知母水提取物對人胃癌細胞HGC-27的抑制作用

朱建新， 顏 娟， 趙虹琇， 姜愛雯， 張 藝

(河北北方學院附屬第一醫(yī)院，河北 張家口 075000)

胃癌是最常見的消化道惡性腫瘤，由于胃癌細胞具有增殖迅速，侵襲能力強，易發(fā)生早期轉(zhuǎn)移和對化療藥物具有耐藥性等原因，使得其致死率高居第二位[1]。目前，胃癌的治療主要采取以手術(shù)為主化療為輔的方案，盡管治療技術(shù)不斷改進，但仍有部分胃癌患者就診時已經(jīng)出現(xiàn)了惡性轉(zhuǎn)移，治療效果不佳[2-3]。所以，除了加強早期診斷之外，探尋一種行之有效的天然抗腫瘤的藥物具有重要的現(xiàn)實意義。

知母為百合科植物知母的干燥根莖，性苦、甘、寒，歸胃、肺經(jīng)，是常用的清熱瀉火類藥物，具有降低血脂、抗血栓形成、預(yù)防老年癡呆、保護腦損傷及免疫調(diào)節(jié)等作用[4]。除此之外，知母還具有抑制腫瘤增殖和侵襲的作用。研究發(fā)現(xiàn)，知母皂苷AⅢ可以通過抑制COX-2表達，進而降低NF-κB信號通路蛋白表達來抑制黑色素瘤B16-F10細胞系與WM-115細胞系遷移能力及裸鼠成瘤能力[5]。測序分析及生物信息學技術(shù)指出知母水提取物可以通過調(diào)節(jié)胃癌細胞系SGC7901中miR-26b-5p、miR-16-5p、miR-15b-5p、miR-20-5P表達，進而調(diào)控下游靶基因群來抑制胃癌細胞的增殖能力[6]。本實驗選取胃癌細胞系HGC-27為對象，深入研究知母對胃癌的作用機制，為其臨床應(yīng)用提供基礎(chǔ)實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 細胞 人胃癌細胞系HGC-27購自中國科學院上海細胞生物學研究所。

1.2 試劑與藥物 知母顆粒劑(批號1602043)購自江陰天江藥業(yè)有限公司。RPMI1640、胎牛血清購自美國Gibco公司；青鏈霉素、胰蛋白酶購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；兔抗人MMP-9(貨號RLT1892)、鼠抗人β-actin(貨號RLM3028)、鼠抗人MMP-2(貨號RLM3667)、兔抗人Slug(貨號RLM3371)、兔抗人E-cadherin(貨號RLM3353)、兔抗人E-Selectin(貨號RLT5745)購自蘇州睿瀛生物技術(shù)有限公司；Transwell小室購自美國CoStar公司；纖維粘連蛋白(貨號356234)購買自美國BD公司；牛血清白蛋白封閉液(貨號SW3015)購自北京索萊寶科技有限公司。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng) HGC-27細胞于含10% FBS的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞融合率至90%～95%時進行傳代。

2.2 知母水提取物制備與細胞分組 使用RPMI1640培養(yǎng)基溶解知母顆粒劑，在無菌條件下制備成終質(zhì)量濃度為1、5、10、15 mg/mL的藥液，-20 ℃儲存?zhèn)溆谩ⅰ?.1”項下細胞分為對照組，知母水提取物1、5、10 mg/mL組。

2.3 MTT法檢測細胞增殖率 取處于對數(shù)生長期的HGC-27細胞，經(jīng)細胞計數(shù)后種于96孔板中，每孔約1×105個，培養(yǎng)12 h后分別加入1、5、10、15 mg/mL知母水提取物，繼續(xù)培養(yǎng)36 h，每孔加入15 μL 1 mg/mL MTT溶液，37 ℃孵育4 h，離心，倒去培養(yǎng)液并加入100 μL DMSO，10 min后使用酶標儀檢測光密度(OD)值，計算細胞增殖率。

