圈養小熊貓竹葉增食劑的研制與飼喂效果

鮮義坤，瞿桂英，廖友平，馬黎民，張亞輝，劉張育，魏 明，黃明亞，張貴權

（1.四川省自然資源科學研究院，四川 成都 610041；2.大熊貓國家公園珍稀動物保護生物學國家林業和草原局重點實驗室，四川 成都 611830；3.中國大熊貓保護研究中心，四川 成都 611830；4.吉林農業大學 動物科學技術學院，吉林 長春 130118；5.成都大帝漢克生物科技有限公司，四川 成都 611130；6.四川省動物采食調控工程技術研究中心，四川 成都 611130）

0 引言

小熊貓（Ailurus fulgens）屬于喜馬拉雅—橫斷山脈特有的珍稀獸類，被CITES（國際瀕危動植物物種國際貿易公約）列入附錄Ⅰ，被IUCN（國際自然資源保護聯盟）列為瀕危動物，為我國二級重點保護動物［1］。小熊貓與大熊貓在四川盆地西緣的岷山、邛崍、涼山和相嶺山系同域共存，相互伴生，食性相同，均以低營養價值的竹類為主要食物。但小熊貓只食竹葉和竹筍［2］，不食竹稈，且對不同竹種的葉和筍有著明顯的選擇性［3］。據測算，小熊貓全年食用竹葉的比例可高達89.9%［4］。小熊貓體色鮮艷、體態優美，頗具觀賞性，具有較高的科普和科研價值，近年被許多地方的動物園、公園、保護區和科研院所與中心等單位越來越多地人工飼養。

飼養動物的經典理念為“養重于防，防重于治”。喂給動物的食物即使營養物質種類齊全、含量豐富，但如果動物不攝食或少攝食，就會失去或降低食物應有的飼喂價值。對于飼養大熊貓、小熊貓等植食性野生動物而言，首要的理念應為“味重于養”，即食物的氣味和味道（二者統稱“風味”）要適合動物的偏好，動物才可能多吃、多長、少生病、多產出，展現食物的營養功能。早在1940 年，美國科研人員就開始研究仔豬和雞的飼料適口性問題。我國同類研究始于1992 年，首先研究了飼料調味劑對仔豬采食量和生長的影響，現已在家養動物嗅覺、味覺、采食調控機理等方面取得了豐碩的理論成果，并有大量的產品應用于家畜、家禽、寵物、水產動物和特種經濟動物的日糧中［5］。野生動物在這些方面雖然有過零星報道［6-10］，但還缺乏系統性和深入性探究。本研究根據圈養小熊貓喜歡的食物風味特點、攝食行為習慣、嗅覺和味覺生理特征，在國內外率先自主研發出竹葉增食劑，并于2022 年4 至6 月間先后3 次在中國大熊貓保護研究中心都江堰基地進行了飼喂試驗，測試了竹葉增食劑的實際效果，并進一步探討了小熊貓攝食竹葉的風味機理，研究結果也可為圈養大熊貓竹葉誘食劑的研制提供借鑒和參考。

1 竹葉增食劑的研制

1.1 設計理論依據

竹葉增食劑的設計理論依據主要有以下5 個方面：①小熊貓的食性屬植食性，而植食性的很多動物主要根據氣味尋找食物［6］。②經攝食行為觀察，小熊貓在進食前都要嗅聞竹葉的氣味。③食物的氣味和味道分別由動物的嗅覺和味覺感知，是動物對食物安全性的一種常用判斷方法；對熟悉的氣味，動物才可能攝食；對喜歡的味道，動物才會較多地攝食。④小熊貓具有完整的甜味受體基因［7，8］。⑤圈養小熊貓喜歡攝食窩窩頭、蘋果和胡蘿卜等食物，這些食物共有的香氣特點是甜氣［9，10］，共有的味道特點是甜味。基于上述5 個方面的理論依據，設計竹葉增食劑時既要有作用于小熊貓嗅覺的香氣，又要有作用于小熊貓味覺的味道。

