生物3D打印在大面積骨骼肌損傷中應用研究進展

潘昕瑤 李婷 吳耀彬 李嚴兵 黃文華，2

1南方醫科大學基礎醫學院醫學生物力學廣東省重點驗室，人體解剖學國家重點學科廣東省醫學3D打印應用轉化工程研究中心（廣州 510515）；2南方醫科大學第三附屬醫院3D打印應用翻譯廣東醫療創新平臺（廣州 515510）

骨骼肌（skeletal muscle）約占人體質量的45%[1]，通過對骨骼收縮牽拉參與骨骼的運動與支持。骨骼肌有著豐富的血管與神經網絡，調節肌肉的物質交換營養代謝活動，常因疾病或創傷等受損導致部分功能障礙，較小損傷骨骼肌組織可自行修復再生，但大面積損傷超過肌組織再生能力需手術介入治療[2]。大面積骨骼肌損傷（volumetric muscle loss，VML）是一種由于創傷、骨折固定或退行性疾病等病因[3]，導致其損傷超出組織自身修復再生能力的慢性功能損害[4]，嚴重可導致終生的功能缺陷。目前臨床促進骨骼肌再生的治療主要有手術介入、納米技術等[5]，然而上述方法無法產生完整的血管及神經連接使組織完全再生及功能恢復[6]。

骨骼肌組織工程（skeleton muscle tissue engineering，SMTE）旨在修復缺損重建骨骼肌結構與功能[7]，為目前的臨床治療提供一種組織修復再生的新方案。3D生物打印技術作為一種增材制造技術，基于三維數字模型設計，采用活性生物材料可以在特定的條件下以微米級的精確度對細胞或生物材料進行有序排列。生物3D打印可模擬組織復雜的微觀結構并精確控制細胞材料沉積及細胞的排列分布[8]，在骨骼肌組織工程應用中有得天獨厚的優勢，已廣泛應用于SMTE骨骼肌構建[9-10]。此外，3D打印技術分辨率在10～10 000 μm，能夠構建更精細的仿生結構[11]。體內外骨骼肌構建工程方法已被應用于骨骼肌再生策略，體外通常包括肌原細胞分化成肌管并在植入體內前通過生物反應器進行預處理，生成分化成熟的功能性收縮骨骼肌[12]。此外，通常使用細胞或多能誘導干細胞分化后共培養來促進血管網絡和神經肌肉接頭的形成。體內多移植黏附在支架上的細胞，并在移植部位刺激體內肌組織和血管神經的再生及與宿主的整合。此外，骨骼肌組織功能恢復需要血管及神經網絡進行物質交換，在體內骨骼肌血管化可通過刺激現有血管向內生長形成新的毛細血管，目前常用血管生長因子（VEGF）[10]釋放支架或具有特定結構及化學成分的支架來構建血管網絡。

本文首先介紹主要的生物3D打印技術，并回顧了近年來生物3D打印技術和組織工程在VML中的研究進展，其中重點探討了3D打印骨骼肌組織在臨床中的應用進展，最后進行了生物3D打印骨骼肌組織工程修復VML的未來展望，以期為骨骼肌再生修復提供具有臨床潛力的創新成果。

1 生物3D打印技術

目前常用于骨骼肌組織工程的生物3D打印工藝主要為擠出成型打印（extrusion-based bioprinting）、立體噴墨打印（stereoscopic inkjet printing）及激光輔助打印（laser-based bioprinting）[11]（圖1）。表1總結了三種主要技術，并對比了三種技術的生物性能、打印性等各種優缺點。

表1 常用的3D生物打印技術比較[16]Tab.1 Common 3D Bioprinting techniques[16]

