兒童急性淋巴細胞白血病化學治療常規藥物耐藥機制的研究進展

林艷艷，許 巖，李 慧

上海交通大學醫學院附屬上海兒童醫學中心兒科轉化醫學研究所，國家衛生健康委員會兒童血液腫瘤重點實驗室，上海200127

兒童白血病是血液系統的侵襲性腫瘤，在我國15 歲以下兒童死亡原因中居于第二位?；诘怯浵到y大數據分析，我國15 歲以下兒童白血病發病率約為4/10 萬，每年新增的15 歲以下兒童白血病的病例在1.5 萬例左右［1］。白血病的各種類型中急性淋巴細胞白血?。╝cute lymphoblastic leukemia，ALL）比例最高，占兒童白血病的72.4%，也是兒童中發病率最高的惡性腫瘤，約占所有兒童癌癥的三分之一［2］。近10 年來，隨著兒童白血病精細化分型和規范化治療在全國范圍內的推廣，ALL 患兒的遠期預后極大地提高。上海交通大學醫學院附屬上海兒童醫學中心（下稱上海兒童醫學中心） 2015 版ALL 治療方案（Shanghai Children's Medical Center-ALL-2015，SCMC-ALL-2015方案）的臨床研究［3］結果顯示，我國ALL 患兒5 年無事件生存率達80.3%，總生存率為91.1%；盡管如此，其與發達國家相比仍有一定的差距［4］。同時SCMC-ALL-2005 方案長期生存分析［5］表明，1 497 例ALL 患兒中有289 例（19.3%）復發，5 年、10 年復發率分別為（23.0±1.0）%和（25.0±2.0）%。國際上亦有20%～30%的ALL 患兒產生復發現象［6］，據報道復發的B 細胞型ALL（B-cell acute lymphoblastic leukemia，B-ALL）患者的生存率只有50%左右［7］。明確耐藥復發的機制，早期診斷、及時干預、有效的針對性治療，對于進一步降低ALL患兒耐藥復發的可能性至關重要。

兒童ALL 的化學治療（化療）藥物種類繁多，在治療ALL 的過程中發揮著不同的作用，能夠影響基因的表達、干擾核酸和蛋白質的合成、促使細胞結構和功能的改變等。使用不同類別的藥物進行治療，疾病耐藥復發的機制也有所不同。本文總結了ALL細胞耐受常規化療藥物的可能的相關機制，旨在了解白血病細胞耐藥的分子基礎，為克服耐藥的個體化治療、設計相應的干預方案提供思路。

1 兒童ALL常規化療藥物

由上海兒童醫學中心牽頭組建，全國最大規模的中國兒童腫瘤專業委員會急性淋巴細胞白血病多中心協作組（Chinese Children's Cancer Group Study-ALL，CCCG-ALL），在CCCG-ALL-2015 治療方案（臨床注冊號：ChiCTR-IPR-14005706）的基礎上進行了19項修改，發布了新的CCCG-ALL-2020 方案（臨床注冊號：ChiCTR2000035264）。美國國家綜合癌癥網絡（National Comprehensive Cancer Network， NCCN）也發布了2020 版兒童ALL 指南［8］。相比于其他腫瘤，ALL 對細胞毒性藥物的反應更好，各種細胞毒性藥物已被成功應用于ALL 的臨床治療中。全球各地兒童ALL 治療方案略有不同，典型的兒童ALL 治療方案包括誘導化療、鞏固治療和維持治療3 個階段［9-10］。目前，兒童ALL 常規化療藥物包括激素類、抗代謝類、生物堿類和蒽環類藥物，如糖皮質激素（glucocorticoid， GC）、 氨 甲 蝶 呤（methotrexate，MTX）、6-巰基嘌呤（6-mercaptopurine，6-MP）、硫唑嘌呤（azathioprine，AZA）、6-硫鳥嘌呤（6-thioguanine， 6-TG）、 左 旋 天 冬 酰 胺 酶 （Lasparaginase， L-ASP）、 長 春 新 堿 （vincristine，VCR）和柔紅霉素（daunorubicin，DNR）等。

2 兒童ALL常規化療藥物耐藥相關機制

在ALL 的治療過程中，有相當一部分患兒出現了耐藥現象，是導致預后不良的重要原因。部分患兒對某些化療藥物具有先天耐藥性，這部分患兒的耐藥可以通過聯合使用其他化療藥物或加大藥物使用劑量來克服。還有一些患兒是在使用化療藥物一段時間后才發生的獲得性耐藥，導致ALL 的復發，這是治療失敗最常見的原因［9］。導致ALL 細胞對各類化療藥物產生耐藥的機制涉及了基因異常表達、信號通路異常調控、轉錄后異常修飾等。