1.2 原料選用原則

鑒于我國目前尚無人工飼養小熊貓的食物添加劑要求或標準，在選用竹葉增食劑的原料時遵循“從食物中來，到食物中去”的原則。小熊貓在人工飼養條件下與圈養大熊貓同食一樣的窩窩頭、蘋果、胡蘿卜、竹筍和竹葉，酌情選用已從圈養大熊貓各類食物中測出的典型香氣成分物質［9-15］，并達到我國人用食品安全國家標準——《食品添加劑使用標準》（GB 2760—2014）、《食品用香料通則》（GB 29938—2020）和2013 年12 月30 日農業部公告第2045 號《飼料添加劑品種目錄》要求。考慮到竹葉增食劑應有中等偏上的嗅感愉悅度、香氣持久性和口感甜度，也可從上述國家標準和要求中適當選用其他香料與甜味物質。

1.3 研制技術路線

竹葉增食劑的研發經多次的配方設計、模擬調制、工藝流程改進、使用方法完善，終獲較好的飼喂效果，具體研制技術路線如圖1 所示。

圖1 圈養小熊貓竹葉增食劑的研制技術路線Figure 1 The technical route of the development of the bamboo leaf intake enhancer for captive red pandas

1.4 食品級單體呈香物質的初步篩選

基于圈養小熊貓所食窩窩頭、蘋果、胡蘿卜、竹筍和竹葉的氣味特點，創擬竹葉增食劑的整體氣味指標參數和主要香氣指標參數。按照上述原料選用原則，根據目標參數和香原料的主要香氣和味道特征，初步篩選出擬用的66 種食品級單體呈香物質（表1）。由表1 可知，青香相關的單體呈香物質有22 種，甜氣有23 種，油脂（脂肪）氣有19 種，奶香有17 種，葉香（青葉香）有2 種，草香（青草香）有2 種，木質氣（木香）有10 種，青蘋果氣有2 種。某種單體呈香物質可呈現多種香氣，取決于嗅感閾值、相對濃度、溶劑、其他相生相克的呈香物質濃度等。

表1 圈養小熊貓竹葉增食劑的擬用單體呈香物質Table 1 The monomer aromatic substances maybe selectively used in the bamboo leaf intake enhancer for captive red pandas

（續表1）

1.5 風味特點

香氣特點：7 名專業人員分別對蘸有適量竹葉增食劑液體的專用紙條進行單獨嗅感盲評，分辨出竹葉增食劑的整體氣味指標、主要香氣種類及其相對強弱。氣味相對強弱采用10 分定義的標度方法計分，具體方法參照相關文獻［15］。每個評分指標的最終得分為去掉1 個最高評分和1 個最低評分后的算術平均數（n ＝5）。整體氣味指標和主要香氣指標的品評平均得分分別如圖2、圖3 所示。

圖2 圈養小熊貓竹葉增食劑的嗅感品評整體氣味指標平均得分Figure 2 The average scores of overall odor indexes by olfactory evaluations of the bamboo leaf intake enhancer for captive red pandas

從圖2 可見，竹葉增食劑具有揮發屬性，且香氣強度較好，愉悅度和透發性中等偏上。從圖3 可見，竹葉增食劑的青香明顯，并有輕微的甜氣，微微的油脂氣、奶香、葉香、草香和木質氣，表明竹葉增食劑的香氣是以青香和甜氣為主的多種復合型香氣，可從表1 的單體呈香物質中查到圖3 中主要香氣指標的相應支撐物質，說明專業人員的嗅感品評結果是有物質依據的，與配方相符。

圖3 圈養小熊貓竹葉增食劑的嗅感品評主要香氣指標平均得分Figure 3 The average scores of main aroma indexes by olfactory evaluations of the bamboo leaf intake enhancer for captive red pandas

味道特點：經6 位專業人員的口感品嘗，竹葉增食劑的甜味突出，有奶味和青香味，但無苦澀味。

2 飼喂試驗

2.1 受試小熊貓與飼養圈舍

受試小熊貓1—10 歲，共23 只（8 只雌性、15 只雄性），分群混養于中國大熊貓保護研究中心都江堰基地林澤園，臨床健康狀況良好，基本信息見表2。受試小熊貓的飼養圈舍原本為飼養大熊貓所建，由內舍和外圈組成，內舍有一人工可控的出入口與外圈相通，圈舍所處的自然環境條件、內舍和外圈里面的設施條件參考有關文獻設置［20］，具有自由隨意活動的適宜面積和空間，但不同圈舍所在的地勢和所養的動物只數有所差異。