1.1 擠出成型打印（extrusion-based bioprinting）擠出成型打印技術廣泛應用于骨骼肌組織工程，采用氣動或機械動力擠壓生物材料或生物墨水，并逐層沉積打印[13]，可兼容多種材料多梯度打印以及粘性范圍廣泛的生物材料（＜ 6 × 107mPas）[7]，然而較強壓力會影響細胞活性且低粘度的生物墨水打印的其結構仿真度有限。FAN等[14]采用氣動擠壓打印技術，構建不同直徑骨骼肌肌束，采用MHC抗體染色、低溫電子顯微鏡和phalloidin染色等方式直觀地顯示了纖維蛋白水凝膠系統中的骨骼肌組織三維構建的動態變化過程，并進行了小鼠成肌細胞（C2C12）的空間排列及分化的力學測試與數據分析。結果顯示高壓作用下，肌束較厚的細胞成熟度小于薄束的細胞成熟度，每單位面積較細的骨骼肌肌束纖維可承受更大的力，這種3D打印策略為體外3D骨骼肌組織的構建提供了理論參照。KIM等[15]開發神經-骨骼肌整合結構，旨在治療大面積骨骼肌損傷及功能恢復，他們利用氣動擠壓打印含人類肌肉祖細胞（human muscle progenitor cells，hMPCs）和人類神經干細胞（human neural stem cells，hNSCs）骨骼肌結構并分析了神經細胞對肌肉細胞的活性、增殖及分化的影響，評估肌源性及神經元的分化和體外結構中神經骨骼肌肌肉接頭（neuromuscular junctions，NMJs）的形成。結果表明，神經營養因子和神經遞質在預形成的NMJs中釋放，增加了細胞肌源性分化并誘導NMJ的形成，促進TA缺陷小鼠模型骨骼肌功能快速恢復，從而印證了hMPCs和hNSCs細胞間相互作用可促進肌肉的成熟和發育以及體內與宿主神經的快速整合以增加骨骼肌細胞的增殖和分化。

1.2 立體噴墨打印（stereoscopic inkjet printing）立體噴墨打印也可兼容多材料梯度打印，與擠出成型打印不同的是，立體噴墨打印設備簡單、成本低廉，可采用噴墨噴射打印流體材料（通常使用低粘度＜15 mPas生物墨水）進行打印，獲得較高（＞85%）的細胞活力，且在打印速度上更勝一籌（1～10 000滴/s）[16]。然而，打印結構分辨率和精確度受到不同噴嘴噴射形態及生物材料特性[17]的限制，在打印過程中生物墨水需作為具有適當的粘度的液體狀態。此外，這種打印技術還存在生物墨水噴濺現象。

1.3 激光輔助打印（laser-assisted bioprinting）激光輔助打印是利用激光脈沖誘導金屬薄膜（如金、鈦）汽化，形成高壓氣泡，將生物墨水推向基地，需要粘度（＜300 mPas）的生物墨水，成本高、速度快（＜ 1 600 mm/s），打印細胞活性高（95%）[18]。

2 3D生物材料/生物墨水在骨骼肌組織工程中的應用

在3D生物打印過程中，用于封裝細胞的一種或幾種生物材料的混合物稱為生物墨水，可進行交聯生成仿生組織結構[16]。GROLL等[19]提出生物墨水的新定義：“一種具有生物活性成分的、能夠使用于生物制造技術的細胞墨水”，即適用于所有生物制造技術，如細胞打印、組織或器官構建、體外模型構建等。生物墨水主要根據細胞類型和生物打印技術等決定，理想的生物墨水應與組織結構、機械等特性相似或相同[7]。細胞是生物墨水中必不可少的組成部分，基于細胞的生物墨水的研究與開發是目前研究的重要領域[20]。

2.1 海藻酸鹽（Alginate）海藻酸鹽得益于良好的親水性和生物相容性，可與大多天然和人工合成的聚合物及生物活性物質混合，創造出細胞生長的適宜環境，也可快速離子凝膠化并根據需要調節流變性及力學性能，較適用于擠壓生物打印。目前，海藻酸鹽已被用作肌細胞載體生物打印的主要生物墨水材料[21-23]，常與明膠、纖維蛋白等結合，將其應用于3D生物打印[24]。DISTLER等[22]使用氧化藻酸明膠（oxidized alginate-gelatin，ADAGEL）水凝膠包裹C2C12細胞并調節噴嘴尺寸和擠壓力，擠壓C2C12細胞所產生剪切力可促進細胞定向排列并在細胞密度高的區域分化為有序的肌管段，研究表明ADA-GEL生物墨水成本低、可降解。此外，海藻酸鹽常作為溶液增稠劑或結構穩定劑來調節生物墨水流變性，構建復雜結構，但配置過程中常因濃度過高而對細胞活性產生負面影響[7]。BOLíVAR-MONSALVE 等[25]提出一種連續混合打印概念的擠壓打印技術，結合明膠-甲基丙烯酰-海藻酸鹽與成肌細胞，打印出仿生肌肉模型并展示出整齊排列的分層肌管結構，打印后顯示高細胞活性（＞85%）且打印后28 d仍保持高細胞活性。

