中高溫大曲在制曲過程中微生物區系演替特征及功能研究

劉慧,涂璇,3*,呂育財,3,任立偉,3,周超,周翰林,陳萍,譚光訊,楊博,龔大春,3

1(湖北省生物酵素工程技術研究中心(三峽大學),湖北 宜昌,443002)2(三峽大學 生物與制藥學院,湖北 宜昌,443002) 3(中國輕工業功能酵母重點實驗室(三峽大學),湖北 宜昌,443002)4(湖北稻花香酒業股份有限公司,湖北 宜昌,443112)

酒曲作為白酒釀造過程中的糖化發酵劑,是白酒發酵的源動力。白酒酒曲種類豐富多樣,根據制曲工藝的不同[1],酒曲可分為大曲、小曲、麩曲、麥曲及紅曲五大類,其中大曲應用最為廣泛。濃香型白酒釀造主要采用中高溫大曲,依靠自然界帶入的各種野生菌在曲坯上富集生長,以獲得各種有益于發酵的微生物,起著糖化、產酒精以及產風味物質的作用,是影響白酒產量、品質、香型與風格的重要因素[2]。

白酒發酵是一個極其復雜的生物學過程,涉及到不同微生物的生長代謝以及種群數量的動態變化,其演替過程一直是限制對白酒釀造進行科學控制的關鍵瓶頸之一。應用于大曲微生物研究的技術主要有傳統平板分離[3]、BIOLOG微平板分析[4]和聚合酶鏈反應-變性梯度凝膠電泳(polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis,PCR-DGGE)[5]等,但傳統的平板分離技術只能對大曲中的可培養菌種進行研究。BIOLOG 技術依賴于群體的生理活性,對于生長較慢的微生物不適用。PCR-DGGE 技術只能分離低于500 bp 的較小片段,準確率低。以上技術的應用存在一定的局限性,不能全面地描述酒曲微生物群落多樣性[6]。高通量測序技術成本低、穩定性高、可讀量和質量高,是目前評估微生物多樣性的有力工具[7],在菌群分析中,該技術能快速、準確的解析微生物菌群結構。YANG等[8]采用高通量測序技術分析大曲發酵過程中的優勢微生物,獲得優勢真菌16種,優勢細菌18種,為進一步研究大曲制備過程中功能微生物奠定了基礎。陳申習等[9]和沈毅等[10]分別利用Illu- mina Miseq和Illumina HiSeq高通量測序技術分析出高溫大曲中Rhizopus、Aspergillus、Candida、Ther-moascus、Pantoea、Thermoactinomyces、Kroppenstedtia和Lactococcus作為主要優勢菌屬。

制曲過程中大曲微生物區系的組成及變化不僅決定曲塊中物質和能量代謝的走向,也決定了該香型白酒風格的形成。為全面了解濃香型白酒中高溫大曲在培菌發酵期、后熟貯藏期間微生物群落的演替規律及其微生物組成與大曲各項理化、生化特征之間的相關性,本研究擬用Illumina Novaseq二代測序技術對大曲進行全面、系統的研究,揭示在制曲過程中起關鍵作用的微生物類群,為中高溫大曲制作過程中大曲功能微生物結構組成以及科學制曲提供重要依據。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

本實驗所取大曲樣品來自某白酒公司制曲車間。樣品包括制曲過程中所需的原料小麥、曲房稻草、曲房谷殼以及濃香型大曲培菌發酵期1、7、13、28 d、后熟貯藏期59、346、399 d在內的11個樣品。采取三點取樣法,將同一時間的樣品混合均勻,每個樣品分為2份,-80 ℃保存用于高通量測序,-20 ℃保存用于理化和生化特征測定。本實驗所使用的大曲樣品及樣品信息見表1。

表1 實驗所使用大曲樣品信息表Table 1 Basic information of Daqu samples used in the experiment

1.2 大曲樣品理化及生化特征測定

測定大曲樣品在制作過程中不同時間段的理化、生化特征。理化特征測定包括溫度、含水量、pH值、還原糖含量、淀粉含量;生化特征測定包括糖化力、液化力、酯化力、發酵力、蛋白酶活力。溫度測定參照溫度計法,含水量測定參照烘干法[11],pH值測定參照酸度計法[12];還原糖含量測定參照二硝基水楊酸(dinitrosalicylic acid,DNS)法[13];淀粉含量、糖化力、液化力、酯化力、發酵力測定參照QB/T 4257—2011《釀酒大曲通用分析方法》[14]。蛋白酶活力測定參照SB/T 10317—1999 《福林酚法》[15]。