表2 受試小熊貓和飼喂試驗的一些相關信息Table 2 Some information about tested red pandas and their feeding trials

2.2 供試竹種

試驗共用2 個竹種：①八月竹Chimonobambusa szechuanensis（Rendle）P.C.Keng，產于四川省汶川縣三江鎮，竹齡2 年，在2022 年4 月下旬、5 月底至6月初的試驗期間使用；②刺黑竹（當地俗稱牛尾竹）Chimonobambusa purpurea J.R.Xue ＆ T.P.Yi，產于四川省崇州市文井江鎮，竹齡3 年，在2022 年6 月下旬的試驗期間使用。上述2 個供試竹種均為人工栽培，并經專家鑒定確認，且屬圈養大熊貓和小熊貓的常喂竹種。

2.3 飼喂試驗方法（自由選擇攝食試驗法）

從購回的同捆竹子（包括稈、枝、葉，下同）中挑選出本次試驗用竹，再隨機分成竹子根數相同、竹稈粗細和枝葉數量大致相近的對照組和試驗組，稱重。試驗組的竹稈基部貼口序紙作為標記，向試驗組的竹葉霧化噴施竹葉增食劑，而對照組的竹稈不貼口序紙，也不噴施竹葉增食劑。然后將對照組和試驗組的竹子擺放在內舍和（或）外圈里面常放食物的地方，每處均放試驗組和對照組的竹子各3 根，兩組竹子相鄰，打開內舍與外圈之間的推拉門，小熊貓可隨意進出并自由選擇內舍和外圈的對照組竹葉或（和）試驗組竹葉攝食。若單獨在內舍進行午餐時段測試時才關閉內舍與外圈之間的出入口，其他時段均打開出入口。每天的飼喂有3 次，早飼、午飼和晚飼。測試時段結束后從圈舍中取出對照組和試驗組的竹子，觀察竹葉攝食情況，并對剩余的竹子稱重。各圈舍飼養的小熊貓只數、試驗日期和天數、內舍和外圈擺放對照組和試驗組竹子的處數如表2 所示。下一次飼喂竹子時對照組和試驗組竹子要相互交換擺放的位置，以消除竹子的擺放位置對小熊貓攝食對照組和試驗組竹葉數量的影響。除試驗組竹子要噴竹葉誘食劑外，窩窩頭、蘋果、胡蘿卜、竹筍的飼喂時間、次數、地點、數量等飼養管理工作流程均與往常相同。試驗期間每天擺放和取出竹子的大致時間如表3 所示。

表3 試驗期間每天擺放和取出試竹的大致時間Table 3 Approximate time of placing and removing the tested bamboos everyday during trial periods

2.4 數據處理與統計分析

試驗組或對照組竹葉的攝食量＝試驗組或對照組竹子的投放重量-食后竹子的剩余重量；平均每只受試小熊貓試驗組或對照組竹葉的攝食量＝試驗組或對照組竹葉的攝食量／試驗圈舍的受試小熊貓只數；平均每次試驗每只受試小熊貓試驗組或對照組竹葉的攝食量（受試小熊貓攝食竹葉量的均值）＝每次試驗的平均每只受試小熊貓試驗組或對照組的竹葉攝食量之和／試驗次數；試驗組竹葉的增食量＝試驗組竹葉的攝食量-對照組竹葉的攝食量；試驗組的竹葉增食率＝試驗組竹葉的增食量／對照組竹葉的攝食量× 100%。試驗組和對照組食后竹子的剩余重量均不包含竹子在攝食期間自然蒸發的粗水分重量。所得數據通過GranphPad Prism 8.0.2 軟件進行配對t 檢驗。

