阿爾茨海默病與microRNA-206基因多態(tài)性的關(guān)系

李俊彥 余夢(mèng)擎 楊琳琳 蔡鈺瑩 李友 楊宇

廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院1老年醫(yī)學(xué)科，2急診醫(yī)學(xué)中心，3神經(jīng)病學(xué)研究所（廣東 湛江 524000）

阿爾茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是一種主要引起癡呆的神經(jīng)退行性疾病，其特征是進(jìn)行性記憶力下降，常伴有執(zhí)行、語言和（或）視覺空間功能的缺陷以及行為改變，嚴(yán)重者導(dǎo)致死亡[1-2]。AD是一種緩慢且不可逆的，但進(jìn)行性、復(fù)雜和多因素的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，是老年人群癡呆的最常見原因。65歲后患AD的風(fēng)險(xiǎn)顯著增加，超過85歲的人群患AD的風(fēng)險(xiǎn)高達(dá)30%[3-4]。

目前，AD的病因尚未完全明確。神經(jīng)炎癥、細(xì)胞外以β淀粉樣蛋白為主要蛋白組分的老年斑和細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)原纖維纏結(jié)是AD的關(guān)鍵病理標(biāo)志物。AD主要特征是皮質(zhì)和海馬神經(jīng)元丟失，以及關(guān)鍵神經(jīng)遞質(zhì)通路的進(jìn)行性退化[5-6]。MicroRNAs是0生物體內(nèi)源性的小RNA分子，長度為19～23個(gè)堿基對(duì)。大量研究發(fā)現(xiàn)microRNAs在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的含量非常豐富，它們?cè)谏窠?jīng)細(xì)胞的增殖、發(fā)育、分化、凋亡，神經(jīng)元遷移及突觸塑形過程中扮演了非常重要的角色，從而參與多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生[7-9]。LEE等[10]報(bào)道了AD患者顳葉皮層的腦組織microRNA-206表達(dá)水平明顯升高。國內(nèi)學(xué)者林曉光[11]研究發(fā)現(xiàn)microRNA-206通過調(diào)節(jié)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）及磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信號(hào)通路，促進(jìn)神經(jīng)元凋亡，進(jìn)而參與AD的發(fā)病。

編碼人microRNA-206基因位于6號(hào)染色體短臂1區(qū)2帶（6p12），含有1個(gè)外顯子[12-13]。WANG等[14]研究發(fā)現(xiàn)microRNA-206基因上游啟動(dòng)子區(qū)域rs16882131位點(diǎn)多態(tài)性與BDNF基因rs6265位點(diǎn)多態(tài)性存在密切的交互作用，這種交互作用會(huì)增加雙相情感障礙發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。基于上述研究，我們推測(cè)microRNA-206基因rs16882131位點(diǎn)多態(tài)性可能與AD的發(fā)病有關(guān)。迄今為止，從分子遺傳學(xué)角度研究microRNA-206基因多態(tài)性與AD易感性的關(guān)系尚沒有國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道。本研究以中國人群為對(duì)象，首次分析microRNA-206基因rs16882131位點(diǎn)多態(tài)性與AD易感性的關(guān)系，并比較AD患者與健康者外周血microRNA-206表達(dá)水平的變化，進(jìn)一步探討rs16882131位點(diǎn)不同基因型與microRNA-206表達(dá)水平的關(guān)系。這為闡明microRNA-206基因多態(tài)性與AD易感性的關(guān)系提供強(qiáng)有力的依據(jù)，為AD的診治提供新的線索。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象以2017年1月至2021年6月在廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)科門診或住院的100例AD患者（病例組）為研究對(duì)象。AD的診斷參照1984年美國國立神經(jīng)病、語言機(jī)能紊亂和卒中研究所及阿爾茨海默病和相關(guān)疾病協(xié)會(huì)（National Institute of Neurological and Communicative Diseases and Stroke/Alzheimer Disease and Related Disorders Association，NINCDS-ADRDA）制定的標(biāo)準(zhǔn)[15]并且符合2011年美國國立老化研究所和阿爾茨海默協(xié)會(huì)對(duì)此標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行修訂的“很可能的AD”的核心臨床標(biāo)準(zhǔn)。病例組排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）其他類型的癡呆。（2）既往有精神障礙性疾病。（3）既往有影響神經(jīng)系統(tǒng)功能的疾病者，如自身免疫性腦炎等。對(duì)照組選自廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院體檢中心同期體檢的健康者100例。對(duì)照組排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）簡(jiǎn)易精神狀態(tài)量表（MMSE）評(píng)分＜ 28分。（2）認(rèn)知能力和日常生活能力下降。（3）有癡呆家族史或中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病史者。（4）既往有精神障礙性疾病。兩組研究對(duì)象均為無血緣關(guān)系的中國人群。本研究已通過廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象均簽署知情同意書。兩組的一般臨床資料詳見表1。

