神經損傷標志物在兒童結核性腦膜炎中的動態變化特征及意義

石家云 王曼知 周海依 張小佛 危松青

結核性腦膜炎(tuberculous meningitis，TBM)是一種常見的肺外結核，可導致兒童高病亡率和致殘率，是肺外結核中病情最重、危害最大、破壞性最強的類型，嚴重威脅兒童生命健康[1]。近年來，TBM的發病率也明顯增加，尤其在發展中國家，兒童結核病患者中TBM的發病率高達20%[2]。盡管規范和足量的化療有助于控制病情，但至今TBM病亡率仍高達30%，且幸存者中約53.9%留有永久性神經系統后遺癥[3]。早期診斷并盡早開始治療對于TBM的治愈至關重要。然而，目前TBM早期精準診斷的分子標志物仍極為缺乏。

近年研究發現，神經組織標志物神經元特異性烯醇化酶(neuron specific enolase，NSE)、S100B、膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)在感染、創傷、中風、出血、神經退行性疾病等多種中樞神經系統疾病中可作為疾病診斷和預后的生物標志物，其血清及腦脊液濃度與患者腦損傷的程度及患者的不良預后呈明顯正相關，且與疾病的病理改變一致[4-6]。在中樞神經系統感染性疾病的研究中，這些分子標志物目前主要應用于病毒性腦炎和化膿性腦膜炎，而其在TBM中的潛在應用價值尚缺乏循證醫學證據。因此，筆者探討NSE、S100B、GFAP在結核性腦膜炎患兒血清及腦脊液的變化及對患兒預后的影響，為臨床早期診斷和評估TBM的腦損傷嚴重程度及預后提供新的量化指標。

對象和方法

一、研究對象遴選

1.研究對象：采用前瞻性研究方法，連續納入2018年1月1日至2021年12月31日于南華大學附屬長沙中心醫院兒童結核科收治的72例TBM患兒作為TBM組。搜集同期住院，診斷為肺結核同時排除TBM的患兒20例作為肺結核組。對照組為入院時反復高熱，伴或不伴頭痛和嘔吐，精神欠佳等疑似腦膜炎癥狀患兒。所有研究對象均進行血液、腦脊液、頭顱CT掃描和MRI檢查。本研究獲得南華大學附屬長沙中心醫院醫學倫理委員會的批準(2019-S0129)，獲得所有研究對象父母或其他監護人的知情同意。

2.納入標準：(1)TBM組：①符合TBM診斷標準[7]；②臨床資料完整，依從性好；③經知情同意，并簽署知情同意書。(2)肺結核組：①符合肺結核診斷[8]；②臨床資料完整。

3.排除標準：(1)TBM組：①復治的TBM患者；②入院前已行抗結核治療；③無法排除其他原因的中樞神經系統疾病；④耐藥TBM。(2)肺結核組：①合并TBM患者；②入院前已行抗結核治療。

二、資料收集

通過查閱病歷資料，收集研究對象和對照組的臨床信息，包括性別、年齡、治療、預后；對照組入院后48 h內的血清及腦脊液NSE、S100B、GFAP濃度值；TBM組入院后48 h內及治療后1、2、3周的血清及腦脊液NSE、S100B、GFAP濃度值。

三、治療與預后

1.TBM組：參照世界衛生組織(World Health Organization，WHO)指南推薦[9]，采用標準抗結核治療方案，即：2H-R-Z-E/10H-R(H：異煙肼，10～20 mg·kg-1·d-1， 最大劑量500 mg；R：利福平，10～20 mg·kg-1·d-1，最大劑量600 mg；Z：吡嗪酰胺，30～35 mg·kg-1·d-1，最大劑量 2000 mg；E：乙胺丁醇，15～20 mg·kg-1·d-1，最大劑量1000 mg；異煙肼、利福平、乙胺丁醇給藥頻率均為1次/d；吡嗪酰胺給藥頻率為2次/d)。同時，給予糖皮質激素輔助治療(2 mg/kg，最大劑量60 mg，6～8周逐漸減停)。個別患兒因病情嚴重、合并感染、繼發肝功能受損等，加用利奈唑胺或氟喹諾酮類藥物。正規抗結核治療6個月后，急性癥狀及體征減少或消失，處于疾病后遺癥期，國內外學者常以6個月為時間節點研究及判斷預后[10-11]。治療6個月后，門診或電話隨訪患兒，參照Thee等[11]的標準，分為完全康復組(無神經系統后遺癥)和預后不良組(出現以下任一項：肢體癱瘓，痙攣，顱神經麻痹，癲癇，發育遲緩，慢性腦積水，視力、聽力及語言障礙，植物人，死亡)。

