促進其與細胞核內IκB-α 結合，從而促進其轉位至細胞質中并終止NF-κB的活性[27]。

組蛋白的乙酰化也參與了Th0 細胞的分化。在Th1 和Th2 細胞的分化發育中，分別觀察到Th1 和Th2細胞因子基因座組蛋白乙酰化的增加[28]。在Th2 型細胞分化發育中，GATA3 通過其保守的GATA3 響應元件與靶基因DNA 結合并與CBP/p300 及RNA聚合酶Ⅱ形成具有組蛋白乙酰轉移酶活性的轉錄復合物，促進IL-4/13 的轉錄[29]。相反，組蛋白去乙酰化參與基因表達的負調控，HDACs 也與Th0 細胞的分化有關。如HDAC1 缺失能促進Th2 型細胞分化和Th2 型細胞因子的產生，HDAC6 和沉默信息調節因子2 相關酶1也可以通過去乙酰化和降低Foxp3 的表達來調節Treg 的功能[30]。

3 非編碼RNA

非編碼RNA 包括長鏈非編碼RNA（lncRNAs）、MicroRNAs、內源性小干擾RNA（endo-siRNAs）等多種類型，它們不編碼蛋白質，但可以調控蛋白質編碼基因的轉錄、翻譯及其穩定性[31]。其中，lncRNA 參與調控多種免疫細胞如樹突狀細胞、巨噬細胞、嗜酸性粒細胞、T 淋巴細胞的功能，同時通過多種機制調節氣道平滑肌細胞的增殖和遷移，在哮喘病理過程中發揮著重要作用[32-35]。例如，lncRNA PTPRE-AS1 在IL-4刺激的巨噬細胞中選擇性表達，敲減PTPRE-AS1 可通過絲裂原活化蛋白激酶/細胞外蛋白調節激酶途徑促進M2 巨噬細胞激活[36]。LncRNA MEG3 通過靶向microRNA-17/視黃酸相關的孤兒受體γt 調節哮喘患者的Treg/Th17 平衡[35]。LncRNA GAS5 通過控制miR-10a/腦源性神經營養因子信號通路促進哮喘患者氣道平滑肌細胞增殖[37]。

miRNA 參與多種哮喘相關細胞的活化、增殖、遷移、氣道炎癥、氣道平滑肌的過度收縮和氣道重塑等過程。miRNA-155 在哮喘患者的上皮和氣道平滑肌細胞中明顯上調，下調或敲除miRNA-155 可減少Th2 型細胞/嗜酸性粒細胞浸潤和細胞因子/黏液的分泌[38]。miR-24 和miR-27 則可通過調節IL-4 的分泌調節T 細胞的分化發育而抑制氣道炎癥[39]。其次，多個miRNA 參與調控ASCMs 的功能，如miR-143-3p、miR-145 等調控其生物合成，miR-145、miR-133a 等調控其收縮；miR-150、miR-139-5p 等調控其增殖[40]。

4 小結

表觀遺傳修飾如DNA 甲基化和組蛋白的翻譯后修飾調控哮喘相關基因的表達及哮喘相關細胞的功能，在哮喘發生發展中發揮著重要作用。但基因表達是一個極其精密的過程，受到多種形式的精密調控，DNA 甲基化、組蛋白翻譯后修飾和非編碼RNA 等多種表觀遺傳形式之間也存在著極其復雜的交互作用，共同形成基因表達的表觀遺傳調控網絡，仍需更深入的研究來進一步闡明。其次，檢測痰液或血液中miRNA 水平有望成為診斷哮喘的生物標志物，值得進一步研究。此外，哮喘的表觀遺傳學研究雖已取得長足的進展，但將表觀遺傳學用于哮喘治療的研究才剛剛起步。目前，研究者開始針對表觀遺傳學進行藥物研究，如針對HDACs 的抑制劑、miRNA 的靶向藥物等。然而，這些藥物因缺乏特異性而不可避免地存在著副作用，高選擇性藥物的研發將是未來研究的重點問題。