表1 兩組一般臨床資料比較Tab.1 The comparison of the general clinical information between the two groups ±s

表1 兩組一般臨床資料比較Tab.1 The comparison of the general clinical information between the two groups ±s

臨床資料年齡（歲）性別（男/女，例）吸煙史（例）受教育年限（年）MMSE評(píng)分病例組（n=100）68.36±9.34 43/57 36 9.51±1.42 11.95±2.35對(duì)照組（n=100）67.58±9.15 46/54 33 9.62±1.45 28.27±2.56 t/χ2值0.597 0.182 0.199 0.542 46.96 P值0.552 0.669 0.655 0.588＜0.001

1.2 基因型檢測(cè)采用乙二胺四乙酸鈉抗凝管收集兩組研究對(duì)象空腹外周靜脈血2 mL，按照北京天根生化科技有限公司生產(chǎn)的血液基因組DNA提取試劑盒操作說明書提取兩組研究對(duì)象外周血全基因組DNA。運(yùn)用SNaPshot技術(shù)[16]對(duì)兩組研究對(duì)象的microRNA-206基因rs16882131位點(diǎn)進(jìn)行基因型檢測(cè)，主要操作步驟包括：多重聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）、單堿基延伸反應(yīng)以和多態(tài)性位點(diǎn)的測(cè)定。其中rs16882131位點(diǎn)PCR上游引物序列：5'-ATGCACAAAAACAGCAGCAG-3'；下游引物序列：5'-GAAAAACCTTTGGGGGAAAG-3'。

1.3 外周血單個(gè)核細(xì)胞總microRNA提取和實(shí)時(shí)熒光定量PCR采用密度梯度離心法提取兩組研究對(duì)象外周血單個(gè)核細(xì)胞，并根據(jù)RNA提取試劑盒操作步驟提取單個(gè)核細(xì)胞總microRNA。按照cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明書將單個(gè)核細(xì)胞總microRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)熒光定量試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀操作步驟檢測(cè)兩組研究對(duì)象microRNA-206的表達(dá)水平，以U6作為microRNA-206內(nèi)參定量產(chǎn)物濃度。每個(gè)cDNA樣本重復(fù)檢測(cè)3次實(shí)時(shí)熒光定量PCR，運(yùn)用2-ΔΔCt值計(jì)算兩組研究對(duì)象microRNA-206的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用直接計(jì)數(shù)法統(tǒng)計(jì)兩組的基因型頻率和等位基因頻率；采用哈迪-溫伯格定律對(duì)兩組進(jìn)行遺傳平衡吻合度檢驗(yàn)；兩組基因型頻率和等位基因頻率分布的比較采用χ2檢驗(yàn)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)。本研究數(shù)據(jù)運(yùn)用SPSS 19.0軟件分析，均為雙側(cè)檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組microRNA-206基因rs16882131位點(diǎn)的基因型頻率和等位基因頻率分布比較病例組和對(duì)照組的microRNA-206基因rs16882131位點(diǎn)的基因型頻率分布均符合哈迪-溫伯格定律（P＞0.05），提示兩組納入的研究對(duì)象具有良好的群體代表性。病例組microRNA-206基因rs16882131位點(diǎn)的CC、CT和TT基因型頻率分別是44.0%、38.0%和18.0%，對(duì)照組分別是59.0%、34.0%和7.0%，兩組基因型頻率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（CCvs.CTvs.TT：P=0.027；顯性模型TT+CTvs.CC：P=0.034，OR=1.831，95%CI：1.045 ～ 3.209）；病例組microRNA-206基因rs16882131位點(diǎn)T等位基因頻率明顯高于對(duì)照組（37.0%vs.24.0%，P=0.005，OR=1.860，95%CI：1.206 ～ 2.868），見表2。

表2 兩組microRNA-206基因rs16882131位點(diǎn)基因型和等位基因頻率分布比較Tab.2 The comparison of the genotype and allele frequencies of the SNP rs16882131 in the microRNA-206 gene between the two groups 例（%）

2.2 兩組外周血microRNA-206表達(dá)水平的比較和rs16882131位點(diǎn)對(duì)microRNA-206表達(dá)水平的影響病例組的microRNA-206相對(duì)表達(dá)量明顯高于對(duì)照組[（1.85± 0.24）vs.（0.99± 0.18）]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖1。對(duì)照組rs16882131位點(diǎn)的基因型與microRNA-206表達(dá)水平的關(guān)系分析發(fā)現(xiàn)TT+CT基因型（T等位基因攜帶）的microRNA-206相對(duì)表達(dá)量明顯高于CC基因型[（1.33±0.19）vs.（0.75±0.17）]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖2。