2.5 結果及分析

自由選擇攝食行為觀察：對受試小熊貓在飼后不久自由選擇攝食情況進行隨機、短時觀察，結果匯總于表4。從表4 可見，試驗共觀察了8d，總計14次。在不同時間，早飼后觀察了3 次，午飼后觀察了2次，晚飼后觀察了9 次；在不同編號的圈舍（不同地勢、不同朝向，養有不同性別和年齡的受試小熊貓），L - 01 號圈觀察了1 次，L - 03 號圈觀察了11次，L-04 號圈觀察了2 次；在不同的放竹地點（不同的面積、空間、空氣流通度、光照強度等），內舍觀察了5 次，外圈觀察了9 次；對不同的供試竹種（不同竹種的竹葉形狀、大小和厚薄不同，氣味［13］和味道有所差異），八月竹觀察了11 次，刺黑竹觀察了3次。僅有1 只受試小熊貓在2022 年5 月29 日L-03號外圈早飼后在食對照組竹葉，可能因饑不擇食所致。除此之外，其他38 只次都在食試驗組竹葉，占比97.44%（38 只次/39 只次）；而攝食對照組竹葉的只次占比僅為2.56%，兩組間差異極顯著（n ＝14，P ＜0.0001），說明受試小熊貓優先選擇試驗組的竹葉攝食具有一定的普遍性。試驗組的竹葉比對照組的竹葉更能吸引受試小熊貓去攝食，即試驗組竹葉因為噴有竹葉增食劑而增強了試驗組竹葉的氣味強度，使之更具誘食性，同時說明竹葉增食劑的氣味類型是圈養小熊貓熟悉和喜歡的食物氣味類型。

表4 受試小熊貓飼后不久自由選擇攝食的短時觀察結果Table 4 Short- time observation results of free choice ingestions of captive red pandas soon after feeding

竹葉攝食量：竹葉攝食量是衡量竹葉增食劑飼喂效果好與不好的關鍵指標。通過飼喂試驗所得數據及其統計分析詳見表5。由表5 可知：早餐段（早飼后至午飼前）的氣溫通常逐漸上升至高點，平均每次測試每只受試小熊貓攝食試驗組竹葉的數量比對照組竹葉多46.53g，兩組之間的竹葉攝食量差異顯著（n ＝6，P ＝0.0189），試驗組竹葉的增食率為94.37%。午餐段（午飼后至晚飼前）常為全天氣溫最高的時段，平均每次測試每只受試小熊貓攝食試驗組竹葉的數量比對照組竹葉多43.03g，兩組之間的竹葉攝食量差異顯著（n ＝7，P ＝0.0222），試驗組竹葉的增食率為73.76%。早餐延長段（早飼后至晚飼前）的氣溫通常逐漸上升至高溫區隨后逐漸下降，平均每次測試每只受試小熊貓攝食試驗組竹葉的數量比對照組竹葉多51.32g，兩組之間的竹葉攝食量差異極顯著（n ＝14，P ＝0.0003），試驗組竹葉的增食率為55.96%。晚餐段（晚飼后至次日早飼前）的氣溫變化通常呈V 字形，用八月竹試驗，平均每次測試每只受試小熊貓攝食試驗組竹葉的數量比對照組竹葉多98.54g，兩組之間的竹葉攝食量差異極顯著（n ＝24，P ＜0.0001），試驗組竹葉的增食率為79.10%。為了驗證竹葉增食劑是否在其他竹種上也有明顯的使用效果，在這個時段又用刺黑竹進行了試驗，平均每次測試每只受試小熊貓攝食試驗組竹葉的數量比對照組竹葉多55.56g，兩組之間的竹葉攝食量差異極顯著（n ＝6，P ＝0.0063），試驗組竹葉的增食率為54.80%。全天段（早飼后至次日早飼前），本時段的氣溫變化通常呈變形的N 字形，因氣溫較高原因，未在外圈試驗，平均每次測試每只受試小熊貓攝食試驗組竹葉的數量比對照組竹葉多67.50g，兩組之間的竹葉攝食量差異顯著（n ＝5，P ＝0.0162），試驗組竹葉的增食率為58.69%。受試小熊貓在不同測試時段對試驗組竹葉和對照組竹葉的平均攝食量、試驗組竹葉的增食量和增食率有所不同，可能的主要影響因素有：①攝食節律和其他食物飼喂數量。每天的攝食節律和每次飼喂窩窩頭、蘋果、胡蘿卜、竹筍的數量多少。②環境氣溫。因竹葉增食劑有揮發性，故環境溫度越高，噴了竹葉增食劑后的試驗組竹葉的香氣散失越快，誘食效果衰減速度就會越快。③放置時間。試驗組竹葉在內舍和外圈放置時間越長，其香氣散失就會越多。④投喂竹葉的數量。當受試小熊貓食完試驗組竹葉后，也會選擇對照組的竹葉攝食，導致試驗組竹葉攝食量和對照組竹葉攝食量的差距縮小。⑤竹種的差異。不同竹種的竹葉有著不同的風味濃度和類型［13］，或多或少會影響竹葉增食劑的使用效果。