2.2 甲基丙烯酰化明膠（gelatin methacrylate，GelMA）GelMA含固有RGD和MMP序列并提供細胞結合位點，與骨骼肌生物相容，有巨大研發潛力，具有可生物降解及可調節機械特性等優點，可設計用于控制各種細胞行為，如黏附、增殖和分化。相較高濃度GelMA，低濃度的GelMA水凝膠（≤5%W/V）更適合用作促進細胞高存活率、增殖及分化的生物墨水。然而，由于低濃度的GelMA打印性差且堆積能力有限因而限制了應用[26]。RONZONI等[27]等選用了三種不同的水凝膠生物墨水：（1）明膠甲基丙烯酸酯和海藻酸鹽加紫外光交聯；（2）甲基丙烯酸明膠、黃原膠與海藻酸纖維蛋白原；（3）氯化鈣和凝血酶交聯的納米纖維化纖維素（nanofibrillated cellulose，NFC）/藻酸鹽纖維蛋白原，對比了各自對C2C12細胞產生的影響。研究顯示使用NFC/海藻酸纖維蛋白原為基礎的水凝膠在培養7～14 d后成肌細胞開始融合，第21天和第28天在3D生物打印結構內形成廣泛排列的多核肌管，研究表明細胞生長并成熟。此外，GelMA已作為負載細胞的水凝膠打印材料，廣泛應用于體外血管形成及組織再生，然而GelMA預聚體原位紫外線交聯可能會引起體內免疫抑制并加速組織老化或癌變[28]。NOSHADI等[29]設計了一款可注射、光交聯的GelMA水凝膠：以伊紅Y為光引發劑，三乙醇胺（TEA）為共引發劑，n-乙烯基己內酰胺（VC）為共單體并光交聯，用于心肌組織修復。進一步評估力學性能、孔隙度及生物相容性的研究顯示，可見光交聯的GelMA水凝膠可促進細胞生長和功能恢復，在心臟、血管等多種軟組織的修復與臨床轉化應用有巨大潛力。LEE等[30]使用含有hMPCs肌細胞外基質的生物墨水結合聚乙烯醇開發了一種可自我校對肌纖維排列的骨骼肌模型，混合生物墨水共同促進了hMPCs增殖與肌源性分化，且這種自我校對的結構整合了血管與神經網絡，加速骨骼肌功能恢復，有效修復并重建大面積骨骼肌損傷。LUO等[31]提出利用低溫保護生物墨水的技術：通過冷凍板精確控溫在垂直方向上直接進行擠壓生物打印，3D低溫打印水凝膠結構中的成肌細胞具有更強的活性、增殖及分化，以期應用于組織工程及再生醫學方面。

3 生物3D打印技術制備骨骼肌組織工程支架

三維生物材料支架可為細胞提供人造ECM并模擬組織特性來誘導組織再生，摻入生長因子和蛋白質等生物活性劑可促進細胞粘附分子和生長因子的釋放來引導細胞黏附、生長、增殖及分化。目前常用的支架主要有脫細胞支架、水凝膠、納米/導電支架等[32-33]，國外已有研究證實支架在體外和體內均支持成肌細胞生長成熟[34-35]并促進血管生成[36]。QIU等[37]利用脫細胞神經基質水凝膠（decellularized nerve matrix hydrogel，DNMG）和神經膠質源性神經營養因子（glial-derived neurotrophic factor，GDNF）修飾脫細胞神經基質支架促進神經的修復。實驗橋接50 mm坐骨神經損傷并對修復結果進行電生理評估和再生骨骼肌組織檢查等實驗，結果證實DNMG和GDNF修飾的DNM-S支架增強了神經再生和功能恢復，在移植后的6個約肢體功能、電生理反應及組織學形態均有所改善，為治療長神經缺損提供了有效的參考。

QUINT等[10]采用體內交聯GelMA水凝膠制作支持黏附支架，在體內利用Laponite納米黏土控制血管內皮生長因子（VEGF）的釋放，用以打印骨骼肌結構。實驗結果對比未經治療的VML小鼠，打印支架可促進肌細胞生長及骨骼肌功能恢復，并增加代謝、減少纖維化的發生，該支架的外科植入為各種情況下的軟組織損傷提供了快速有效的臨床療法。DU等[38]在支架中加入還原氧化石墨烯RGO以改善其力學性能及導電性，并借此開發了一種新型高彈性、可拉伸可降解、具有導電性的聚（檸檬酸-辛二醇-聚乙二醇）-石墨烯（graphene，PCEG）納米復合材料，用于肌源性分化和骨骼肌再生。研究顯示，不影響親水性的前提下加入RGO石墨烯可顯著提高抗降解及抗腫脹能力，增加了支架的肌纖維和體內的毛細血管密度，PCEG納米復合材料的拉伸強度和模量均顯著提高，材料保持了良好的彈性和拉伸性能。與PCE聚合物和PLGA相比，PCEG納米復合材料顯著增強了成肌細胞的附著、增殖及分化和體內骨骼肌組織修復。該研究為骨骼肌組織工程提供了一種具有良好電活性和生物相容性的高彈性、可吸收的納米復合材料用以制備支架。