1.3 大曲微生物菌群分析

基于Illumina Nova平臺的測序由天津諾禾致源科技有限公司完成。真菌采用ITS-rDNA上的ITS2可變區進行擴增、細菌采用16S rRNA上的V3～V4區進行擴增,構建小片段文庫,進行雙末端測序(Paired-end)。

采用FLASH軟件[16]對測序原始數據進行拼接,將低質量的序列利用QIIME軟件[17]進行過濾,去除嵌合體,得到最終有效序列。利用Uparse軟件[18]對樣本進行聚類,97%一致性(Identity)將序列聚類成為操作分類單元(operational taxonomic units,OTUs),將OTUs中出現頻數最高的序列選取為代表性序列。利用Mothur方法與SILVA138的SSUrRNA數據庫[19]對OTU進行分類學注釋。利用QIIME軟件[17]對樣品進行多樣性分析。使用R軟件進行稀釋曲線繪制、主坐標分析(principal coordinate analysis,PCoA)、樣本聚類分析、相關性分析等。

原始數據已上傳至NCBI數據庫(SRA PRJ- NA790492、PRJNA790489)。

2 結果與分析

2.1 大曲樣品理化及生化特征分析

大曲的理化和生化特征是評價酒曲品質的重要指標,大曲在制備過程中,從原料到成曲,其理化特征和生化特征都發生顯著變化,這些特征是決定白酒釀造啟動的關鍵因素。大曲制作過程中理化特征和生化特征測定結果如表2所示。大曲發酵的理化、生化特征隨培養時間和培養環境的變化而變化。溫度是影響大曲微生物數量和種類的重要因素。在大曲制作過程中,曲房的溫度和曲塊溫度均呈現先上升后下降趨勢。從第1天開始曲塊進入曲房進行堆積,通過鋪稻草及關門窗等保溫措施,保證微生物生長,隨后其生理代謝活動開始頻繁,大曲品溫迅速增加。在大曲入房7 d時,大曲溫度可達到60 ℃,即最高品溫。為了避免燒曲,會對曲房進行通風和翻曲處理,7～28 d 期間曲房的溫度和大曲品溫逐漸下降。在該過程中,大曲水分隨微生物發酵的進行而逐漸降低。pH先增高后降低,其主要是微生物通過生長代謝產生有機酸,發酵13 d時pH達到最高值6.69,發酵13 d后,pH下降到6.1左右。還原糖含量在發酵期間逐漸增大,淀粉含量逐漸減少,28 d時還原糖含量由第1天的49.99 mg/g上升至120.64 mg/g,淀粉含量由最初的614 mg/g降至332 mg/g,主要原因是微生物生長代謝將大量淀粉分解成為寡糖或還原糖等。28 d后大曲從曲房移入通風、干燥的曲庫,進入后熟貯藏期,曲塊溫度繼續下降逐漸接近室溫,pH、含水量、淀粉含量、還原糖含量均逐漸下降達到相對穩定。

大曲的品溫和水分為其發酵過程中微生物的生長繁殖與生理代謝提供了條件。大曲在發酵期間,絲狀真菌、酵母菌和細菌等微生物大量生長繁殖。其中絲狀真菌會產生多種酶系,如液化型淀粉酶和糖化酶,可將原料中的淀粉分解成寡糖和還原糖,致使大曲液化力和糖化力在28 d時分別增至0.27 U和582.00 U。酵母菌和細菌在可利用的還原糖進行生長的同時啟動酒精發酵、酯化反應,致使發酵力于7 d時達較高水平,即1.60 U,酯化力于13 d達較高水平,即465.54 U。此外絲狀真菌可產生蛋白酶分解蛋白質。在后熟期間(28～399 d),曲中營養物質在培菌期已大量消耗,此時霉菌、酵母菌和細菌數量大大降低,產酶量減少,各類酶活力迅速減弱直至穩定。

表2 中高溫大曲制備過程中大曲理化、生化特征的測定Table 2 Physicochemical and biochemical properties of medium-high-temperature Daqu during the starter-making process

