基于主成分分析的微孔膜包裝對延緩黃瓜冷貯后細胞膜脂過氧化及品質劣變研究

尹杰文,何曉梅,賈嘉懿,張鍶苑,肖徐,張敏*

1(西南大學 食品科學學院,重慶,400715)2(西南大學 食品貯藏與物流研究中心,重慶,400715) 3(漯河市衛龍生物技術有限公司,河南 漯河,462000)

黃瓜在我國大部分地區以及全球廣泛種植,其營養價值高,富含糖類、氨基酸、維生素等多種營養成分。但是在貯運過程中,黃瓜因其含水量極高,易受自身蒸騰作用的影響導致瓜身易失水皺縮[1],品質下降。黃瓜采后還會因為葉綠素降解而發生黃化現象[2],影響其商品特性。低溫冷藏是黃瓜最常見也是比較簡單的保存方法,適當的低溫可以有效延長黃瓜的保存時間,但溫度過低,可能會導致黃瓜出現冷害現象[3],如呼吸增強,表面塌陷,腐爛加重等癥狀。果實在受到逆境脅迫的時候會產生活性氧攻擊果蔬細胞膜,導致細胞內容物外滲,相對電導率和丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量也會因此升高[4],而MDA含量增加之后還會進一步的對細胞膜進行攻擊,造成細胞功能喪失。所以控制活性氧的含量以及保持相關抗氧化酶的活性在果蔬保鮮中起著重要作用。

微孔膜包裝通過調節包裝膜上的孔數和孔徑來控制包裝內的氣體成分,使果蔬處于適宜保鮮的氣體比例中,比不打孔的普通包裝保鮮效果更好,比需要專用機器和氣體的氣調包裝技術成本更低,更適宜推廣應用。俞靜芬等[5]通過微孔膜結合1-甲基環丙烯(1-methylcyclopropene,1-MCP)處理對水蜜桃進行貯藏,發現與對照組相比,果實的腐爛率、失重明顯降低,保持了果實硬度,延長了果實的貨架期。目前關于微孔膜延長黃瓜保鮮的機理,特別是細胞膜脂過氧化方面的研究文獻比較缺乏。

主成分分析(principal component analysis,PCA),是一種可以實現數據降維的方法,它將原始的數據中具有相關性的自變量收集到不同主成分當中,使各主成分之間互不相關,從而對原始數據進行綜合和簡化,能夠分析出各種處理方式的綜合效果,以及對各指標的影響程度[6]。目前PCA已經廣泛應用于果蔬的品質分析當中,如桃[7]、李子[8]、芹菜[9]等,而應用于黃瓜保鮮方面卻鮮有報道。本實驗采用微孔膜對冷藏黃瓜進行包裝,利用PCA研究細胞膜脂過氧化及品質劣變情況,探討微孔膜包裝對冷藏黃瓜冷害抑制及品質保護的效果,為低成本的微孔膜技術在黃瓜冷藏保鮮中的推廣應用提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃瓜采購于重慶市北碚區天生農貿市場,所購黃瓜大小、長度均勻,表皮無破損,個體堅挺,八成熟。購買之后立即送往實驗室處理。聚丙烯(polypropylene,PP)防霧膜(厚度25 μm,O2透過率1 256.5 cm3/(m2·2 4 h·atm),23 ℃),河南前瞻包裝材料有限公司。所有化學試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

UV-2450PC紫外可見分光光度計,日本島津公司;DDS-307A電導率儀,上海雷磁公司;RXZ-8000智能人工氣候箱,寧波東南儀器有限公司;GY-4數顯式果實硬度計,浙江樂清艾德堡儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品準備