4 生物3D打印骨骼肌組織工程的組織修復及臨床應用

4.1 組織修復在KIM等[11]的工作中進行了打印骨骼肌結構的體內研究，結果顯示在植入后8周大鼠脛骨前（TA）肌肉缺損模型的3D仿生骨骼肌完成了82%的功能恢復，并且與宿主的血管和神經網絡相互整合。其團隊后續的研究中，更是將神經細胞整合到生物打印的骨骼肌結構中促進其與宿主神經快速整合，以及體內肌纖維的神經肌肉接頭NMJ的形成[15]。盡管選用的大鼠TA模型免疫功能低下，仍需進一步研究炎癥和免疫反應等相關宿主反應，但上述研究為功能性仿生骨骼肌植入治療VML提供了成功的參考。骨骼肌功能恢復需要脈管系統來供應營養物質，運輸代謝廢物，因此在沒有血管神經支持環境下，難以修復受損的骨骼肌組織結構，促進功能恢復，因此構建骨骼肌血管化和神經支配對SMTE骨骼肌再生及體外肌肉建模至關重要[6]。目前主要有兩種方式誘導產生血管化及神經支配：一是體內進行血管化/神經連接；二是預血管化/神經連接[6，39]（圖2）。基于前期實驗研究[15]，KIM等[40]開發了一種由多層肌束和AChR簇組成的3D生物打印骨骼肌結構并對預形成的功能性AChR簇的作用、體內結構及神經支配情況進行評估。在大鼠盆底肌損傷模型中，植入預先制成的AChR簇可促進打印結構中功能性骨骼肌重建，并增加體內NMJ形成，為肌間神經網絡連接以及盆底骨骼肌功能恢復重建提供了創新療法。近年，脫細胞細胞外基質（decellularized extracellular matrix，dECM）支架及脫細胞生物支架已被廣泛應用于VML及骨骼肌功能恢復等相關研究。組織特異性dECM生物墨水可提供復雜的相關微環境，模擬組織環境中的特定條件，然而在大型組織結構制作應用方面，dECM的機械性能和分辨率受限。LEE等[30]報道3D生物打印采用含有hMPCs的生物墨水仿制了可自動對齊的骨骼肌dECM結構，用于促進骨骼肌缺損的功能恢復，將hMPCs和聚乙烯醇混合出可光交聯的骨骼肌細胞外基質dECM-MA生物墨水。體外研究表明，聚乙烯醇（PVA）纖維化或浸出后產生的微拓撲結構可誘導hMPCs進行自排列，生物墨水中的組織特異性生化信號以及聚乙烯醇纖維中獲得排列引導的協同作用可改善hMPCs的分化，打印結構中顯示宿主神經網絡加速整合、體內血管內向生長，促進了骨骼肌功能快速恢復。dECM-MA結構中自對齊肌纖維顯示出大鼠TA肌肉缺損模型的骨骼肌功能快速恢復，可促進宿主的血管化及神經整合，用以治療VML、加速骨骼肌功能恢復。國外報道了開發了一種基于顆粒的打印容器，利用dECM生物墨水制作大體積骨骼肌結構治療VML的新策略[39]。研究顯示，相較于dECM海綿和dECM水凝膠結構，3D打印的骨骼肌結構在細胞活性、肌管形成及肌纖維重建等方便表現更為突出。此外在探究預血管化肌肉結構促進功能恢復方面，他們發現使用同軸噴墨打印將mdECM、vdECM和人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）摻入不同的生物墨水打印制造預血管化的骨骼肌結構可防止缺氧并促進VML大鼠模型功能恢復。實驗顯示，vdECM生物墨水在培養14 d時表現出最好的細胞增殖及血管生成相關的基因表達，植入的預血管化肌肉組織在VML大鼠模型中促進了骨骼肌新生以及85%的VML損傷的骨骼肌功能恢復。綜上，骨骼肌結構的血管化和神經連接對肌肉打印結構的細胞活性、肌細胞成熟以及損傷后骨骼肌的功能恢復都是必要的。

