肝臟病變患者血清HLA-G5和外周血T淋巴細胞亞群分布的變化及意義

易禎禛 宮黎明 賀敏 文德學 王興林 任真奎△

(1.黔西南布依族苗族自治州人民醫院檢驗科，貴州 興義 562400；2.遵義醫科大學附屬醫院生殖中心，貴州 遵義 563099)

慢性乙型肝炎病毒(chronic hepatitis B virus ，HBV)的感染在我國處于高發狀態，而肝細胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)的發生主要與HBV感染密切相關[1,2]。由于每年的HBV感染率逐漸增加，導致HCC的發病率也呈逐年上升的趨勢，肝硬化也是乙肝患者轉為肝癌的一個中間階段。HCC是臨床常見的惡性腫瘤之一，部分肝癌患者在發病后就已經為晚期，失去最佳手術治療的機會，其死亡率一直居于消化系統惡性腫瘤的前三位。因此，能夠盡早評估發現肝癌對提高患者的預后和治療效果具有重要的臨床意義。當前的臨床方法使用血清學指標，例如乙型肝炎病毒脫氧核糖核酸(hepatitis B virus deoxyribonucleic acid ，HBV-DNA)，核心啟動子突變和肝硬化”(core promoter mutations and cirrhosis，GAG-HCC)， “乙型肝炎e-抗原血清清除后肝細胞癌”( hepatocellular carcinoma after hepatitis B e-antigen seroclearance，HCC-ESC)等評分，來用于預測HCC的發展[3-5]，但這些對于5年期的HCC發展評估不理想。目前，缺乏對預測肝癌發展的高度準確，且真正有效地，可識別和操作的方法。近年來，在各種腫瘤研究報告中HLA-G(human leukocyte antigen-G ，HLA-G)分子存在顯著差異，其在HCC中也有報道。研究已指出，HLA-G是機體內重要的參與免疫耐受的分子，包含三種可溶性的HLA-G5(sHLA-G5)、HLA-G6、HLA-G7分子及四種模型HLA-G1-G4[6-7]。 HLA-G的全基因片段含6個外顯子，外顯子1～4以及內含子4表達HLA-G5，翻譯過程終止于此區域終止密碼子處，導致外顯子5和6不翻譯，跨膜區和胞質區缺失[8]。在HLA-G分子的3個可溶型亞型中，表達豐度與功能研究最多的是HLA-G5。HLA-G5在免疫中表現出的作用在移植免疫、腫瘤免疫和生殖免疫領域備受關注，具有廣泛的基礎研究和臨床應用前景[9-10]。以往研究皆顯示出腫瘤的整個病程與腫瘤宿主的免疫狀況密切相關，而T淋巴細胞介導的細胞免疫在機體抗腫瘤免疫中起著主導作用[11]。T細胞亞群是機體進行免疫監視、抗腫瘤及抗感染中的重要組成部分，可以分為CD3+、CD4+和CD8+三類細胞，其中CD3+細胞是全T細胞標志，CD4+細胞具有輔助前細胞的功能，CD8+細胞則具有抑制誘導及細胞毒性功能[12]。T淋巴細胞亞群分布指示的機體免疫功能狀態是研究治療肝病的重要因素，然而目前僅有的這些指標對疾病的預判遠遠不夠，尋求更新且有效的指標是目前研究的重要方向。因此，本研究嘗試結合HLA-G5與T淋巴細胞亞群來聯合判斷患者的細胞免疫功能狀態，對確定相應的治療方案、觀察療效及評估預后提供參考。報告如下。

1 材料與方法

1.1材料 (1)材料與試劑:患者標本由黔西南州人民醫院經患者知情同意后采集獲得；ELISA檢測試劑盒由江蘇科特生物科技有限公司獲得；丙氨酸氨基轉移酶(ALT)檢測試劑盒、甲胎蛋白(AFP)檢測試劑盒和天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)檢測試劑盒購自羅氏診斷產品(上海)有限公司；抗CD3+、CD4+和CD8+的單克隆抗體購自深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司；酶標儀(Addcare ELISA 600)，流式細胞儀(BriCyte E6)，高速離心機(14D)、超低溫冰箱(DW-25L262)。

1.2方法

1.2.1患者標本的分組及采集 整個實驗分為3個組，分別為乙肝組、肝硬化組和肝癌組，隨機抽取2018年8月至2020年2月本院收治的肝病患者作為本次實驗的研究對象，每組約40份標本，經知情同意后，每位患者采集全血2～3 mL，高速離心分離血清，冰凍保存，待標本全部收集完成進行檢測。同上，用抗凝管采集患者1～2 mL全血用于流式檢測。

