特異性敲除心肌白細胞介素-8抑制信號轉(zhuǎn)導及轉(zhuǎn)錄激活蛋白3活化改善慢性心力衰竭小鼠心功能及炎癥反應

恩歌 陳少杰 劉陽 林祥燦

1天津北大醫(yī)療海洋石油醫(yī)院心內(nèi)科（天津 300452）；2中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院消化內(nèi)科（廣州 510120）；3南華大學附屬第二醫(yī)院心血管內(nèi)科（湖南 衡陽 421000）

慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）是臨床上多種心血管疾病終末階段的共同表現(xiàn)[1-2]，目前發(fā)病的分子機制尚未明確，相關的分子生物學研究認為炎癥反應、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（RAAS）系統(tǒng)、交感系統(tǒng)的激活與CHF的發(fā)生發(fā)展密切相關，其中炎癥反應激活所致多種炎癥因子的異常釋放會造成心肌細胞損害、心肌間質(zhì)重構。白細胞介素-8（interleukin-8，IL-8）是參與炎癥反應激活的重要細胞因子，CHF患者血清中IL-8的水平明顯升高且與心功能減退、預后不良有關[3-4]，深入認識IL-8在CHF發(fā)病中的作用及機制有助于進一步闡明CHF的發(fā)病機制。

IL-8的生物學作用與下游信號轉(zhuǎn)導及轉(zhuǎn)錄激活蛋白3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）的活化有關[5-6]。STAT3是在心血管系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，在壓力負荷、缺血再灌注等病理因素誘導的CHF中均發(fā)生過度活化且參與心肌重構、炎癥反應的調(diào)控[7-8]。為了深入認識IL-8在CHF發(fā)病中的作用及機制，本研究在野生型小鼠和特異性敲除心肌IL-8的模型小鼠中進行了實驗，具體觀察IL-8通過STAT3對CHF小鼠心功能及炎癥反應的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物野生型（wild type，WT）C57BL/6J雄性小鼠購自上海南方模式生物科技公司，特異性敲除（knockout，KO）心肌IL-8的雄性模式小鼠（遺傳背景C57BL/6J）由上海南方模式生物科技公司采用LoxP-Cre系統(tǒng)構建并鑒定。

1.2 試劑與儀器蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色試劑盒購自武漢博士德公司，二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量試劑盒購自上海碧云天公司，氨基末端腦鈉肽前體（N-terminal pro-B type natriuretic peptide，NT-proBNP）、白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的酶聯(lián)免疫吸附法測定（ELISA）試劑盒上海原鑫生物科技公司，總RNA提取試劑盒、cDNA第一鏈合成試劑盒、熒光定量檢測試劑盒購自北京天根生化公司，IL-8、STAT3、p-STAT3、β-actin特異性一抗購自美國Abcam公司。

6LAB便攜式小動物超聲儀購自北京益仁恒業(yè)科技有限公司，XD30M型光學顯微鏡購自浙江舜宇光學生物儀器公司，LineGene Mini型熒光定量PCR儀購自杭州博日科技股份有限公司。

1.3 動物分組及造模WT C57BL/6J雄性小鼠分為WT對照組、WT模型組，特異性心肌IL-8 KO的雄性模式小鼠分為KO對照組、KO模型組，每組各8只。WT模型組和KO模型組采用腹主動脈縮窄術建立CHF模型，方法如下：腹腔注射0.4%戊巴比妥鈉40 mg/kg，麻醉后打開腹腔、暴露腹主動脈，在主動脈根部上方用3.0絲線穿無菌聚乙烯塑料管結(jié)扎；WT對照組和KO對照組進行假手術操作，按照造模相同的方法麻醉、打開腹腔、暴露腹主動脈、穿線但不結(jié)扎。完成手術后關閉切口，4周后進行檢測和取材。

1.4 超聲心動圖檢測心功能造模4周后進行超聲心動圖檢查，腹腔注射0.4%戊巴比妥鈉40 mg/kg麻醉，而后擺放仰臥位，用多普勒探頭在胸骨旁的左室長軸進行掃描，獲得理想圖像后檢測左心室舒張末期內(nèi)徑（left ventricular end diastolic diameter，LVEDD）、左心室收縮末期內(nèi)徑（left ventricular end-systolic diameter，LVESD）、左室射血分數(shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）。

1.5 血清的取材及檢測完成超聲心動圖檢測后，經(jīng)心尖取血約2～3 mL，靜置30 min后凝血，3 000 r/min離心10 min，分離血清并采用ELISA試劑盒檢測NT-proBNP、IL-1β、IFN-γ、TNF-α的水平。

