miR-let-7c通過介導精原干細胞分化改善小鼠精子質量的作用機制

王明 薩如拉 王超奇 燕貞

內蒙古民族大學附屬醫院1生殖醫學中心，2男科實驗室，3泌尿外科（內蒙古 通遼 028000）；4海南醫學院（?？?571199）

精子的形成是哺乳動物生殖系統中一個復雜的發育過程，由精原干細胞（spermatogonial stem cells，SSCs）分化而成[1]。SSCs能夠維持干細胞池的自我更新使精子連續分化分裂，表現在嚙齒動物生精上皮細胞克隆排列，通過分子標記（例如，ID4、GFRa1、PLZF、SALL4等）可評估睪丸SSCs維持精子發生的水平[2]。SSCs對精子發生至關重要，但僅占成年小鼠睪丸總細胞的0.02%～0.03%[3]。由于它是唯一能夠將遺傳信息傳遞給下一代的干細胞。因此，它們是基因改造實驗的有前途的資源。其次，生命過程中的自我更新和SSCs的分化能力可用于闡明導致精子發生的信號通路。最后，SSCs的全能性可分化為所有細胞系[2，4]。因此，SSCs可用于生殖醫學中治療不孕癥以及非免疫排斥性疾病[5]。

最近有研究[6]表明，微小 RNA（microRNA，miRNA）是一類內源性單鏈RNA分子（18-25個核苷酸），參與不同的細胞過程，包括自我更新、增殖、分化和凋亡。它們與靶mRNA的3'非翻譯區（untranslated region，UTR）結合，導致靶mRNA的核酸內切裂解或翻譯抑制[7]。多項研究發現miRNA可以調節SSCs增殖和分化之間的平衡，認為miRNAs是精子發生的重要調控元件[8-9]。例如，在SSCs中miRNA-100的高表達通過STAT3促進其增殖[9]。此外，SSCs的自我更新受miRNA-10b 和miRNA-322 的調節[2，10]。miRNA-202 對細胞周期調節因子和RNA結合蛋白的抑制導致精原干細胞的存活[11]。有研究指出miR-let-7家族與精原細胞自我更新相關的基因的調控相關[12]。但是，單個miRNA對于調節SSCs的功能和分子機制的必要性值得進一步研究。

1 材料與方法

1.1 主要耗材和儀器氯胺酮、注射用環磷酰胺（美國Sigma-Aldrich公司）；青霉素和鏈霉素、PBS、DNase（美國Sigma-Aldrich公司）；Ⅳ型膠原酶（美國Gibco公司）；透明質酸酶、臺盼藍（美國Sigma-Aldrich公司）；一抗ID4和Thy1、二抗FITC山羊抗兔IgG H&L（美國CST公司）；白血病抑制因子（美國Sigma公司）；堿性成纖維細胞生長因子（美國Peprotech公司）；β-巰基乙醇、神經膠質細胞系衍生神經營養因子、miR-let-7c抑制劑（美國Sigma-Aldrich公司）；Lipofectamine 2000、Opti-MEM（美國Invitrogen公司）；TRIzol試劑（美國Invitrogen公司）；逆轉錄試劑盒（日本Takara公司）；GoTaq qPCR Master Mix（美國Promega公司）；ABI7500 PCR擴增儀（美國Applied Biosystems公司）；倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；4%多聚甲醛、Triton X-100、山羊血清（美國Sigma-Aldrich公司）；cKit、FITC、DAPI（英國Abcam公司）；熒光顯微鏡（日本Olympus公司）；TriPure Isolation試劑（德國Roche公司）；SDS-PAGE（美國BioRad Laboratories公司）；PVDF膜（德國Roche公司）；GAPDH、GFRα1、PLZF和ID4一抗、HRP偶聯山羊抗兔二抗（英國Abcam公司）。