1.2.2全自動生化分析儀檢測血清中ALT、AST含量 將檢測試劑裝載上機后，血清標本ALT和AST的檢測在本院檢驗科生物化學組進行，保存結果。

1.2.3全自動化學發光儀檢測血清中AFP含量 將檢測試劑裝載上機后，血清標本放在化學發光儀自動進行AFP含量檢測，保存結果。

1.2.4ELISA法檢測血清中的HLA-G5變化情況 按試劑盒步驟將標準品和稀釋液按一定比例進行稀釋，并將以上患者血清標本分組排好序，將標準品與待測樣本加入孔板中，在450 nm波長處測各孔吸光度(OD值)，根據標準物濃度與OD值導出標準曲線和函數方程，將樣品OD值輸入該方程，計算出相應樣品中的HLA-G5濃度，再乘以稀釋倍數，本實驗中稀釋倍數為5倍。每個樣品設置3個復孔，空白孔為無檢測試劑與樣品，樣品孔和標準孔OD值均以空白孔調零。

1.2.5流式細胞術檢測T細胞亞群分布情況 將采集的抗凝全血混勻，取100 μL于試管中，分別加入CD4+CD4+和CD8+單克隆熒光抗體10 μL，混勻后室溫避光靜置15 min。接著用溶血素溶解紅細胞，同樣混勻后避光放置15 min，待溶解結束后1 000 rpm離心5 min收集細胞沉淀。細胞用PBS緩沖液反復洗3次，盡可能洗掉前面所用試劑。最后同樣條件離心收集細胞用稀釋液重懸細胞，上機檢測。

2 結 果

2.1各組肝病患者血清中的AFP、AST和ALT的含量 檢測結果顯示，與乙肝組相比，肝癌組的AFP、AST和ALT含量明顯升高(P<0.05)，肝硬化組含量有升高趨勢，差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 不同肝病患者AFP、AST和ALT的含量

2.3各組肝病患者外周血中的T淋巴細胞亞群分布情況 流式結果顯示，與乙肝組相比，肝硬化與肝癌組CD3+百分比均減少，而CD4+ /CD8+比值均增加，肝癌組的CD4+百分比上升)，肝硬化組CD4+百分比呈上升趨勢，但是未具統計學意義，肝硬化組的CD8+百分比減少，差異均有統計學意義(P<0.05)，而肝癌組的CD8+百分比也有下降趨勢，差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 不同肝病患者T淋巴細胞亞群分布

3 討 論

我國乙肝一直處于高發狀態，同時肝病患者比例也相應增多。由乙肝到肝癌的過程復雜且長久，在臨床治療中面臨著諸多困難，例如對肝癌患者的早發現早治療就是一大問題。臨床上對疾病的診斷依據目前還是血清學常規檢查等，并結合相應的臨床指標作出治療對策，這些指標雖能對疾病狀態進行評估，但是不能更好地反映患者的具體病理狀態，進而不能很好地指導臨床進行救治。而在肝病患者治療過程中發現，了解其免疫功能的具體情況對疾病進程的認知以及診治有很大的幫助。因此，尋求真正有效地和可識別的指標是研究的方向。有研究發現HLA-G在許多免疫相關疾病中可被誘導，起到免疫耐受作用[13,14]。在研究的大多數組織學類型的癌癥中均觀察到不同程度的HLA-G表達，并且強調了HLA-G相關的信號通路在癌癥生物學中作為免疫檢查點的重要性[15]。HLA-G 關聯的信號通路可抑制NK細胞，T和B淋巴細胞的增殖以及樹突狀細胞的成熟和抗原呈遞，抑制細胞的細胞毒和殺傷作用，B細胞的免疫球蛋白產生等[16-18]。

在本次研究中，我們擬通過結合檢測患者血清HLA-G5和全血T細胞亞群分布，來研究不同肝病患者細胞免疫功能的改變情況及其之間的相互聯系，進一步評估患者免疫功能的紊亂程度，為臨床研究肝病患者的免疫療法補充材料。本次研究結果顯示，首先指示肝臟的AFP、AST和ALT指標的升高說明此次研究的患者的病程判斷正確，AST和ALT指標升高表明就診患者肝臟功能受損加重。接著在我們本次研究中各組肝病患者血清中的HLA-G5呈現的升高變化，與之前的報告一致[19-21]。流式結果顯示，肝病患者的T淋巴細胞亞群明顯超出正常范圍值。肝硬化與肝癌組CD3+百分比均減少，而CD4+ /CD8+比值均增加，肝癌組的CD4+百分比增加，肝硬化組的CD8+百分比下降，說明患者免疫功能處于對病毒的清除階段，機體還未發展嚴重的到免疫細胞毒性階段。肝硬化與肝癌組的HLA-G5明顯升高，且肝癌組明顯比肝硬化HLA-G5表達高，根據之前的研究，HLA-G在免疫T細胞中顯示出不同的調控作用[22]，說明在肝病患者的體內HLA-G5的表達與免疫狀態存在重要的調控關系。大量研究表明，癌癥中HLA-G的異常表達與疾病進展和較差的臨床預后有關[23]。HLA-G與T淋巴細胞亞群的聯合結果更能進一步地觀察到肝病患者體內機體的免疫狀態，更能細致區分機體免疫的動態過程，為評估患者治療提供新的支撐，當然這也需要更多的進一步的臨床試驗來將二者之間的關系進行歸納。