3 討論

AD是一種進(jìn)行性且不可逆的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，是老年人中最常見的癡呆形式。AD可分為3個(gè)階段：（1）臨床前期，通常沒有出現(xiàn)臨床癥狀，有生物學(xué)標(biāo)志物的早期改變。（2）前驅(qū)期，包括疾病的最早癥狀階段，即認(rèn)知能力下降開始明顯，而生物標(biāo)志物水平未達(dá)到診斷癡呆的截止標(biāo)準(zhǔn)。（3）病理和癥狀學(xué)完全發(fā)展的癡呆階段。目前認(rèn)為AD主要的病理基礎(chǔ)是淀粉蛋白前體蛋白異常斷裂、β淀粉蛋白沉積和神經(jīng)纖維纏結(jié)[17-19]。

β淀粉蛋白沉積和微管相關(guān)蛋白過度磷酸化是AD早期神經(jīng)退行性過程的關(guān)鍵致病因素，并且它們被認(rèn)為在突觸處局部相互作用，導(dǎo)致突觸功能障礙和認(rèn)知減退。越來越多的證據(jù)表明突觸中蛋白質(zhì)功能的改變可能參與AD的早期突觸改變[20-22]。近年來，一些研究發(fā)現(xiàn)MicroRNAs可能通過改變突觸的結(jié)構(gòu)和功能從而導(dǎo)致神經(jīng)退行性變[23-24]。眾所周知，BDNF是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)最廣泛的神經(jīng)營養(yǎng)因子系統(tǒng)，它通過與其特異性受體酪氨酸受體激酶B6結(jié)合而對(duì)神經(jīng)元產(chǎn)生神經(jīng)營養(yǎng)作用。此外，BDNF是參與維持突觸可塑性和突觸發(fā)生的關(guān)鍵分子。有研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)microRNA-206會(huì)抑制BDNF的生成，進(jìn)一步引起突觸功能障礙和神經(jīng)退行性變，進(jìn)而參與AD的發(fā)病。由此可見，microRNA-206的異常表達(dá)與AD發(fā)病密切相關(guān)。基于此，本研究首次分析microRNA-206基因rs16882131位點(diǎn)多態(tài)性與AD易感性的關(guān)系，并比較AD患者與健康者外周血microRNA-206表達(dá)水平的變化。

本研究發(fā)現(xiàn)AD患者microRNA-206基因rs16882131位點(diǎn)TT+CT基因型（T等位基因攜帶）和T等位基因頻率均明顯高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（56.0%vs.41.0%，P=0.034，OR=1.831；37.0%vs.24.0%，P=0.005，OR=1.860），提示T等位基因可能是AD易感性的危險(xiǎn)因素。此外，AD患者外周血microRNA-206表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組。基于這些發(fā)現(xiàn)，推斷microRNA-206基因多態(tài)性與AD易感性密切相關(guān)，并且外周血microRNA-206可作為AD的一種重要的生物學(xué)標(biāo)記物。值得一提的是，本研究還發(fā)現(xiàn)rs16882131位點(diǎn)T等位基因攜帶者的microRNA-206表達(dá)水平明顯高于CC基因型。rs16882131位點(diǎn)位于microRNA-206基因上游啟動(dòng)子區(qū)域，推測(cè)microRNA-206基因rs16882131位點(diǎn)T等位基因可能增加其啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄活性，引起microRNA-206基因表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而參與AD的發(fā)病。然而，rs16882131位點(diǎn)多態(tài)性與microRNA-206基因啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄活性的關(guān)系需要更進(jìn)一步的基礎(chǔ)研究去證實(shí)，這也是繼續(xù)開展研究的方向之一。

本研究尚存在一些不足地方。首先，本研究納入的總體研究對(duì)象樣本量相對(duì)偏小。其次，本研究只分析了microRNA-206基因rs16882131位點(diǎn)多態(tài)性與AD易感性的關(guān)系。因此，后續(xù)研究將會(huì)繼續(xù)增加病例對(duì)照組樣本量，更進(jìn)一步分析microRNA-206基因其余位點(diǎn)多態(tài)性與AD易感性的關(guān)系。此外，在后續(xù)的研究中我們將會(huì)繼續(xù)尋找其他參與AD發(fā)病的基因，進(jìn)一步分析其多態(tài)性與不同人群AD易感性的關(guān)系。

綜上所述，microRNA-206基因rs16882131位點(diǎn)多態(tài)性與AD發(fā)病易感性有關(guān)，T等位基因可能通過上調(diào)microRNA-206的表達(dá)進(jìn)而引起AD。