2.1 激素類藥物的耐藥機制

GC 是兒童ALL 化療中的核心藥物，屬于細胞毒性藥物。 常用的GC 類藥物有地塞米松（dexamethasone， DEX）、 潑 尼 松 （prednisone，PRED） 等。細胞質內的GC 受體（glucocorticoid receptor，GR）可以結合GC 類藥物，隨后轉移至細胞核，與特定的基因位點結合，最終激活促凋亡因子表達。

大量研究已經證實了細胞的GR 表達異常、基因組不穩定、轉錄后調控異常、信號通路調節異常、代謝重編程、RNA 差異剪接、自身抵抗等可影響GC類藥物的治療效果。

GC功能性受體的數量可以直接影響細胞對于GC的敏感性。多項研究［11-13］表明，編碼GR 的關鍵基因核受體亞家族3C 組成員1 （nuclear receptor subfamily 3 group C member 1，NR3C1）的突變在GC耐藥的進程中發揮著直接作用。同時，研究［9］發現一些微RNA（microRNA，miRNA）的表達變化可以在轉錄后水平調控耐藥相關基因，介導治療過程中細胞對GC 類化療藥物的耐受。其中有研究［14］發現，miRNA-124可以抑制NR3C1的表達，miR-124的高表達可誘導細胞耐藥性，抑制DEX 誘導的細胞凋亡。同樣地，LIANG 等［15］也發現PRED 耐藥細胞系中miR-124的表達顯著高于敏感細胞系，并驗證了miR-124 通過抑制NR3C1表達引起ALL 的過度增殖和GC抵抗。

此外，信號通路和相關基因表觀遺傳學水平的調控異常，也可以引起細胞對GC 的耐受。多條信號通路，包括Notch、Janus 蛋白酪氨酸激酶/信號轉導與轉錄激活子（the Janus kinase/signal transducer and activator of transcriptions，JAK/STAT）、鼠肉瘤病毒/迅速加速性纖維肉瘤/絲裂原細胞外信號調節激酶/細胞外信號調節激酶（the rat sarcoma virus/rapidly accelerated fibrosarcoma/ mitogen extracellular signalregulated kinase/extracellular signal-regulated kinase，Ras/Raf/MEK/ERK）級聯通路和磷脂酰肌醇3激酶/第10 號染色體同源丟失性磷酸酶張力蛋白基因/蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白（the phosphati-dylinositol 3-kinase/phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome ten/protein kinase B/mammalian target of rapamycin，PI3K/PTEN/Akt/mTOR） 等在ALL 中存在過度激活［16-17］，這些通路能夠干擾GC 的促凋亡作用。各種報道顯示，多種信號通路突變可通過調節B淋巴細胞瘤-2 相互作用細胞凋亡介導因子（B-cell lymphoma-2 interacting mediator of cell death，BIM）的表達，減少GC 誘導的ALL 細胞凋亡。有報道［18］證實，BIM 增強子的異常甲基化能夠導致細胞對GC耐受，逆轉DNA 甲基化的增強，在一定程度上可恢復細胞對GC 的敏感性。另外，NR3C1共激活因子環磷腺苷效應元件結合蛋白結合蛋白（the cyclic-AMP response element binding protein binding protein，CREBBP）的突變頻率很高，它可導致包括GC 反應基因在內的CREBBP的靶基因產生組蛋白乙?；娃D錄調控受損，干擾GC 藥物的療效［10］。POULARD等［19］也曾針對此類抗藥機制進行了相關研究，結果顯示抑制GR 共激活因子的去甲基化，可以恢復耐藥細胞對GC 誘導的細胞死亡的敏感性，還可以減少大劑量GC治療所引起的不良反應。

RNA 剪接失調是許多癌癥的共同特征，同時也可影響藥物反應。SCIARRILLO 等［16］發現GC 耐藥的兒童ALL 樣本表現出剪接模式改變，在此基礎上作者研究認為靶向細胞RNA 剪接的治療策略可以用于克服ALL 細胞對GC 類藥物的耐受。在細胞代謝方面，STEEGHS 等［20］觀察到IKAROS 家族鋅指蛋白1（IKAROS family zinc finger 1，IKZF1）基因缺失與GC 耐藥性之間高度相關，上調了細胞內三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）和葡萄糖的水平，并且抑制糖酵解，可恢復PRED 藥物療效；作者認為這也可能是一種潛在的治療GC 耐藥ALL 的策略。在其他 方 面， RODERICK 等［21］證 明 前 列 腺 素E2（prostaglandin E2， PGE2） 激 活 的 環 磷 酸 腺 苷（cyclic adenosine monophosphate， cAMP） 信 號 與DEX 存在協同作用，兩者聯用可增強GC 耐藥的T 細胞 型ALL （T-cell acute lymphoblastic leukemia，TALL）細胞的死亡，確定了PGE2 是兒童復發ALL 中再增敏GC 類藥物的靶點。此外，也有研究［22］指出植物同源結構域指蛋白6 （the plant homeodomain finger protein 6，PHF6）具有轉錄抑制功能，直接與靶基因的啟動子區域結合進而調控基因表達。XIANG 等［23］發現在T-ALL 中PHF6基因缺失依賴于P21的表達上調來產生對PRED 的耐受作用，而使用P21抑制劑可逆轉該現象。