1.2 SSCs分離SPF級Balb/c雄性（3～6 d齡）和Balb/c雄性裸鼠（5～6周齡，體質量20～22 g）各40只購自北京華阜康生物科技股份有限公司，合格證號：SYXK（京）2019-0022，倫理審查編號：NM-LL-2022-07-19-1。參照之前的方法[13]，進行SSC的分離。簡而言之，Balb/c小鼠使用0.05 mg/kg氯胺酮麻醉；然后取出的睪丸立即轉移到含有PBS的培養皿中。在無菌條件下，用1%青霉素和鏈霉素的PBS洗滌樣品。切碎的睪丸轉移到含有5 μg/mL DNase、1 mg/mLⅣ型膠原酶和1 mg/mL透明質酸酶的消化培養基中。然后在37℃和5%CO2下孵育20 min。每5分鐘輕輕移去上層懸浮液。以1 500g離心5 min。使用相同的消化培養基純化細胞沉淀15 min。最后，使用血細胞計數器，0.04%臺盼藍評估細胞的活力。

1.3 SSCs純度測定參照之前的方法[14]，使用ID4和Thy1標記細胞，使用流式細胞術進行純度測定。簡而言之，將1×105個細胞在100 μL PBS/FBS和10 μL一抗（ID4和Thy1）中4℃孵育1 h。用PBS洗滌兩次后，將細胞在100 μL PBS/FBS和10 μL二抗中4℃孵育1 h。FITC山羊抗兔IgG H&L用作ID4和Thy1的二抗。對照組細胞不與抗體一起溫育。最后，細胞保存在冰上的暗室中，通過流式細胞術測定純度百分比。

1.4 SSCs培養使用含有DMEM培養基培養純化后的細胞（2×105細胞/cm2），在培養基中加入成分：10%FBS、10 ng/mL白血病抑制因子、10 ng/mL堿性成纖維細胞生長因子、0.1 mmol/L β-巰基乙醇、10 ng/mL神經膠質細胞系衍生神經營養因子、1%青霉素和鏈霉素。所有培養物在37℃下在5%CO2的加濕培養箱中培養，培養基每2～3 d更換一次。

1.5 細胞轉染培養的SSC分為4組：（1）未轉染組；（2）miR-let-7c抑制劑組；（3）抑制劑對照組；（4）轉染組。處理方式分別為：（1）未轉染組：SSC細胞不接受轉染處理，正常培養基培養；（2）miR-let-7c抑制劑組：lipofectamine 2000在Opti-MEM轉染培養基中將含有miR-let-7c抑制劑的質粒轉染至SSC細胞，轉染后換正常培養基培養；（3）抑制劑對照組：lipofectamine 2000在Opti-MEM轉染培養基中將含有miRNA抑制劑對照物的質粒轉染至SSC細胞，轉染后換正常培養基培養；（4）轉染組：lipofectamine 2000在Opti-MEM轉染培養基中處理SSC細胞，后換正常培養基培養。具體的轉染方法參照文獻[15]收集細胞用于評估蛋白表達的變化。1周后通過平板克隆實驗評估SSC的增殖能力。

1.6 qRT-PCR為了驗證miR-let-7c轉染在SSC中的有效表達，使用qRT-PCR在轉染后48 h檢測miR-let-7c的表達量。TRIzol試劑用于總RNA提取。然后使用逆轉錄試劑盒用于合成cDNA。Go-Taq qPCR Master Mix為模板擴增試劑，ABI7500 PCR擴增儀用于檢測miR-let-7c擴增表達量。U6 snRNA作為內參基因，通過2-ΔΔCT方法計算miR-let-7c表達量。引物序列如下：miR-let-7c F：5'-AATTCAAAAATGAGGTAGTAGGTTGTATGGTT-3'；R：5'-CCGGAACCATACAACCTACTACCTCATTTTTG-3'。U6 F：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'；R：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'

1.7 SSCs增殖評估轉染后，將2×105細胞/cm2SSCs接種到含有10%FBS、1%青霉素鏈霉素、10 ng/mL白血病抑制因子和10 μg/mL神經營養因子的DMEM中培養，存放在5%CO2、37℃存放1周。使用倒置顯微鏡測定集落的直徑和數量。使用Image J軟件對數據進行分析。

1.8 免疫組化SSC用4%多聚甲醛固定、0.1%Triton X-100透化，然后用10%山羊血清封閉1 h。將樣品與C-Kit一起孵育24 h，然后與二抗FITC室溫孵育2 h。細胞核用DAPI染色。熒光顯微鏡用于觀察載玻片。