2.2 大曲微生物結構組成與動態演化分析

2.2.1 高通量測序結果及Alpha多樣性分析

Alpha-diversity用于分析樣品的微生物群落多樣性[17]。利用Illumina Nova測序平臺對ITS2和16S rRNA基因進行測序,分別得到大曲制備過程中不同時間的樣品有效序列數、OTUs及Alpha多樣性分析指數。如表3所示,這兩項技術均表明獲得了較為理想的序列總數,11個大曲樣品共得到1 715個OTUs。樣品覆蓋率均>98%,表明該試驗取樣合理,測序結果能真實反映樣本的實際情況。從多樣性指數分析發現jq2微生物多樣性和豐富度都較低,隨著發酵的進行,環境中的微生物進入到曲塊中,曲塊的微生物多樣性和豐富度逐漸增加,jq3微生物多樣性和豐富度達到第1個高峰,jq5達到第2個高峰,之后由于底物的消耗以及外界環境的阻遏,多樣性指數開始降低,最終趨于穩定。由此,可將jq2～jq3記為發酵前期,jq3～jq5記為發酵后期,jq5～jq8記為后熟期。

表3 中高溫大曲制備過程中大曲中真菌和細菌的序列數量、操作分類單元和Alpha多樣性指數分析Table 3 Sequence number, OTUs, and Alpha-diversity indices of fungi and bacteria in medium-high-temperature Daqu during the starter-making process

2.2.2 Beta多樣性分析

Beta多樣性用以分析不同樣本間微生物群落組成的差異,結果如圖1所示。可看出第一個主坐標軸(PCoA 1)在真菌和細菌群落差異的貢獻值分別為67.07%和66.91%。由圖1-a、圖1-b可發現大曲jq2與qa相關性較強,在發酵過程中,隨著大曲發酵時間的進行,樣本在PCoA1上逐漸移動,真菌中與qb、qc距離較近,相關性較高,細菌中與qa相關性較強,后期大曲微生物均聚集在一起,結構趨于穩定。說明qa中的菌群對大曲初期微生物影響較大,而qb、qc菌群對發酵過程中大曲微生物影響較大。此外,可將樣品分成兩個聚類,其中jq2與qa為1個聚類,jq1、jq3～jq8與qb、qc為1個聚類(圖1-c),推測qb、qc即稻草、谷殼對大曲微生物菌群有重要影響。

a-大曲真菌PCoA圖;b-大曲細菌PCoA圖;c-大曲微生物聚類樹圖1 中高溫大曲菌群中真菌和細菌主坐標分析和聚類分析Fig.1 PCoA and cluster analysis of fungal and bacterial communities in medium-high-temperature Daqu

2.3 大曲制作過程中不同時間段微生物群落結構分析

對上述的OTUs序列進行物種注釋,可展示物種組成及豐度信息(圖2)。真菌和細菌分別注釋到門水平的比例為81.04%、70.82%。將豐度<1%的合并為一類(others),大曲真菌群落獲得8個門類、255個屬。主要包括Ascomycota下的Issatchenkia(28.12%)、Thermoascus(16.16%)、Trichocladium(14.14%)、Aspergillus(6.44%),以及Mucoromycota下的Rhizopus(7.15%)、Rhizomucor(5.43%)。大曲細菌群落共分析得到10個門類、262個屬。其中相對豐度較高的是Firmicutes下的Weissella(39.60%)、Lactobacillus(17.43%)、Bacillus(2.14%)。在大曲制作過程中,微生物種類不斷增加,在粉碎小麥壓成曲塊時(jq2),曲中的Blumeria豐度較高,與qa(小麥)菌群結構相似,此時環境中的微生物還未進入曲塊進行生長繁殖。大曲移入曲房進入培菌期間,由于曲房溫度較為適宜,大曲微生物種類急劇增加,此時Issatchenkia、Thermoascus、Rhizopus、Rhizomucor、Weissella和Lacto-bacillus豐度升高。培菌期結束大曲移入曲庫進入貯藏期,Aspergillus、Rhizopus、Thermoascus等豐度逐漸降低,Bacillus、Saccharopolyspora和Streptomyces豐度增大。貯藏期相對培菌期而言,微生物種類較少,這是由于曲庫環境溫度和濕度均明顯降低,曲塊營養物質被大量消耗且含水量較低,導致大量微生物死亡,最終使得大曲微生物菌群趨于相對穩定。

2.4 大曲制作過程中不同時間段微生物與理化特征相關性分析

對大曲制作過程中屬水平微生物優勢菌相對豐度與理化、生化特征之間進行相關性分析(圖3)。發現溫度是影響大曲微生物群落結構變化的最主要因素,其次是水分。溫度與Thermoascus、Issatchenkia、Candida等大部分微生物豐度呈正相關,相關系數為0.14～0.90,與少部分菌群豐度呈現負相關。表明環境溫度變化可影響曲塊溫度變化,從而影響大曲中菌群結構組成,使其功能發生改變。

a-屬水平大曲真菌群落;b-屬水平大曲細菌群落圖2 中高溫大曲制作過程中真菌和細菌群落群落結構Fig.2 Structure of fungal and bacterial communities in medium-high-temperature Daqu during the starter-making process