2.2 抗代謝類藥物的耐藥機制

2.2.1 葉酸拮抗劑類藥物的耐藥機制 MTX 作為常用的葉酸拮抗劑類藥物，是兒童ALL 鞏固和維持治療方案中廣泛使用的藥物，可阻斷核苷酸的生物合成和DNA復制，抑制腫瘤細胞的增殖。

葉酸多聚谷氨酸合成酶（folylpolyglutamate synthase，FPGS）可催化MTX 轉化為MTX 多聚谷氨酸 鹽（MTX-polyglutamate，MTX-PGn），MTX-PGn更容易貯存在細胞中，并且與底物二氫葉酸還原酶（dihydrofolate reductase，DHFR）、胸苷酸合成酶（thymidylate synthase，TS）的親和力明顯高于單體MTX，因此細胞內MTX-PGn蓄積量的差異會影響藥物治療效果。換言之，FPGS 的活性及表達會影響MTX 的療效。LIU 等［24］研究發現，β-連環蛋白（beta-catenin，β-catenin）可通過核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）通路下調FPGS 的表達，進而促進白血病細胞對 MTX 的耐藥性。WOJTUSZKIEWICZ 等［25］發現由抑制葉酸代謝等的化療藥物誘導的FPGS 剪接缺陷是引起白血病葉酸拮抗劑抵抗的一種新機制，FPGS 的核內不均一RNA（heterogeneous nuclear RNA，hnRNA）剪接異?？梢詫е翭PGS活性喪失引起MTX耐藥。

依賴ATP的藥物外排轉運體——如多藥耐藥蛋白1-5（multidrug resistance protein 1-5，MRP1-5）和乳腺癌耐藥蛋白（breast cancer resistance protein，BCRP），其功能是主動排出有機陰離子，包括MTX、環磷酰胺（cyclophosphamide，CTX）、阿糖胞苷（cytosine arabinoside，araC）等化療藥物，從而降低細胞內藥物濃度。JARAMILLO等［26］認為，MRP4和BCRP的過度表達促使MTX從細胞中排出，是ALL耐藥復發的潛在機制。其中MRP4的變異與MRP4 的前信使RNA（pre-messenger RNA，pre-mRNA）的異常剪接［27］，可導致MRP4的異常表達，進而引起耐藥。

另外有研究者［28-29］通過敲除富含AT相互作用功能5B（AT-rich interaction domain 5B，ARID5B）基因使細胞產生對MTX和6-MP的特異性耐藥，進一步發現ARID5B在一定程度上是通過干擾細胞周期進程，來決定抗代謝藥物敏感性的機制。已有研究［30］表明，細胞周期蛋白D1（cyclin D1，CCND1）也參與葉酸代謝的調控，其過度表達會擾亂正常的細胞周期，增加細胞周期相關轉錄因子E2F（early 2 factor，E2F）的釋放來升高編碼葉酸代謝酶的基因轉錄，這也是引起MTX耐藥的機制之一。

2.2.2 硫嘌呤類藥物的耐藥機制 目前，維持階段的ALL 治療普遍應用以硫嘌呤類藥物為基礎的療法，調查［31］顯示，使用了最佳藥物劑量強度并且依從度較高的患者，其無事件生存率明顯提高。臨床上用于治療ALL 的硫嘌呤類藥物主要包括6-MP、AZA、6-TG 等。硫嘌呤類藥物進入體內后，經過一系列代謝酶的催化反應，形成有活性的代謝產物巰基鳥嘌呤核苷酸（thioguanine nucleotides，TGNs），TGNs可插入DNA中，誘導DNA損傷，進而引起腫瘤細胞凋亡。