1.6 心肌的取材及稱重完成經(jīng)心尖取血后解剖心臟、稱量心臟質(zhì)量（heart weight，HW），解剖左心室、稱量左心室質(zhì)量（left ventricle weight，LVW），同時在超聲心動圖檢查檢測稱量體質(zhì)量（body weight，BW），計算HW/BW、LVW/HW。

1.7 心肌病理改變的HE染色檢測剪取適量左心室的心肌組織，在4%多聚甲醛溶液中固定24 h，而后進行石蠟包埋、制作厚度4 μm的切片，進行HE染色后在光學顯微鏡下觀察心肌組織的病理改變。

1.8 心肌中蛋白表達水平的免疫印跡檢測剪取左心室的心肌組織約5～8 mg，加入預冷的裂解液并在冰上研磨組織，研磨后進行4℃、12 000 r/min 10 min，吸取離心后的上清、BCA法檢測蛋白濃度。在免疫印跡檢測時，每份樣本取30 μg蛋白，在聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳，分離不同分子量的蛋白后電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜；而后分別進行5%脫脂牛奶孵育，IL-8一抗、p-STAT3一抗、STAT3一抗、β-actin一抗孵育，辣根過氧化物酶二抗孵育，最后采用電化學發(fā)光法顯影得到蛋白條帶，用軟件分析條帶的灰度值，用目的蛋白與內(nèi)參蛋白β-actin灰度值的比值來分析蛋白表達水平。

1.9 心肌中mRNA表達水平的PCR檢測剪取左心室的心肌組織約5～8 mg，采用總RNA提取試劑盒提取組織中的總RNA，采用cDNA第一鏈合成試劑盒對組織中的總RNA進行反轉(zhuǎn)錄、合成cDNA，最后采用熒光定量檢測試劑盒對IL-1β、IFN-γ、TNF-α的mRNA表達水平進行熒光定量PCR檢測，PCR反應體系如下：cDNA 1 μL、熒光定量檢測反應混合液10 μL、上下游引物各0.6 μL、去離子水補足至20.0 μL。在熒光定量PCR以上進行PCR反應，反應程序如下：95℃預變性3 min后95℃ 15 s、特異性退火溫度（IL-1β 60.0℃、IFN-γ 62℃、TNF-α 60.0℃、β-actin 62.0℃）25 s、72℃ 30 s重復40個循環(huán)，反應結(jié)束后得到循環(huán)曲線及循環(huán)閾值（cycle threshold，Ct），以β-actin為內(nèi)參、按照公式2-△△Ct計算IL-1β、IFN-γ、TNF-α的mRNA表達水平。

1.10 統(tǒng)計學方法采用SPSS 23.0版本軟件進行統(tǒng)計學處理，實驗數(shù)據(jù)均為計量資料且符合正態(tài)分布，用均數(shù)±標準差表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，4組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 四組小鼠心肌中IL-8表達水平的免疫印跡檢測WT模型組小鼠心肌中IL-8的表達水平高于WT對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；KO對照組、KO模型組小鼠心肌中不表達IL-8。見圖1。

2.2 四組小鼠心功能的超聲心動圖檢測四組小鼠LVEF、LVESD、LVEDD的比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。兩兩比較如下：WT模型組小鼠的LVEF水平低于WT對照組，LVESD、LVEDD水平均高于WT對照組（P＜0.05）；KO對照組小鼠的LVEF、LVESD、LVEDD水平與WT對照組比較無差異（P＞0.05）；KO模型組小鼠的LVEF水平高于WT模型組，LVESD、LVEDD水平均低于WT模型組（P＜0.05）。見表1。

表1 四組小鼠超聲心動圖參數(shù)LVEF、LVESD、LVEDD的比較Tab.1 Comparison of echocardiographic parameters LVEF，LVESD and LVEDD among four groups of mice ±s

表1 四組小鼠超聲心動圖參數(shù)LVEF、LVESD、LVEDD的比較Tab.1 Comparison of echocardiographic parameters LVEF，LVESD and LVEDD among four groups of mice ±s

注：與WT對照組比較，*P＜0.05；與WT模型組比較，#P＜0.05

例數(shù)8 8 8 8組別WT對照組WT模型組KO對照組KO模型組F值P值LVEF（%）66.92±5.41 45.41±4.52*66.29±4.95 56.71±5.09#13.282＜0.001 LVESD（mm）0.298±0.042 0.477±0.061*0.301±0.046 0.389±0.038#11.922＜0.001 LVEDD（mm）0.471±0.051 0.672±0.084*0.480±0.048 0.545±0.060#9.484＜0.001