1.9 Western blotTriPure Isolation試劑用于提取SSC總蛋白。進行電泳以分離樣本蛋白，將蛋白質轉移到10%SDS-PAGE和PVDF膜上，并用5%脫脂牛奶封閉。隨后，將樣本與針對GFRα1、PLZF和ID4的一抗在4℃下孵育過夜。加入適當的二抗HRP偶聯山羊抗兔后，將PVDF膜孵育2 h。最后，使用增強的化學發光評估蛋白質的表達。

1.10 在體實驗Balb/c裸鼠適應性飼養5 d后，隨機分為對照組、模型組、miR-let-7c抑制劑組、抑制劑對照組，每組10只。模型組、miR-let-7c抑制劑組、抑制劑對照組小鼠按照60 mg/（kg·d）腹腔注射環磷酰胺[16]，連續5 d，對照組用等量生理鹽水腹腔注射。第6天開始，miR-let-7c抑制劑組、抑制劑對照組小鼠分別給予附睪內注射轉染miR-let-7c抑制劑的SSC或miRNA抑制劑對照物的SSC。到第30天，不同組小鼠經過干預后，頸椎脫臼處死小鼠，取雙側睪丸和附睪，參照之前的文獻[17]對裸鼠精子濃度、活力及形態分析。

1.11 統計學方法采用GraphPad Prism 7.0軟件，數據表示為均數±標準差。使用one-way ANOVA和Tukey post-hoc test分析數據。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SSCs的鑒定使用流式細胞術分析未分化精原細胞標記物ID4和Thy1的表達，用于鑒定SSCs。SSCs中標記物的表達百分比分別為84.3%和97.4%（圖1）。

2.2 評估SSC中miR-let-7c的表達miR-let-7c表達在轉染前和轉染后48 h使用qRT-PCR進行評估。結果表明，與未轉染組相比，miR-let-7c抑制劑組的miR-let-7c表達水平顯著降低（t=28.475，P＜0.05）。在抑制劑對照組和轉染組中沒有觀察到顯著變化（P＞0.05，圖2）。

2.3 miR-let-7c的抑制誘導了小鼠SSCs的增殖轉染1周后，倒置顯微鏡拍攝集落圖像（圖3A-F），使用Image J軟件測量集落直徑和數量。結果顯示miR-let-7c抑制劑組的集落直徑明顯小于其他組（F=49.781，P＜0.05），而集落數量與其他組無明顯變化（P＞0.05，圖3G-H）。

2.4 miR-let-7c的抑制誘導了小鼠SSCs的分化c-Kit作為分化標志物在轉染后48 h使用免疫細胞化學進行評估。與其他組細胞相比，miR-let-7c抑制劑組中c-Kit分化基因的表達顯著增加（F=165.336，P＜ 0.05，圖4）。這表明miR-let-7c的抑制誘導了小鼠SSCs的分化過程。

2.5 miR-let-7c的抑制下調了增殖相關蛋白的表達轉染48 h后，Western blot用于研究增殖相關蛋白[（膠質細胞源性神經營養因子a1（glialcelllinederivedneurotrophicfactor a1，GDNFa1）、早幼粒細胞白血病鋅指（PLZF，promyelocytic leukemia zinc finger）和分化抑制因子4（inhibitor of differentiation，ID4）]的表達。結果顯示，與其他組相比，miR-let-7c抑制劑組中GFRa1、PLZF和ID4的表達顯著降低（F=98.556、78.358、91.249，P＜ 0.05，圖5）。

2.6 miR-let-7c的抑制對小鼠生長及精子質量的影響模型組精子質量較對照組顯著下降，經miR-let-7c抑制劑轉染后精子質量得到了顯著恢復；精子濃度、精子活力和正常形態率均有顯著提高（F=27.936、52.417、31.582、47.659，P＜ 0.05，表1）。

表1 不同組小鼠處理后精子質量比較Tab.1 Comparison of sperm quality in different groups of mice after treatment ±s

表1 不同組小鼠處理后精子質量比較Tab.1 Comparison of sperm quality in different groups of mice after treatment ±s

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05

組別對照組模型組miR-let-7c抑制劑組抑制劑對照組例數10 10 10 10精子濃度（×106/mL）4.30±0.12 2.94±0.16*3.90±0.12#3.12±0.12精子活力前向運動精子（%）15.70±0.79 6.53±0.72*8.76±0.48#6.37±0.34非前向運動精子（%）16.71±0.71 7.77±0.36*12.97±1.19#7.93±0.34正常形態精子（%）60.38±2.22 30.03±1.65*57.48±1.63#29.09±1.44