將購買的黃瓜用清水洗凈之后晾干備用。用PP防霧膜進行不同孔數的防霧膜的包裝,包裝袋長寬為40 cm×30 cm,用孔徑為0.3 mm的小針均勻地打孔。試驗周期設置為2周(在4 ℃冷藏條件下冷藏1周后移入23 ℃室溫下貯存1周),模擬冷藏及常溫流通銷售的溫度條件。試驗組為4組,且每組6根黃瓜,具體處理如下:(1)對照組:不進行包裝;(2)膜包裝無孔組:PP防霧膜包裝不打孔;(3)微孔膜8孔組:PP防霧膜包裝并在袋上打8個孔;(4)微孔膜16孔組:PP防霧膜包裝并在袋上打16個孔。將處理好的各組樣品放入人工氣候箱中,冷藏環境設置為4 ℃、相對濕度85%～95%,每個組別設置3個重復。每2 d隨機取樣1次,分別進行各項指標的測定。

1.3.2 指標測定

1.3.2.1 感官評價

請10位經培訓過的食品科學學院學生為各組樣品打分,根據果實的果皮、果肉、氣味、腐爛程度進行評定,分值8～1分別代表極好、非常好、好、一般、較差、差、非常差、極差,各項結果記總分后取其平均值。評分標準和計分方法如表1所示。

表1 感官評定標準Table 1 Standard of sensory evaluation

1.3.2.2 相對電導率

參考趙普瑩[10]的方法并作適當修改,根據水浴前后2次測定的電導率計算其相對電導率(γe),計算公式見公式(1):

(1)

1.3.2.3 呼吸強度

參考曹建康等[11]的靜置法進行測定,根據滴定結果計算黃瓜的呼吸強度,單位以mg CO2/(kg·h)表示。

1.3.2.4 果實硬度

用硬度計進行測定,在瓜身和兩頭分別隨機取3個點[12],用3.5 mm直徑的探頭進行測定,單位為N,計算3點測量結果的平均值和標準差。

1.3.2.5 脂氧合酶(lipoxygenase,LOX) 活性

參考TODD等[13]的方法并稍作修改,以每克黃瓜鮮重每分鐘吸光度增加0.01為1個LOX活性單位,以0.01ΔOD234/(min·g) mF表示。

1.3.2.6 MDA含量

參考CHEN等[12]的方法并稍作修改,每克黃瓜鮮樣中的MDA含量用μmol/g mF表示。

1.3.2.8 過氧化物酶(peroxidase,POD)活性

參考CHEN等[12]的方法并作適當修改,以每克黃瓜鮮樣每分鐘吸光度變化1為1個POD活性單位,表示為ΔOD470/(min·g)。

1.3.2.9 超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性

參照曹建康等[11]的方法并作適當修改,用氮藍四唑還原法測定,以每克黃瓜鮮樣在560 nm處每分鐘對氮藍四唑光化還原抑制達50%為1個SOD活性單位(U)。

1.3.2.10 過氧化氫酶(catalase,CAT)活性

參照曹建康等[11]的方法,并稍作修改,以每克黃瓜樣品每分鐘吸光度變化0.01為1個CAT酶活性單位,表示為0.01ΔOD240/(min·g)。

1.3.2.11 葉綠素含量

參考ARNON[14]的方法并稍作修改,計算每克樣品中所含葉綠素的質量,用mg/g表示。

1.4 數據統計分析

采用Microsoft Excel 2016對試驗數據進行整理計算,使用SPSS18.0單因素方差分析和Duncan多重比較分析對各項指標進行顯著性分析,用Origin 8.6對數據結果進行作圖,用The UnscramblerX10.4對各項數據進行PCA。