表5 圈養小熊貓攝食試驗組竹葉和對照組竹葉的重量差異與統計分析Table 5 Weight differences and statistical analyses between test and control bamboo leavesingested by captive red pandas

綜上，霧化噴施竹葉增食劑的試驗組竹葉無論是早飼、午飼還是晚飼，無論是放在內舍還是外圈，無論放置時間是長還是短，無論是八月竹還是刺黑竹，無論是性別還是年齡，無論是大群飼養還是小群飼養，都能提高受試小熊貓對竹葉的攝食量，平均每次測試每只受試小熊貓的增食量為43.03—98.54g，增食率為54.80%—94.37%，說明竹葉增食劑都能夠促進受試小熊貓攝食，具有顯著的增食效果。

竹葉再利用的試驗：竹葉再利用是指內舍里上一次飼喂的對照組竹子在下一次飼喂時竹子的葉片依然舒展，顏色仍然為綠色，經霧化噴施竹葉增食劑后作為本內舍的試驗組竹葉。本試驗于2022 年5月29 日和6 月2 日的晚餐段在L - 03 號圈、L - 04號圈和L-05 號圈的內舍進行，因氣溫較高已造成竹葉部分失水，但失水情況并不嚴重，未在外圈試驗，只在內舍用八月竹試驗了5 次，受試小熊貓26只次，平均每次測試每只受試小熊貓攝食對照組竹葉的均值為63.33g，攝食試驗組竹葉的均值為90.83g，試驗組比對照組多食27.50g，兩組之間的竹葉攝食量差異顯著（n ＝5，SEM ＝8.08，P ＝0.0272），試驗組竹葉的增食率為43.42%。雖然試驗組的竹葉增食量和增食率均不及表5 中的高，但可提高受試小熊貓對本應廢棄的竹葉的再利用，說明霧化噴施竹葉增食劑是圈養小熊貓對竹葉再利用的一項技術措施。

被食葉片的數量觀察：圈養小熊貓攝食精細，只食葉片，不食葉柄，更不食竹枝和竹稈。肉眼容易觀察到每根竹子的葉片被食情況，因為葉片被小熊貓攝食后留有葉柄和竹枝。經受試小熊貓自由選擇攝食后，試驗組竹子的葉片，有的基本食完，有的食了大部分，多數剩葉較少，個別的食過少許。而對照組竹子的葉片，有的未食，有的食過少許，多數剩葉較多，個別的少量剩余。試驗結果表明，噴有竹葉增食劑的試驗組竹葉被食片數明顯多于對照組，這也佐證了上述竹葉攝食量的測試結果。

受試小熊貓食入竹葉增食劑后的臨床健康狀況觀察：在飼喂試驗期間和期后，每天對受試小熊貓的精神狀況、行為姿勢、飲食排泄、活動規律等情況進行觀察。從2022 年4 月20 日試驗開始，到8 月12日為止，每只受試小熊貓的臨床健康狀況都很正常，無一生病治療，而且如數健在。養于L-04 號圈，呼名“辰月”的受試小熊貓在飼喂試驗期間正常發情、交配和妊娠，在飼喂試驗期后的7 月16 日正常分娩2仔。說明竹葉增食劑不影響受試小熊貓的臨床健康狀況和自然繁殖。