2. 肺結核組：兒童涂片陰性藥物敏感肺結核患者采用2H-R-Z/4H-R治療方案，涂片陽性、肺廣泛實變者采用2H-R-Z-E/4H-R治療方案[12]，即強化期常規異煙肼(10 mg·kg-1·d-1，最大劑量300 mg，1次/d)、利福平(15 mg·kg-1·d-1，最大劑量600 mg，1次/d)、吡嗪酰胺(35 mg·kg-1·d-1，2次/d)和(或)乙胺丁醇(20 mg·kg-1·d-1，1次/d)，治療2個月，鞏固期采用異煙肼和利福平治療4個月。

四、實驗室檢測

TBM組于入院48 h內及治療后1、2、3周收集4 ml外周靜脈血及2 ml腦脊液。肺結核組于入院48 h內收集4 ml外周靜脈血及2 ml腦脊液。收集的血液標本置于乙二胺四乙酸二鈉抗凝管中，4 ℃，3000 r/min(離心半徑10 cm)，離心10 min，取上清液置于-80 ℃保存備用；腦脊液標本標記好置于-80 ℃保存備用。

采用酶聯免疫吸附試驗測定TBM組及肺結核組入院48 h內血清及腦脊液中NSE、S100B、GFAP的含量；測定TBM組治療后1、2、3周NSE、S100B、GFAP的動態變化情況。酶標檢測儀購自美國BioTeK公司(型號Epoch)；檢測試劑均購自美國R&D公司，NSE、S100B、GFAP檢測試劑貨號分別為DY2062、DY1820、DY2594，批次分別為P184753、P186491、P185817。

五、統計學處理

采用SPSS 25.0軟件進行分析，偏態分布的計量資料用“中位數(四分位數)[M(Q1，Q3)]”描述，組間差異的比較采用秩和檢驗。采用受試者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲線及曲線下面積(area under the curve，AUC)分析TBM患兒入院時腦脊液NSE、S100B、GFAP水平，預測其不良預后的閾值、敏感度及特異度。

結 果

一、基本情況

TBM組72例，其中，男38例(52.8%)，女34例(47.2%)；年齡[M(Q1，Q3)]為59(1，168)月；年齡分組參照Rohlwink 等[13]標準：0～2歲35例(48.6%)，3～5歲7例(9.7%)，>5歲30例(41.7%)。肺結核組20例，其中，男12例(60.0%)，女8例(40.0%)；年齡[M(Q1，Q3)]為73(4，168)月； 0～2歲8例(40.0%)，3～5歲3例(15.0%)，>5歲9例(45.0%)。TBM組與肺結核組年齡及性別分布差異無統計學意義(Z值分別為-1.243和-0.860，P值分別為0.217和0.390)。

TBM組中47例(65.3%)完全康復，25例(34.7%)預后不良(肢體癱瘓6例，繼發癲癇8例，慢性腦積水2例，動眼神經麻痹2例，語言障礙1例，死亡6例)。

二、神經組織標志物水平比較

1.治療前情況比較：NSE、S100B、GFAP在TBM組及肺結核組入院時血清及腦脊液的表達比較顯示，與肺結核組相比，TBM組血清及腦脊液的NSE、S100B、GFAP表達均明顯升高，差異均有統計學意義(表1)。與完全康復組比較，預后不良組血清NSE、S100B、GFAP表達差異無統計學意義(Z值分別為-0.604、-0.728、-1.049，P值分別為0.513、0.467、0.071)；而腦脊液NSE、S100B、GFAP表達明顯升高，差異均有統計學意義(Z值分別為-4.855、-3.212、-6.334，P值分別為0.000、0.001、0.000)。

表1 結核性腦膜炎患兒與肺結核患兒治療前神經組織標志物水平的比較 [μg/L,M(Q1，Q3)]

2.治療后動態變化情況：比較NSE、S100B、GFAP在完全康復組和預后不良組治療后1、2、3周的動態變化。(1)經治療后1周，完全康復組和預后不良組血清NSE、S100B、GFAP降至基本正常；治療后1、2、3周NSE、S100B、GFAP組間差異無統計學意義。與完全康復組比較，預后不良組治療后1、2、3周血清NSE、S100B、GFAP表達差異無統計學意義(表2)。(2)完全康復組與預后不良組腦脊液NSE、S100B、GFAP表達在治療后1、2、3周比較，組間差異均有統計學意義。與完全康復組比較，預后不良組腦脊液NSE、S100B、GFAP在治療后1、2、3周表達明顯升高，差異均有統計學意義(表3)。