現有研究發現硫嘌呤類藥物耐藥機制主要與其代謝過程有關，最常見的機制是細胞質5′核苷酸酶Ⅱ（cytosolic 5'-nucleotidase Ⅱ，NT5C2）和磷酸核糖焦磷 酸 合 成 酶 1 （phosphoribosyl pyrophosphate synthetase 1，PRPS1）的基因突變。NT5C2編碼一種進化上保守且普遍表達的核苷酸酶，研究［31-34］發現NT5C2的激活突變與6-MP 治療后ALL 的復發直接相關，NT5C2突變體使有細胞毒性的6-TGNs 去磷酸化，降低藥物活性，引起ALL 細胞的耐藥。BARZ等［35］通過對455 例復發患兒測序分析發現，與無NT5C2突變的患兒相比，具有NT5C2突變克隆或亞克隆的患兒預后較差。

PRPS1是核苷酸合成的關鍵酶，用來催化核苷酸生物合成途徑中限速的第一步反應［36］。本課題組前期在配對B-ALL 樣本中進行全外顯子測序，發現BALL 患兒中存在嘌呤合成限速酶PRPS1 的復發特異性突變［37］。我們認為功能激活型PRPS1突變體持續激活嘌呤從頭合成途徑，使下游代謝產物次黃嘌呤異常積累，最終競爭性地抑制化療藥物6-MP和6-TG的功能，特異性削弱嘌呤類似物的療效，導致ALL 耐藥復發。此外，實驗結果顯示在體外可以使用嘌呤合成途徑的抑制劑來克服ALL細胞的耐藥性。

DNA 錯配修復關鍵基因mutS 同源物6（mutS homolog 6，MSH6）的低表達可以造成DNA 錯配修復系統的級聯信號無法正常傳遞，導致細胞對化療藥物6-MP 的敏感性降低，降低藥物引起的白血病細胞凋亡［38］。另外，YU 等［39］研究結果表明，硫嘌呤類藥物結合使用MTX 可增加6-MP 向TGNs 的轉化，并且MTX多谷氨?；潭冉档筒粌H會影響MTX的抗白血病效果，還會交叉影響6-MP的活性。

2.2.3 促氨基酸代謝類藥物的耐藥機制 天冬酰胺（asparagine，ASN）是ALL 細胞生長所需要的氨基酸之一。與正常細胞不同，白血病細胞自身無法合成ASN，當細胞外基質缺乏ASN時腫瘤細胞的蛋白質合成和增殖將被遏制；而正常細胞可以上調天冬酰胺合成酶（asparagine synthetase，ASNS）進行ASN 的生物合成，維持胞內ASN的供給。臨床常用化療藥物LASP可迅速耗竭血漿ASN，干擾細胞周期和ASN依賴性蛋白的生物合成，發揮殺死腫瘤細胞的作用。

早期研究發現使用L-ASP后異常激活腫瘤細胞內的ASNS 是其耐藥的主要機制，多年來研究人員發現了更多的耐藥機制。LEE等［40］運用全基因組RNA干擾（RNA interference，RNAi）篩選，確定了亨廷頓蛋白相關蛋白1 （huntingtin-associated protein 1，HAP1）的缺失通過下調Ca2+介導的凋亡通路，阻止L-ASP誘導的細胞凋亡，引起腫瘤細胞耐藥。

此外，耐藥細胞可以利用體內的蛋白質降解后生成的ASN 來維持細胞增殖，產生L-ASP 耐藥。HINZE 等［41］篩選全基因組發現，Wnt 信號通路的激活與L-ASP 聯合使用對腫瘤細胞具有合成致死的作用。作者表明，Wnt介導的L-ASP敏感化并不依賴βcatenin，而是依賴于Wnt介導的蛋白質穩定性（Wntdependent stabilization of proteins，Wnt/STOP），遏制糖原合酶激酶3（glycogen synthase kinase 3，GSK3）依賴的蛋白質泛素化與蛋白酶體降解，減少蛋白質降解生成的ASN，因而Wnt 途徑激活可提高不同耐藥亞型ALL 細胞的L-ASP 敏感性。 同樣地，WILLIAMS 等［42］借助代謝組學等方法篩選出轉錄因子鋅指和BTB 結構域包含蛋白1 （zinc finger and BTB domain containing 1，ZBTB1），在后續實驗發現ZBTB1可以特異性地在T-ALL 細胞中促進ASNS 轉錄進而誘導L-ASP 耐藥，同時ZBTB1的缺失可使耐藥T-ALL細胞對L-ASP敏感。