糖化力、液化力等作為大曲的重要性質,決定大曲的品質。大曲的生化特征主要受Rhizopus、Rhizomucor、Weissella、Lactobacillus影響,該4種菌屬與糖化力、液化力等呈正相關。其中Rhizopus與糖化力、液化力、酯化力和酸性蛋白酶活力呈正相關,相關系數均>0.6,其中與酸性蛋白酶活力相關系數達0.96;Rhizomucor與液化力、酯化力和中性蛋白酶活力相關系數均>0.6,與酯化力最為相關,其系數達0.71;Weissella與糖化力、液化力和酯化力相關系數為0.61～0.75;Lactobacillus與糖化力、液化力、發酵力和蛋白酶活力相關系數均>0.54,其中與發酵力相關系數高達0.75。此外,Issatchenkia僅與發酵力相關系數>0.6,與其余生化特征相關系數均<0.45。Aspergillus與各項理化、生化特征相關系數均<0.51,與發酵力和中性蛋白酶活力更是呈現負相關。說明Issatchen-kia與Aspergillus對大曲品質影響較小,影響大曲功能的關鍵微生物種屬是Rhizopus、Rhizomucor、Weissella、Lactobacillus。

圖3 中高溫大曲制作過程中優勢微生物與理化生化特征之間的相關性分析(屬水平)Fig.3 Correlation analysis between dominant microbial taxa and physicochemical and biochemical properties of medium-high-temperature Daqu during the starter-making process (genus level)

3 結論與討論

中國白酒歷史悠久,種類多樣,有典型的地域特色。各地白酒除原料和工藝存在差異外,參與釀造前期的酒曲微生物也隨酒曲的種類以及地域環境不同而不同,是影響白酒品質與風味的重要因素。本研究通過高通量二代測序分析,發現在該大曲制作過程中,酒曲微生物主要來自曲房環境,真菌歸屬于8個門、255個屬,細菌歸屬于10個門、262個屬。主要優勢真菌屬為Issatchenkia、Thermoascus、Trichocladium、Aspergillus、Rhizopus、Rhizomucor,優勢細菌屬為Weissella和Lactobacillus,細菌群落的多樣性相對于真菌更為豐富。譚崇堯等[20]對不同地域的濃香型白酒大曲進行分析,發現長江中游地區大曲優勢真菌為Aspergillus、Thermoascus等,優勢細菌為Lactobacillus、Pediococcus、Leucanostoc等;在西南地區,優勢真菌包括Thermoascus、Aspergillus等,優勢細菌包括Weissella、Lactobacillus、Bacillus等。不同地區或不同原料制得的濃香型中高溫白酒大曲微生物群落結構既有共性之處,也有一定的特性,研究發現以Thermoascus、Aspergillus、Lactobacillus等為代表的菌屬都是酒曲中的優勢菌屬,具有一定的普遍性。此外,本研究通過多樣性和菌群結構分析,大曲發酵期間出現的Issatch-enkia、Thermoascus、Rhizopus、Trichocladium、Lichtheim-ia、Weissella、Brevibacterium在qb、qc中存在,由此可推斷曲房中的稻草和谷殼是大曲微生物的主要來源,對大曲微生物類群組成影響較大。

中國傳統食品發酵是一個復雜的多菌種自然發酵過程,也是一個相對穩定又動態變化的微生態系統。本研究通過相關性分析揭示了該大曲中微生物結構組成與功能之間的關系,并了解大曲中不同微生物對大曲發酵性能的影響程度。在大曲發酵過程中,溫度是影響微生物菌群結構的主要環境因子,因此控制曲房溫度極為重要。此外,影響大曲功能的主要微生物是Rhizopus、Rhizomucor、Weissella、Lactobacillus。雖然Issatchenkia和Aspergillus在菌群數量占有優勢,但其與大曲理化、生化特征相關性不顯著,說明功能微生物與其種群數量并不完全一一對應。賈云等[21]通過相關性分析也發現豆瓣醬中的Aspergillus、Bacillus、Weissella等主要與酶活性呈正相關,而細菌群落中豐度最高的Staphylococcus與酶活性卻呈負相關。由此可見,種群數量優勢的菌功能并不一定強,發揮優勢功能的菌在大曲中的豐度不一定是最高。利用二代測序技術結合相關性分析,能全面有效地了解大曲制作過程中微生物群落演替規律和影響大曲功能的關鍵因素,對科學制曲具有重要的的指導意義。