2 結果與分析

2.1 感官評價

本次實驗將感官評價得分低于6分的黃瓜判定為失去商品性。如圖1所示,各組感官評價得分均隨貯藏時間的延長呈現出下降趨勢,其中,CK組在第4天明顯出現表面變軟,腐爛加重等冷害癥狀,移入室溫后腐爛霉變情況更加嚴重,在第6天時感官評價得分降為5.9,與實驗組均有顯著性差異(P<0.05),與LURIE等[15]的研究結果一致。這表明微孔包裝可以在一定程度上抑制黃瓜果實的品質劣變;自貯藏第8天起,實驗組感官評分下降速率均增大,但8孔組的感官評分仍為6.1,與無孔、16孔2組差異顯著(P<0.05);16孔組與無孔組在12 d時得分分別為5.6、5.3,均失去商品性。無孔組移入室溫后發生了霉變現象,可能是由于包裝袋內氣體交換率低,袋中相對濕度達到飽和,使得無孔組黃瓜發生了腐敗現象,或是袋中O2含量低于黃瓜的耐受程度從而發生了無氧呼吸[16];16孔組移入室溫后黃瓜雖未出現霉變但發生了黃化老化現象,可能是因為氣體交換速率高,使得包裝袋內氣體環境與外界空氣相似;8孔組黃瓜品質則始終保持在高水平,原因可能是微孔膜孔數適宜,維持了適宜的濕度和氣體環境,因而使得黃瓜品質保持最佳。綜上所述,8孔數微孔膜組在維持黃瓜感官品質效果上最優。

2.2 相對電導率

在整個貯藏期間,由于黃瓜的低溫脅迫和自然衰老,各組相對電導率隨貯藏時間的延長而增大(圖2)。CK組4 d起與8孔、16孔組差異不顯著(P>0.05),第8天后與8孔組差異顯著(P<0.05),這可能是因為CK組受到冷害影響之后細胞膜結構遭到破壞,內容物滲出,導致相對電導率增大;8孔、16孔組相對電導率增加幅度最小,在貯藏結束時數值分別為38.97%、43.09%,相對電導率是細胞膜透性的表現,也是細胞膜受損程度的反映,所以8孔組、16孔組可能是因為氧氣較其他2組充足,未產生無氧呼吸,使細胞膜免受無氧呼吸產物(如乙醇等)攻擊,保護了細胞膜的透性,抑制了相對電導率的上升。蔡佳昂等[17]的研究苕尖的微孔包裝中得到了相同的結果。由上可知,各微孔膜處理組均可以顯著抑制黃瓜相對電導率的增大,降低了黃瓜膜透性的增大,但無孔組抑制效果明顯較弱,8孔數微孔膜組綜合抑制效果最好。

圖1 不同微孔膜包裝處理對黃瓜物流過程中感官評價的影響Fig.1 Effect of different microporous film packaging treatments on sensory scores during cucumber logistics

圖2 不同微孔膜包裝處理對黃瓜物流過程中相對電導率的影響Fig.2 Effect of different microporous film packaging treatments on the relative conductivity during cucumber logistics

2.3 呼吸強度

如圖3所示,各組呼吸強度隨時間延長整體呈現先下降后上升的趨勢,其中8孔、16孔2組呼吸強度趨向平穩。CK組在第4天時呼吸強度迅速上升后在第6天稍有下降,并在移入室溫后呼吸強度持續上升,第8天后與8孔、16孔2組差異極顯著(P<0.01),這可能是CK組出現了冷害癥狀而導致的,實驗組在貯藏前6 d呼吸強度均在緩慢下降,各組間無顯著差異(P>0.05);移入室溫后,無孔組呼吸強度持續上升,并在第10天后與8孔、16孔2組有極顯著差異(P<0.01),可能是由于隨著袋內呼吸強度的增加,O2含量逐漸降低并造成了黃瓜的無氧呼吸作用或由于無孔組出現了冷害癥狀,腐敗霉變導致呼吸急劇增強;8孔、16孔2組呼吸強度在移入室溫后有短期內的上升,第8天后變化幅度減弱,因為低溫對呼吸同樣具有抑制作用,溫度升高導致呼吸相關酶活性增強。但是8孔組呼吸強度始終低于16孔組,且兩組在第10天后產生顯著差異(P<0.05)。由此可見,無孔組雖然在前期對于抑制呼吸強度的極速上升有抑制和延緩作用,但并不能保持貯藏后期的低呼吸強度;8孔、16孔2組在整個貯藏期間都未出現呼吸強度的異常升高,使得黃瓜呼吸受到抑制,并且8孔組在后期抑制效果更好。綜合而言,8孔數微孔膜組能更好地控制黃瓜的呼吸強度。