4.2 臨床應用生物工程所構建的3D骨骼肌模型已應用于藥物篩選和疾病模型構建[41-42]，并模擬組織或器官的正常生理機能在特定的環境中評估健康和患病狀態[43]以改善患者的長期預后。此外還用于評估新研發的化妝品成分擴增肽的功效以驗證打印測試平臺，三維仿生骨骼肌的構建為肌肉疾病治療[44]、藥品研發和化妝品成分檢測等領域提供了創新策略。在長期給藥過程中，藥物注射進肌肉組織并在一定時間內緩慢釋放作用于靶組織，而現有的為口服用藥研發的系統由于缺少復雜的肌肉組織生理環境，其結果往往不能充分反應肌肉注射（IM）給藥在體內的緩釋及代謝過程。GHOLOBOVA等[45]研發可預測肌內注射（IM）藥代動力學及毒性的體外三維骨骼肌模型，人類生物人工肌肉（the human bio-artificial muscle，BAM）是由排列的肌纖維組成的肌肉束，可在電刺激或機械刺激下收縮活動，BAM測試并顯示了熒光化合物5（6）-羧基-2'，7'-二氯熒光素二乙酸酯（CDFDA）和pro-NanoLuc底物在體內的水解和還原反應，提高了對IM用藥體內代謝的可預測性，降低了藥物研發成本。然而BAM器官模型僅限于肌肉組織，并無其他器官如肝臟或免疫系統的參與以及血管神經網絡系統，仍具有一定局限性。對于血管及神經網絡系統的缺失，可以利用人源誘導多能干細胞（ihPSCs）衍生的ECs，PC和肌原細胞共培養，構建含有等基因hiPSC衍生的血管內皮細胞和運動神經元的多向人工肌肉[46]。

杜氏肌營養不良癥（duchenne muscular dystrophy，DMD）是一種遺傳性肌肉疾病，目前對此疾病研究常用的動物模型是擁有與DMD相同遺傳模型的23號外顯子的無效突變導致肌營養蛋白完全缺失的mdx小鼠系，但仍存在表型差異性且研究成本昂貴等缺點。EBRAHIMI等[47]使用健康來源及DMD患者來源肌細胞構建人類骨骼肌微組織（human skeletal muscle microtissues，hMMTs）可用于研究外顯子跳躍及肌細胞保護收縮損傷機制等，首次在體外環境中從頭形成了抗肌萎縮蛋白陽性肌管并概括了DMD部分的病理生理學特征和功能表型，但可能由于肌管成熟度不足或實驗方法的局限性等原因沒有再現DMD的肌膜缺損。動物模型的“B計劃”研究導致器官芯片系統（organ-on-a-chip systems，OoC）應運而生，得益于其動態灌注，體積微小，高精度高通量等特性，多已應用于構建體內多器官微生理系統及藥物篩選。AGRAWAL等[41]通過微流體裝置創建了一個可灌注的3D骨骼肌OoC用以評估組織形成和損傷變化，不僅可構建健康人源細胞的仿生生理環境，更可以通過特定患者的病源細胞，如DMD干細胞，來開展個性化藥物研發及療效評估。

5 前景與展望

VML產生的負性微環境可抑制成纖維細胞的正常凋亡，并伴有慢性炎癥及產生顯著瘢痕組織，嚴重可導致終生的功能缺陷。目前臨床治療手術干預包括瘢痕清創、肌肉移植及假體植入等，盡管自體肌瓣移植可恢復部分肌肉功能，但常導致供區病變等因而無法產生完整的血管及神經連接使組織完全再生及功能恢復[7]。當前構建功能性仿生骨骼肌組織的一個重要的挑戰是血管化和神經支配的形成，肌組織需要血管網絡進行營養物質交換，而神經元-骨骼肌相互作用的關鍵是NMJ的形成。對于骨骼肌血管與神經的整合，目前研究分別報道了利用神經細胞（PC）和內皮細胞（EC）誘導血管網絡[48]及神經連接[15]的形成，目前鮮有文獻報道生物打印技術用于血管化或神經化骨骼肌構建，二者與宿主的整合仍需進行大量的體內研究與評估；此外，大量研究顯示導電生物材料可促進電刺激誘導細胞的增殖與分化[33，49]，對血管形成也有積極影響，然而電刺激尚未應用在體外改善肌體的血管化。宿主的免疫反應是仿生骨骼肌組織應用于臨床的主要挑戰之一，使用免疫原性低的材料，如纖維蛋白、特異性來源的生長因子等[50]，可減少仿生組織植入后產生的不良反應。此外，開發高免疫相容性生物材料并在免疫相容模型中報道應用數據也將是未來主要研究熱點之一。對于未來研究還應研究組織再生狀態與功能改善之間的相關性，研究肌管發育的相關物理和生化機制。在臨床應用方面，VML治療后血管和神經再生的潛在協同效應進一步研究以改善臨床治療，最終實現骨骼肌組織的完全修復再生及功能恢復。