3 討論

從上述測試結果可知，竹葉增食劑可增強竹葉對受試小熊貓的誘食性，提高受試小熊貓對竹葉的攝食量。其誘食機制可能如下：竹葉增食劑霧化噴施于竹葉后，增強了竹葉的香氣強度，也增強了來自竹葉的香氣的擴散性，使受試小熊貓不但在較遠處就能感知，而且精準識別香氣的發源地；竹葉增食劑的香氣與新鮮竹葉的本身氣味相互融合后，改善了竹葉的香氣類型，組建后的復合型香氣為受試小熊貓所熟悉，并認知安全和可食，激發攝食欲望，樂意去攝食，導致受試小熊貓優先選擇噴有竹葉增食劑的試驗組竹葉攝食，而不優先選擇位置相鄰的對照組竹葉攝食。其增食機制可能如下：竹葉增食劑有突出的甜味，在霧化噴施之后可以中和或掩蓋竹葉的不良味道，減少不良味道對于攝食量的負面影響；小熊貓具有完整的甜味受體基因［7，8］，對食物的甜味敏感，圈養小熊貓喜食窩窩頭、蘋果和胡蘿卜，這些食物均有明顯的甜味，也是圈養小熊貓對有甜味的食物感興趣的例證；竹葉攝食量的多少主要取決于竹葉的味道是否適合小熊貓的味覺喜好，竹葉在霧化噴施竹葉增食劑之后滿足了受試小熊貓的味覺偏好，導致受試小熊貓自由選擇噴有竹葉增食劑的試驗組竹葉較多攝食，而自由選擇位置相鄰的對照組竹葉較少攝食，這可能也是試驗組的竹葉增食量和增食率大幅提升的理由。本文通過圈養小熊貓食物額外補充香氣和味道的試驗方法，也證實了食物的氣味和味道是小熊貓在攝食過程中最重要的兩種感覺與認知，分別決定小熊貓是否攝食和攝食量的多少，屬小熊貓自主調控攝食的主要食物因子。

鑒于大熊貓與小熊貓食性相同，均食相同竹種的竹葉和竹筍，而小熊貓體型小、食量小、易飼養、成本較低、性格溫順、對人的傷害性較低，在探究攝食機理、食量調控措施等方面可作為大熊貓的動物模型進行先行試驗。

4 結論

本研究在國內外率先自主研制出的竹葉增食劑，經專業人員的嗅感和口感品評，具有揮發屬性，香氣強度較好，愉悅度和透發性中等偏上，青香明顯，并有輕微的甜氣，甜的味道突出。通過圈養小熊貓自由選擇攝食試驗組竹葉（霧化噴施竹葉增食劑）和對照組竹葉（不噴竹葉增食劑）的飼喂效果測試。結果表明：①受試小熊貓優先選擇試驗組的竹葉攝食，竹葉增食劑對小熊貓具有誘食功能。②在一天里的不同時段，受試小熊貓攝食試驗組竹葉比對照組竹葉的平均增食量和增食率分別為43. 03—98.54g和54.80%—94.37%。對圈養小熊貓而言，竹葉增食劑能夠增強竹葉的誘食性，且竹葉增食效果顯著。

本文初步探討了小熊貓攝食竹葉的風味機理，竹葉增食劑為提高圈養小熊貓對竹葉的食用率和降低竹葉的廢棄率提供了一項技術措施，具有實際應用潛質，但仍有待進一步探究不同類型的氣味或（和）味道及其不同補加劑量對圈養小熊貓攝食竹葉行為和數量的影響。

（致謝：承蒙成都大帝漢克生物科技有限公司喻麟董事長和李小兵總經理的大力支持，竹葉增食劑的研制工作得以順利實施，西華大學食品與生物工程學院的包清彬教授、成都大帝漢克生物科技有限公司的李松柏高級工程師、鄧虹高級工程師、武偉工程師參加了風味品評，吳勁旭老師核定了供試竹種的學名，四川省自然資源科學研究院的張玉婷同事在數據統計分析方面提供了幫助，在此一并深表謝意！）