2.4 克隆形成實驗檢測細胞存活情況 用知母水提取物將HGC-27細胞制成單細胞懸液，經(jīng)計數(shù)后，按照每孔500個的密度接種于6孔板中，加入含10% FBS的RPMI1640培養(yǎng)基5 mL，培養(yǎng)7 d。至長出肉眼可見細胞團后，PBS洗去培養(yǎng)液，4%多聚甲醛固定10 min，染色，計算細胞團數(shù)(細胞大于50)。

2.5 細胞同質(zhì)粘附實驗檢測細胞粘附能力 用知母水提取物處理36 h后，將HGC-27細胞制成密度為1×105/mL的細胞懸液，每孔200 μL，接種于48孔板，孵育1 h后PBS洗去未粘附細胞，計算同質(zhì)粘附細胞數(shù)，公式為同質(zhì)粘附細胞數(shù)=每孔加入總細胞數(shù)-洗去未粘附細胞數(shù)。

2.6 細胞異質(zhì)粘附實驗檢測細胞粘附能力 使用15 mg/L纖維粘連蛋白包被48孔板，置于無菌條件下吹干后，2%牛血清白蛋白封閉2 h，將各組細胞制成密度為1×105/mL的細胞懸液，每孔200 μL接種于48孔板，培養(yǎng)60 min后PBS洗去未粘附細胞，4%多聚甲醛固定10 min，計算異質(zhì)粘附細胞數(shù)。

2.7 細胞劃痕實驗檢測細胞遷移能力 將HGC-27細胞制成密度為5×105/mL的細胞懸液，每孔500 μL、接種24孔板中，待到細胞融合率達到95%～100%時，用20 μL槍頭筆直在孔板中央進行劃痕，PBS沖洗掉脫落細胞后，加入含1、5、10 mg/mL知母水提取物的無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后，拍照觀察。

2.8 Transwell小室法檢測細胞侵襲能力 將各組HGC-27細胞用含0、1、5、10 mg/mL知母水提取物的無血清培養(yǎng)液制成密度為5×106/mL的細胞懸液，將100 μL細胞懸液加進提前用纖維黏連蛋白包被的Transwell小室上室，下室加入含10% FBS 的RPMI1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后擦去上室上面未侵襲的細胞，多聚甲醛固定15 min，吉姆薩染色，拍照觀察。

2.9 Western blot法檢測細胞MMP-9、MMP-2、Slug、E-cadherin、E-Selectin蛋白表達 用知母水提取物處理HGC-27細胞48 h后，提取HGC-27細胞總蛋白，BCA法檢測各

組蛋白濃度。每孔15 μL蛋白上樣，10% SDS-PAGE凝膠電泳分離，半干轉(zhuǎn)至PVDF膜，室溫封閉1 h，加入MMP9(1∶500)、MMP2(1∶150)、Slug(1∶150)、E-cadherin(1∶100)、E-Selectin(1∶200)一抗，4 ℃孵育過夜，PBS清洗后，加入二抗孵育1 h，ECL發(fā)光顯色，通過成像儀自帶的軟件測量條帶的灰度值，以β-actin為內(nèi)參，計算目的蛋白的相對表達。

3 結(jié)果

3.1 知母水提取物對HGC-27細胞增殖能力的影響 與對照組比較，知母水提取物各劑量組細胞增殖率均降低(P<0.05)，并呈劑量依賴性，見圖1；知母水提取物各劑量組細胞克隆形成數(shù)均減少(P<0.05)，并呈劑量依賴性，見圖2、表1，提示知母水提取物能抑制HGC-27細胞增殖。

表1 知母水提取物對HGC-27細胞克隆形成能力的影響

3.2 知母水提取物對HGC-27細胞粘附能力的影響 與對照組比較，知母水提取物各劑量組細胞同、異質(zhì)粘附細胞數(shù)均降低(P<0.01)，并呈劑量依賴性，見圖3。

3.3 知母水提取物對HGC-27細胞遷移能力的影響 與對照組比較，知母水提取物各劑量組細胞劃痕面積均增加，并呈劑量依賴性，見圖4，提示知母水提取物能抑制HGC-27細胞遷移能力。