圖3 不同微孔膜包裝處理對黃瓜物流過程中呼吸強度的影響Fig.3 Effect of different microporous film packaging treatments on respiratory intensity during cucumber logistics

2.4 硬度

果實的硬度是果實對抗外界壓力的直接表現,如圖4所示,各組硬度隨貯藏時間的延長逐漸降低,其中CK組下降速度最快,從第6天起與其他組差異顯著(P<0.05)。無孔組在第6天與8孔、16孔2組出現顯著差異(P<0.05),在整個貯藏期間,8孔組的硬度保持效果始終最佳,并在8 d后與其他2組實驗組差異顯著(P<0.05)。由此可知,各組微孔膜包裝在冷藏期間整體差異不明顯,而移入室溫后,由于外部溫度的上升,使得各組呼吸強度升高,呼吸強度的升高導致活性氧生成速率加快,由此加重了對細胞膜的攻擊,導致硬度下降速度變快,而CK組可能由于前期冷害的影響,使得果實表皮出現受損,造成后期硬度急速下降。實驗組之間可能是由于微孔數的不同造成的差異。其中,無孔組因為與外界氣體交換較慢,不能得到充足的氧氣供給呼吸,造成無氧呼吸的出現,產生乙醇、乙醛,傷害了組織細胞,使硬度下降。16孔組可能是由于孔數較多,與外界氣體交換較快造成后期呼吸強度增大,產生的活性氧較多,攻擊了細胞膜結構,導致硬度下降。相對來說,8孔數微孔膜組形成了較為合適的氣體環境,在抑制呼吸強度的同時避免了無氧呼吸的產生,保護了細胞結構,保持了黃瓜的硬度。

圖4 不同微孔膜包裝處理對黃瓜物流過程中硬度的影響Fig.4 Effect of different microporous film packaging treatments on the hardness of cucumber during logistics

2.5 LOX活性

LOX是一種含非血紅素鐵或錳的加氧酶,植物組織膜脂過氧化的啟動需要LOX,LOX及其過氧化產物直接參與組織的衰老進程[18],MAO等[19]的研究結果也表明LOX可能是黃瓜果實低溫損傷誘導過程中主要的脂質降解酶。如圖5所示,各組LOX活性隨貯藏時間的延長呈先上升后下降的趨勢,其中CK組活性始終高于其他各組。CK組在貯藏第2天至冷藏期結束LOX活性迅速上升,與其他各組產生極顯著差異(P<0.01),可能是由于CK組受到低溫脅迫后細胞膜系統遭到破壞造成的;實驗組在冷藏期間(0～6 d)活性持續下降,且各組間差異不顯著(P>0.05),表明微孔膜處理可以顯著抑制冷藏期間LOX活性的上升;第6天后,實驗組LOX活性開始上升,各組在第8天共同到達最高峰,可能是由于貯藏溫度升高,使得各組代謝水平上升。貯藏后期LOX活性逐漸下降的原因可能是由于脂質過氧化反應的增加提高了脂質的不飽和水平,同時減少了LOX的反應底物造成的[20]。由此可知,各微孔膜處理組均能抑制LOX活性的增大,防止細胞膜透性升高,其中8孔數微孔膜組效果最好。

圖5 不同微孔膜包裝處理對黃瓜物流過程中LOX活性的影響Fig.5 Effects of different microporous film packaging treatments on LOX activity during cucumber logistics