表2 血清中神經組織標志物水平在不同治療預后結核性腦膜炎患兒中的比較 [μg/L，M(Q1，Q3)]

表3 腦脊液中神經組織標志物水平在不同治療預后結核性腦膜炎患兒中的比較 [μg/L，M(Q1，Q3)]

三、神經組織標志物對TBM預后的預測價值

ROC曲線分析顯示，TBM患兒入院時腦脊液NSE、S100B、GFAP預測TBM預后不良的AUC分別為0.753(95%CI：0.637～0.868，P<0.01)、0.879(95%CI：0.759～0.963，P<0.01)、0.803(95%CI：0.702～0.904，P<0.01)。依據ROC曲線，分別以其最大約登指數確定3種生物標志物的檢測閾值，可知NSE水平為51.92 μg/L時，預測TBM預后不良的敏感度為76.24%、特異度為78.95%。S100B水平為2.75 μg/L時，預測TBM預后不良的敏感度為85.7%、特異度為96.5%。GFAP水平為77.54 μg/L時，預測TBM預后不良的敏感度為76.43%、特異度為70.97%(圖1)。

圖1 腦脊液神經組織標志物預測結核性腦膜炎患兒預后不良的受試者工作特征曲線

討 論

盡管近年來兒童TBM診治取得一定進展，但由于兒童TBM早期癥狀錯綜復雜，缺乏敏感度高、特異度好的精準分子生物學檢測手段，早期診斷困難，病情易被延誤，以致錯失最佳治療時機；雖經積極抗結核和抗炎治療，但仍有較高病亡率或遺留神經系統后遺癥[3]。因此，早期診斷、盡早進行臨床干預、及時恰當評估預后是降低兒童TBM病亡率和致殘率的關鍵。

近年來，越來越多的學者關注神經組織損傷標志物，它們可以反映神經細胞的損傷程度，將臨床和影像學資料難以量化的損傷進行定量分析，能更早提示神經損傷。NSE是1965年首次被發現于腦組織中而不存在于非神經組織中的酸性可溶性蛋白，是中樞神經元損傷的敏感和特異標志[14]。S100B被認為是神經膠質細胞特異性蛋白，在哺乳動物分布具有特異性，主要分布于神經膠質細胞及施萬細胞，也可反映中樞神經系統損傷的程度[15]。GFAP是中樞神經系統中獨有的細胞骨架蛋白，是星形膠質細胞的主要成分。星形膠質細胞在腦的發育和正常功能中起到重要作用[16]。DeKosky等[17]研究發現，GFAP在新型冠狀病毒肺炎患者腦損傷檢測中有明確的預測價值。中樞神經系統損傷、創傷或炎癥后，神經元、神經膠質細胞及星形膠質細胞損傷和死亡增多，NSE、S100B、GFAP從受損和死亡的細胞中溢出，進入細胞間隙，可通過血腦屏障進入血液中，使腦脊液及血液中NSE、S100B、GFAP表達增加，可作為定性和定量評價腦損傷的特異指標。

本研究尚存在一定局限性：(1)樣本量小，有少部分臨床數據缺失(死亡病例后期血清及腦脊液缺失)；(2)無其他顱內感染性疾病患者的橫向對比，可能對分析結果造成一定偏倚。因此，NSE、S100B、GFAP對TBM診斷及預后評估價值尚需進行大樣本和多中心的研究。

綜上，本次研究結果發現，肺結核患兒血清和腦脊液NSE、S100B、GFAP水平增加時，可疑診TBM，應積極完善頭顱影像學及腦脊液結核分枝桿菌病原學檢查，以盡早進行干預治療。TBM患兒入院時NSE≥51.92 μg/L、S100B≥2.75 μg/L或GFAP≥77.54 μg/L，且經治療腦脊液NSE、S100B、GFAP水平下降緩慢時，提示預后不良的可能，應盡早進行臨床干預，降低病亡率和致殘率。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻石家云：醞釀和設計實驗、分析/解釋數據、起草文章、對文章的知識性內容作批評性審閱；王曼知：獲取研究經費、指導；周海依和張小佛：對文章的知識性內容作批評性審閱、支持性貢獻；危松青：醞釀和設計實驗、采集數據、指導、支持性貢獻