3.4 知母水提取物對HGC-27細胞侵襲能力的影響 與對照組比較，知母水提取物各劑量組HGC-27細胞侵襲能力均被抑制，見圖5。

3.5 知母水提取物對HGC-27細胞中MMP-9、MMP-2、Slug、E-cadherin、E-Selectin蛋白表達影響 與對照組比較，知母水提取物各劑量組細胞中MMP-9、MMP-2、Slug、E-Selectin蛋白表達降低(P<0.05)，E-cadherin蛋白表達升高(P<0.05)，并呈劑量依賴性，見圖6、表2。

4 討論

我國目前東西部醫(yī)療水平發(fā)展極不平衡，各級醫(yī)院對于胃癌的診治水平也不盡相同，許多患者在首診時已經(jīng)處于胃癌的晚期階段，即使進行手術(shù)切除或放化療，胃癌復發(fā)率、致死率很高，5年生存率低[7]。知母作為抗腫瘤藥物之一，近年來受到的關(guān)注也越來越多。

癌癥出現(xiàn)轉(zhuǎn)移的始動因素是癌細胞粘附能力的改變[8]。腫瘤細胞出現(xiàn)粘附能力改變后，原有的細胞連接被重新排列。本實驗中同質(zhì)細胞粘附能力是指胃癌HGC-27細胞之間粘附的能力，異質(zhì)細胞粘附能力是指胃癌HGC-27細胞與正常基底細胞之間的粘附能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過知母水提取物處理HGC-27細胞后，同質(zhì)細胞粘附能力增強，提示知母水提取物可以使HGC-27細胞相互連接更加緊密不易出現(xiàn)向淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象；異質(zhì)細胞粘附數(shù)減少，提示知母水提取物可以使HGC-27細胞與人正常基底面細胞結(jié)合能力下降，從而減低了胃癌HGC-27細胞轉(zhuǎn)移后定植在局部的可能性。說明知母水提取物可以在癌癥發(fā)生的第1個階段就通過抑制粘附能力來降低胃癌HGC-27細胞轉(zhuǎn)移的可能性。本實驗還發(fā)現(xiàn)，知母水提取物可以抑制HGC-27細胞的生長。研究發(fā)現(xiàn)，對移植人腦膠質(zhì)瘤U87MG細胞的裸鼠

表2 知母水提取物對HGC-27細胞MMP-9、MMP-2、Slug、E-cadherin、E-Selectin蛋白表達的影響

接種知母皂苷AⅢ后，瘤體生長處于抑制狀態(tài)，并呈劑量依賴性；同時，在體外使用知母皂苷AⅢ處理U87MG細胞后，作為粘附分子代表的β-catenin表達降低，人腦膠質(zhì)瘤U87MG細胞異質(zhì)粘附能力降低[9]，與本實驗結(jié)果一致。

腫瘤加強侵襲和遷移能力是癌癥發(fā)生的又一重要階段，通過釋放MMP-9、MMP-2蛋白致使癌細胞穿過基底膜繼而降解細胞外基質(zhì)向遠處組織或淋巴結(jié)進行轉(zhuǎn)移[10]。本實驗結(jié)果顯示，HGC-27細胞的遷移、侵襲能力可被知母水提取物抑制，并呈劑量依賴性，知母水提取物還可通過抑制MMP-9、MMP-2蛋白表達來調(diào)節(jié)HGC-27細胞的遷移、侵襲能力。本實驗通過對在上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化進程中的2個關(guān)鍵因子進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，知母水提取物可以抑制轉(zhuǎn)錄因子Slug及恢復E-cadherin蛋白表達，提示知母水提取物可能通過上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化進程中來抑制對HGC-27細胞的惡性進程[11]。另外，E-Selectin是調(diào)節(jié)異質(zhì)粘附能力的關(guān)鍵分子[12]，而知母水提取物可以促進E-Selectin蛋白表達，這與細胞異質(zhì)粘附實驗一致。

綜上所述，知母水提取物可能通過調(diào)節(jié)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化進程進而降低轉(zhuǎn)錄因子Slug與MMP-9、MMP-2、E-Selectin蛋白表達，升高E-cadherin蛋白表達，從而抑制HGC-27細胞的粘附、增殖、遷移和侵襲能力。