2.6 MDA含量

在果蔬采后衰老過程中,細胞內會積累越來越多的活性氧類物質。活性氧對細胞膜上的脂類物質具有較強的氧化作用,氧化的同時生成MDA等產物,使細胞膜的結構遭到破壞,膜透性增加。因此,MDA含量是判斷果蔬衰老程度的重要指標[21]。如圖6所示,各組MDA含量隨貯藏時間的延長而增大,并且CK組上升最快,在貯藏期間與其他各組差異極顯著(P<0.01)這與相對電導率的變化趨勢一致,原因可能是CK組受到低溫脅迫發生膜質過氧化作用,MDA作為最終產物被分解出來;無孔組MDA含量自貯藏第6天起與其他各組差異極顯著(P<0.01);8孔、16孔2組MDA含量上升速度在前期較慢,但16孔組自第12天起升高較快,與8孔組產生極顯著差異(P<0.01)。這表明各微孔膜處理組均可以顯著抑制MDA含量的上升,可能是因為微孔膜提高了細胞膜的穩定性,使其完整性保持較好,從而提高了其細胞膜的抗逆性,但綜合而言,8孔數微孔膜組對于抑制黃瓜MDA含量上升的效果最佳。

圖6 不同微孔膜包裝處理對黃瓜物流過程中MDA含量的影響Fig.6 Effect of different microporous film packaging treatments on MDA content in cucumber logistics

圖7 不同微孔膜包裝處理對黃瓜物流過程中產生速率的影響Fig.7 Effect of different microporous film packaging treatments on production rate during cucumber logistics

2.8 POD活性

POD在抗氧化系統中具有重要的作用,主要起清除過氧化氫的作用。如圖8所示,各組POD活性隨貯藏時間的延長整體呈現先上升后下降的趨勢。在第2天時除CK外3組的POD活性均上升,而CK組下降至最低值2.11ΔOD470/(min·g),可能是由于CK組POD活性受溫度和呼吸速率影響較大;第2天后各組POD活性持續上升,原因可能是活性氧開始增多,抗氧化清除系統啟動,POD活性增強,清除因低溫脅迫產生的活性氧以保證果實免受傷害。實驗組則在第8天時各自到達高峰,其中8孔組在第10天后與其他組差異顯著(P<0.05)。8 d后各組活性開始下降,這與SOD的變化趨勢一致,原因可能是底物活性氧物質H2O2在8 d出現了高峰之后隨時間延長逐漸下降導致。總體來說,各微孔膜處理組均可以明顯提高貯藏前期POD活性并延緩其在貯藏后期下降,減輕了細胞膜被活性氧物質攻擊的程度,且8 孔數微孔膜組對POD 活性的維持效果最佳。

圖8 不同微孔膜包裝處理對黃瓜物流過程中POD活性的影響Fig.8 Effect of different microporous film packaging treatments on POD activity during cucumber logistics

2.9 SOD活性

如圖9所示,各組SOD活性在第1天均下降,之后隨貯藏時間的延長SOD活性呈先上升后下降的趨勢,研究認為這可能是抗氧化防衛反應的一種機制[22]。CK組在第6天開始SOD活性處于最低水平,并與其他各組差異顯著(P<0.05);實驗組之間在冷藏期間(第0～6天)SOD活性無顯著差異(P>0.05),且基本高于CK組,表明微孔膜處理可以誘導SOD活性的升高。從第8天開始CK、無孔、16孔3組SOD活性逐漸下降,并且自第10天起與8孔組差異顯著(P<0.05),而8孔組自第10天后活性才開始降低。結果說明,各微孔膜處理組均可以顯著抑制SOD活性的降低,增強了黃瓜清除氧自由基的能力,并且由于8孔數微孔膜組形成了適宜的氣體環境,降低了黃瓜的呼吸速率并減緩了活性氧傷害,因而效果最好。

圖9 不同微孔膜包裝處理對黃瓜物流過程中SOD活性的影響Fig.9 Effect of different microporous film packaging treatments on SOD activity during cucumber logistics