2.3 四組小鼠血清中心衰標志物NT-proBNP的Elisa檢測四組小鼠血清NT-proBNP水平的比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。兩兩比較如下：WT模型組小鼠的血清NT-proBNP水平高于WT對照組（P＜0.05）；KO對照組小鼠的血清NT-proBNP水平與WT對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；KO模型組小鼠的血清NT-proBNP水平低于WT模型組（P＜0.05）。見圖2。

2.4 四組小鼠HW/BW、LVW/HW的比較四組小鼠HW/BW、LVW/HW的比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。兩兩比較如下：WT模型組小鼠的HW/BW、LVW/HW高于WT對照組（P＜0.05）；KO對照組小鼠的HW/BW、LVW/HW與WT對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；KO模型組小鼠的HW/BW、LVW/HW低于WT模型組（P＜0.05）。見表2。

表2 四組小鼠HW/BW、LVW/HW的比較Tab.2 Comparison of HW/BW and LVW/HW among four groups of mice ±s

表2 四組小鼠HW/BW、LVW/HW的比較Tab.2 Comparison of HW/BW and LVW/HW among four groups of mice ±s

注：與WT對照組比較，*P＜0.05；與WT模型組比較，#P＜0.05

例數(shù)8 8 8 8組別WT對照組WT模型組KO對照組KO模型組F值P值HW/BW 0.231±0.031 0.377±0.042*0.228±0.034 0.293±0.031#9.392＜0.001 LVW/HW 0.193±0.022 0.284±0.032*0.201±0.025 0.237±0.029#15.283＜0.001

2.5 四組小鼠心肌病理改變的HE染色檢測WT模型組與KO模型組小鼠心肌組織中細胞排列規(guī)則、間質(zhì)未見明顯炎癥細胞浸潤；WT模型組小鼠心肌組織中細胞排列混亂，有水腫現(xiàn)象，肌纖維明顯增粗；KO模型組小鼠心肌的病理改變較WT模型組小鼠明顯改善。見圖4。

2.6 四組小鼠血清中炎癥因子含量的Elisa檢測及心肌中炎癥因子表達水平的PCR檢測四組小鼠血清中IL-1β、IFN-γ、TNF-α的水平及心肌中IL-1β、IFN-γ、TNF-α的mRNA表達水平比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。兩兩比較如下：WT模型組小鼠血清中IL-1β、IFN-γ、TNF-α的水平及心肌中IL-1β、IFN-γ、TNF-α的mRNA表達水平均高于WT對照組（P＜0.05）；KO對照組小鼠血清中IL-1β、IFN-γ、TNF-α的水平及心肌中IL-1β、IFN-γ、TNF-α的mRNA表達水平與WT對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；KO模型組小鼠血清中IL-1β、IFN-γ、TNF-α的水平及心肌中IL-1β、IFN-γ、TNF-α的mRNA表達水平均低于WT模型組（P＜0.05）。見表3。

表3 四組小鼠血清中炎癥因子含量及心肌中炎癥因子表達水平的比較Tab.3 Comparison of the content of inflammatory factors in serum and the expression level of inflammatory factors in myocardium among four groups of mice ±s

表3 四組小鼠血清中炎癥因子含量及心肌中炎癥因子表達水平的比較Tab.3 Comparison of the content of inflammatory factors in serum and the expression level of inflammatory factors in myocardium among four groups of mice ±s

注：與WT對照組比較，*P＜0.05；與WT模型組比較，#P＜0.05

組別WT對照組WT模型組KO對照組KO模型組F值P值例數(shù)8 8 8 8血清炎癥因子水平（ng/mL）IL-1β 3.12±0.66 7.58±0.94*3.04±0.57 4.74±0.61#15.832＜0.001 IFN-γ 1.84±0.32 3.94±0.52*1.77±0.26 2.44±0.29#12.774＜0.001 TNF-α 5.41±0.84 9.19±1.21*5.72±0.94 7.74±1.09#11.928＜0.001心肌炎癥因子mRNA表達IL-1β 1.00±0.12 1.88±0.25*1.09±0.14 1.40±0.20#10.284＜0.001 IFN-γ 1.00±0.15 2.31±0.32*0.96±0.15 1.62±0.22#18.832＜0.001 TNF-α 1.00±0.19 2.03±0.26*1.04±0.17 1.49±0.19#12.382＜0.001

2.7 四組小鼠心肌中STAT3活化的免疫印跡檢測四組小鼠心肌中p-STAT3表達水平比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。兩兩比較如下：WT模型組小鼠心肌中p-STAT3的表達水平高于WT對照組（P＜0.05）；KO對照組小鼠心肌中p-STAT3的表達水平與WT對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；KO模型組小鼠心肌中p-STAT3的表達水平低于WT模型組（P＜0.05）。見圖5。