2.3 生物堿類藥物的耐藥機制

常用的生物堿類藥物主要有VCR、長春地辛、長春堿等。VCR 是一種抗微管生物堿類藥物，可破壞有絲分裂過程中微管組織形成的紡錘體，使惡性細胞的有絲分裂進程停滯，抑制癌細胞的活躍增殖。可單獨或與其他藥物聯合使用，對于包括ALL 在內的多種腫瘤疾病療效顯著。目前對于VCR 在ALL 中的耐藥機制的報道較少，多與介導藥物外排的轉運體產生的多藥耐藥相關。

ABERUYI等［43］注意到耐受MTX 的ALL細胞系對于VCR、GC 等藥物具有交叉耐藥性，認為可能的原因是三磷酸腺苷結合盒（ATP-binding cassette，ABC） 轉運蛋白家族過度表達和上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT） 相關基因選擇性失調，導致藥物外流增加。多年來的研究證明外排轉運體的過度表達能夠使細胞對VCR、CTX、DNR 等多種細胞毒性藥物交叉耐受。VCR 是多種藥物外排轉運體的底物， 包括P- 糖蛋白（Pglycoprotein，P-gp）。FU 等［44］在對特異性耐受VCR的ALL 變異細胞系的研究中，發現復發ALL 的耐藥性與P-gp 的過度表達顯著相關。P-gp 是最早被發現與耐藥有關的ABC 轉運蛋白［45］，也是研究最多的一類外排轉運體；其作用研究最為明確，對P-gp 進行抑制可以增加藥物在耐藥細胞中的蓄積。

在胃癌和結直腸癌等的研究［46-47］中，已經發現幾種致癌的miRNA 與VCR 抗性有關：如miR-19a/b可通過抑制靶基因PTEN的表達來增強胃癌細胞的VCR 抗性；同時具有抑癌功能的miRNA 能夠逆轉癌細胞對VCR 的抗性，如miR-222 可以沉默去整合素-金屬蛋白酶17（a disintegrin and metalloprotease 17，ADAM17）的表達使耐VCR 的大腸癌細胞對VCR 增敏，miR-129-5p、miR-508-5p 和miR27b 可 以 沉 默ABC 轉運蛋白使耐藥胃癌細胞恢復VCR 敏感性。然而更多的VCR 耐藥性機制有待進一步的研究揭示，以指導臨床治療策略。

2.4 蒽環類藥物的耐藥機制

DNR能夠抑制細胞RNA和DNA的合成，是一種能在細胞周期各個階段發揮細胞毒作用的蒽環類抗腫瘤化療藥，是許多急性髓系白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）治療方案中的關鍵成分。目前關于蒽環類化療藥研究的耐藥機制主要涉及5 個方面——拓撲異構酶Ⅱ活性改變、腫瘤細胞干性形成、DNA修復改變、代謝適應以及前文提到的藥物外排轉運體過度表達等［48］。

醛酮還原酶1C3 （aldo-keto reductase family 1 member C3，AKR1C3） 是 醛 酮 還 原 酶（aldo-keto reductases，AKR）超家族的一員，與體內類固醇代謝密切相關；其過度表達能使蒽環類藥物代謝為效力較低的C-13 羥基代謝物，進而降低藥物產生的細胞毒作用［49-50］。MORELL 等［49］發現在AML 中，抑制Bruton酪氨酸激酶（Bruton tyrosine kinase，BTK）能夠逆轉AKR1C3 介導的DNR 失活，證明了BTK 抑制劑與DNR 具有很好的聯合治療作用。另外，環磷腺苷效應元件結合蛋白（the cyclic-AMP response element binding protein，CREB）是一種能刺激基因轉錄的反式激活因子，GAO等［51］認為增殖率低的腫瘤細胞對化療不敏感，其研究揭示CREB 的結合蛋白CREBBP 下調可限制細胞周期S 期的進入，顯著抑制白血病細胞增殖，并引起細胞對DNR 耐藥，而CREBBP的過表達顯著加速了細胞增殖。P-gp轉運體同樣能夠識別DNR，將其從細胞中移除。

3 總結與展望

ALL 已經成為威脅兒童健康的重要疾病，而耐藥復發是兒童ALL 治療失敗和死亡的主要因素，也是臨床治療的瓶頸，是國內外兒童ALL 領域研究的熱點與焦點。研究人員利用全基因組篩選、代謝組學等先進手段，發現與ALL 耐藥復發相關的基因變異和多種相互交叉、復雜交織的機制，并提出針對性治療方案，逐步提高了患兒的治愈率和生活質量?；蚪M變異、轉錄后修飾、表觀遺傳學漂移、核酸代謝、代謝酶的修飾、細胞周期及信號通路異常等多種因素，均可成為治療兒童ALL 耐藥復發的關鍵靶標，或將為建立患兒的個體化精準化療方案提供幫助。