2.10 CAT活性

過氧化氫酶CAT作為抗氧化系統的重要酶類之一,是清除過氧化氫主要酶類之一。如圖10所示,各組CAT活性整體呈現先上升后下降的趨勢,在貯藏第4天時,由于CK組出現冷害癥狀導致呼吸強度上升使得CAT活性抵抗性增大而出現降低趨勢;移入室溫后,各組CAT活性由于溫度的上升隨之升高,在第8天時各自到達最高峰,與CK、無孔組差異極顯著(P<0.01);第8天后各組CAT活性開始下降,且8孔組保持在最高水平。這與POD、SOD的變化趨勢一致,可能是因為SOD歧化超氧陰離子酶活達到高峰使得其產生的H2O2達到高峰,隨著底物濃度增大,CAT活性隨即達到高峰。第12天,8孔組與無孔、16孔出現顯著性差異(P<0.05),原因是8孔組維持了適宜的氣體環境,既沒有如無孔組因O2濃度過低造成無氧呼吸現象,也沒有如16孔組因為CO2濃度與大氣持平而增大了呼吸強度,使得后期活性氧物質產生速率降低現象。由此可知,各微孔膜處理組均可以明顯提升黃瓜的CAT活性,保護細胞膜免受活性氧攻擊,且其中8孔數微孔膜組效果最佳,在貯藏后期與其他組差異顯著。

圖10 不同微孔膜包裝處理對黃瓜物流過程中CAT活性的影響Fig.10 Effect of different microporous film packaging treatments on CAT activity during cucumber logistics

2.11 葉綠素含量

圖11 不同微孔膜包裝處理對黃瓜物流過程中葉綠素含量的影響Fig.11 Effect of different microporous film packaging treatments on chlorophyll content during cucumber logistics

2.12 PCA

利用PCA對貯藏期間不同微孔膜包裝黃瓜指標進行全面分析。由圖12可知,PC1和PC2的累計貢獻率為80%,說明可以代表原數據的變化趨勢[24]。從載荷圖中可以發現,整體感官評分、硬度的相關系數最高,是黃瓜果實在貯藏過程中品質下降最直觀的表現,其次為相對電導率、MDA含量。相對電導率高,說明貯藏期間細胞膜受損之后膜透性增大,細胞內容物外滲,而MDA含量正是膜質過氧化程度的直接反映,所以MDA含量也就升高。結合圖13能看出在8 d時,8孔組和16孔組的POD和CAT的活性達到了最高,說明2組的活性氧清除速率正值高峰,極大程度地保護了細胞膜免受攻擊。

從得分圖(圖13)中發現,不同天數的不同各組被主要被分割成了2個區域,并且以6 d為分割點,圖中0點為初始黃瓜樣品,越接近0點說明各指標與初始樣品越接近,6 d前的各處理組在圖中相鄰較近,說明各個指標以及果實品質差距不大,各處理組在第6天之后都出現了較大的變化,但是8孔組各天數的變化幅度最小,在圖中與0 d的位置相對更接近,表明在保持黃瓜的品質方面,8孔組要明顯優于CK組及其他處理組。

圖12 主成分載荷圖Fig.12 Principal component loading diagram

A-無孔組;B-8孔組;C-16孔組圖13 PCA得分圖Fig.13 Principal component analysis score chart

3 結論

微孔膜包裝作為氣調包裝的一種,具有比其他包裝更經濟,操作性更好的特點,對于產品的生理控制可以通過孔徑大小及孔數調節。微孔膜包裝的打孔數差異會造成其冷害抑制效果的不同,低打孔數可能會造成包裝內的氣體交換率低,導致無氧呼吸的發生,加速果蔬腐爛,高打孔數可能會造成氣體交換率過高,導致包裝內外氣體成分相似,保鮮效果不佳,因此,只要調整好適量的孔數,微孔膜包裝可以通過調節包裝內的氣體成分很好地抑制黃瓜膜質過氧化,降低品質劣變的發生。而且微孔膜成本低,操作簡單,是一種非常適合在實際貯運過程中推廣使用的技術。后續研究中,由于黃瓜在不同貯藏溫濕度條件、不同貯藏時長、冷藏轉物流的溫差不同變化等情況下的膜脂氧化程度也不同,應注意研究微孔膜技術,以及微孔膜與其他控制膜脂氧化與品質的技術的協同使用,對這些情況下黃瓜的膜脂氧化及品質的控制作用。