3 討論

CHF的臨床診療缺少針對病理生理機制的治療手段，主要與疾病的發(fā)病機制未明相關，雖然心肌重構、炎癥細胞浸潤、膠原代謝異常等與CHF病情進展的關系受到一致認可[9-10]，但相關的調(diào)控機制仍未明確，因而也缺乏能夠預防或延緩CHF病理進程的治療靶點。

近些年，慢性炎癥反應在多種心血管疾病中的作用受到廣泛關注，炎癥反應激活不僅直接促進心肌中炎癥細胞的浸潤、導致心肌損傷及間質(zhì)纖維化，還參與氧化應激、細胞凋亡、膠原代謝等過程的調(diào)控，進而加重心肌損傷及間質(zhì)纖維化[11-13]。CHF相關的臨床研究證實血清中炎癥因子IL-8、TNF-α、IFN-γ等增多與患者心功能減退、預后不良有關[14-16]；相關的動物實驗證實多種改善心功能的藥物能夠在CHF模型中減輕心肌炎癥反應，抑制心肌中IL-8、TNF-α、IFN-γ等炎癥細胞因子的釋放[17-18]。在眾多與CHF發(fā)病相關的炎癥細胞因子中，IL-8的表達廣泛、生物學作用多樣，本研究在腹主動脈縮窄誘導的CHF模型小鼠中觀察到心肌IL-8的表達水平明顯增加，在此基礎上將深入研究IL-8高表達在CHF發(fā)病中的作用及機制。

CHF模型小鼠的心肌中IL-8呈高表達趨勢，為了研究IL-8的生物學作用，本研究通過LoxP-Cre系統(tǒng)進行了心肌中IL-8的特異性敲除，在特異性敲除心肌中IL-8的表達后進行CHF造模并通過超聲心動圖檢測、NT-proBNP檢測觀察心功能的情況。單純進行心肌中IL-8的敲除后，小鼠的心功能正常，表明在生理條件下IL-8表達缺失并不直接影響心功能；在特異性敲除心肌IL-8并造模后，小鼠的各項心功能指標與野生型CHF模型小鼠比較明顯改善，表明心肌特異性IL-8敲除能夠改善CHF小鼠的心功能，進而提示CHF小鼠心肌中IL-8表達增加與心功能的減退有關。

IL-8是具有廣泛生物學作用的細胞因子，參與炎癥反應、組織纖維化、細胞存活和凋亡等調(diào)控，抑制IL-8能夠在心肌缺血再灌注過程中起到抗炎、抗凋亡、抑制纖維化等保護作用。在CHF的發(fā)病過程中，心肌中高表達的IL-8也可能發(fā)揮調(diào)控炎癥反應、組織纖維化的生物學功能，進而導致心肌重構及心功能減退[19-21]。本研究在特異性敲除心肌IL-8并造模后觀察到心肌組織中CHF相關的病理改變較野生型CHF小鼠減輕，同時心肌中炎癥因子IL-1β、IFN-γ、TNF-α的表達較野生型CHF小鼠降低，表明心肌特異性IL-8敲除能夠減輕CHF小鼠的心肌病理改變及炎癥反應，這為IL-8在CHF發(fā)病過程中調(diào)控心肌病理改變提供了直接的實驗證據(jù)。

本研究還將通過心肌特異性IL-8敲除實驗初步探索IL-8參與CHF發(fā)病的相關分子機制。IL-6、IL-8、IL-35等白介素的生物學作用與下游STAT3通路密切相關，在細胞因子的持續(xù)作用下細胞內(nèi)的STAT3會磷酸化為p-STAT3，后者具有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用，能夠通過NF-κB增加多種炎癥因子的表達、促進炎癥反應的級聯(lián)放大[5，22]。在CHF的發(fā)病過程中，STAT3呈過度活化的趨勢；多種具有改善心功能的藥物能夠抑制STAT3的磷酸化并發(fā)揮治療作用。本研究在特異性敲除心肌IL-8并造模后觀察到心肌組織中p-STAT3的表達水平與野生型CHF模型小鼠比較明顯降低，表明心肌特異性IL-8敲除對STAT3的磷酸化活化具有抑制作用，進而提示IL-8可能通過STAT3在CHF的發(fā)病中發(fā)揮生物學作用。

綜上所述，CHF發(fā)病過程中心肌IL-8表達明顯增加；心肌特異性IL-8敲除顯著改善CHF小鼠的心功能及心肌炎癥反應，IL-8敲除的上述改善作用可能與抑制STAT3磷酸化活化有關。未來，IL-8/STAT3途徑有望成為研究CHF發(fā)病機制的新靶點，以IL-8為靶點、也可作為靶向防治CHF的新方向。