3 討論

SSCs在形成和促進精子發生方面發揮著重要作用。精子形成是一個受到高度調控化過程，需要在SSCs的增殖和分化之間獲得平衡。這種平衡受內在因素和外在信號的調節，在決定精子的供應和生育能力方面起著關鍵作用[18]。miRNA對生物過程的調控至關重要，并且通過與其特定mRNA的3'UTR結合而發揮作用。最近的研究表明，多種miRNA可能通過調節靶基因表達促進哺乳動物的精子發生[19]。然而，單個miRNA調控精子形成機制和靶點大多是未知的。幾項研究報告稱，ID4的表達僅限于精原細胞并且ID4的過表達抑制了干細胞到祖細胞的轉變[20]。因此，ID4可用于SSCs的識別和鑒定。Thy-1是Ig超家族的糖基磷脂酰肌醇錨定糖蛋白，已被引入牛、嚙齒動物和靈長類動物中作為SSCs的鑒定標志物[21]。在經酶消化和原代培養后，用流式細胞術鑒定了細胞ID4和Thy1的表達比率并檢測了該細胞的miR-let-7c基礎表達水平，結果表明提取的細胞為SSCs。隨后觀察了miR-let-7c抑制劑處置后SSCs增殖和分化的改變，表現為miR-let-7c抑制劑可導致SSCs集落直徑明顯減小。因為SSCs首次出現在小鼠產后3～6 d。ID4在SSCs自我更新或未分化狀態的調節中起著關鍵作用。ID4的表達僅限于As精原細胞，其過表達抑制了干細胞向祖細胞的轉變。這些結果與其他研究一致[2，4，10]。

研究表明，在小鼠未分化SSCs中主要檢測到GFRα1表達。GFRα1是GDNF的主要受體，被認為是GFRα1/RET信號通路的必要成分[22-23]。GDNF作為維持SSCs不可或缺的因素，通過與GFRα1/RET受體結合發揮作用，并調節參與促進SSCs自我更新或阻止SSCs分化基因的表達。早幼粒細胞白血病鋅指PLZF的下調可導致mTORC1激活、GDNF受體（包括GFRa1和RET）的下調、SSCs對GDNF的反應的抑制以及SSCs增殖的抑制。此外，PLZF還直接和間接抑制分化基因c-Kit的表達[24-25]。在本研究中顯示，細胞轉染后48 h GFRα 1、PLZF和ID4蛋白的表達，GFRα1、PLZF和ID4蛋白的表達下調。這表明miR-let-7c的下調減少了SSCs的自我更新和增殖。

C-kit是Ⅲ類受體酪氨酸激酶的成員，它僅存在于分化的精原細胞中，被認為是精原細胞分化的良好表征的標志物。SSCs從未分化狀態到分化狀態的轉變與Kit/Kitl系統的激活一致[26]。在c-kit激活之后，分化的SSCs將進入減數分裂并開始表達早期減數分裂標志物，包括STRA8、Dmc1和Scp3[27]。在免疫組化結果顯示，與其他組相比，轉染miR-let-7c抑制劑的SSCs中分化蛋白c-Kit的表達顯著增加。表明miR-let-7c的抑制誘導了小鼠SSCs的分化過程。

根據既往研究中所述[17]的小鼠少弱精子癥模型，發現模型制備后出現小鼠的精子數量減少、精子活力下降等生殖毒性，這是少弱精子癥的具體表現，在此模型的基礎上，研究了miR-let-7c的抑制劑對少弱精子癥動物模型的治療效果。結果發現miR-let-7c抑制劑干預30 d后，模型組睪丸組織損傷有所恢復，上述指標均得到了一定程度的改善，這證明轉染miR-let-7c抑制劑的SSCs對少弱精子癥具有一定的治療效果。但同時，本研究也存在著局限性，例如應該在更多的鼠源性模型進行試驗和驗證，還應尋找SSCs的增殖和分化標志物進行驗證。

綜上所述，miR-let-7c抑制劑可能促進精原干細胞分化并改善小鼠精子質量。在以后的研究中，還會去尋找到類似的miRNA去探索和功能驗證。