觀賞海棠種子內源激素動態(tài)變化與胚胎敗育關系

彭 琴，張往祥,2*

（1.南京林業(yè)大學林學院，江蘇 南京 210037；2.揚州小蘋果園藝有限公司，江蘇 揚州 225000）

0 引言

【研究意義】海棠（Crabapple）是薔薇科蘋果屬（Malus）中果徑較小（≤5 cm）的一類植物的總稱[1]。海棠喜溫暖濕潤、陽光充足的環(huán)境，其適應性較強，對環(huán)境要求不嚴，最適宜生長于排水良好的沙壤土，對鹽堿土的抗性較強[2]，可栽種于全國各地。海棠自漢代以來，具有2 000多年的栽培歷史，是重要的觀花觀葉觀果樹種[3]，素有“國艷”之譽，觀賞海棠不以果實產(chǎn)量為主要栽培目的，而是將葉、花、果實的觀賞價值與經(jīng)濟價值有機結合起來，有效增加園林樹種的多樣性和景觀持續(xù)性[4]，既能提供良好的生態(tài)效益又能產(chǎn)生較高的經(jīng)濟價值，因此培育優(yōu)良海棠品種是海棠園林應用的關鍵和基礎。雜交育種是林木種質創(chuàng)新的重要途徑，在果實的生長發(fā)育過程中，胚胎存在不同程度的敗育現(xiàn)象，其優(yōu)良特性難以從遺傳學角度得以保持，這種胚胎敗育特性嚴重阻礙了海棠雜交育種選優(yōu)的進程。分析海棠果實生長發(fā)育過程中種子內源激素變化規(guī)律與胚珠敗育情況，對其內源激素變化與胚胎敗育的相互關系、影響進行探討，對海棠果實生長調控、觀果品種的雜交選育、種子質量提高具有重要意義。【前人研究進展】在果樹遠緣雜交和不同倍性親本之間雜交的過程中，常因雜種胚早期敗育而難以形成有生命力的種子，使得常規(guī)雜交育種很難順利進行，有關胚胎敗育的內在機理及外部影響因素一直是國內外育種專家研究的熱點。內源激素（IAA、ABA等）[5-6]、解剖學分析（花器官結構[7-8]、胚胎結構[9]等）及基因調控[10-11]與胚胎敗育均有一定的關系。植物內源激素是植物自身產(chǎn)生微量可調節(jié)自身生長發(fā)育的有機物質，各類激素的生理功能多種多樣，既互相拮抗又互相協(xié)同，共同對植物生長發(fā)育調節(jié)起控制作用。關于內源激素與胚胎敗育的關系密切，Su等[12]對黃瓜單性結實研究發(fā)現(xiàn)，IAA 作為一種植物單性結實的誘導激素，對胚胎敗育也有一定的觸發(fā)作用，目前的研究報道主要集中在西瓜[13]、杧果[14]、荔枝[15]、棗[16]等果樹。閆旭宇等[17]在棗胚敗育分析中認為，棗胚發(fā)育后期種子空癟可能與激素IAA、GA3和ABA虧缺、激素Z的異常積累、尤其是Z/GA3異常升高有關。在對荔枝的胚胎發(fā)育研究中發(fā)現(xiàn)，發(fā)育正常胚胎中 IAA、GA3、CTK 的含量高而 ABA 的含量低[18]。近年來，學者在觀賞海棠研究中已表明內源激素對花芽分化、花粉發(fā)育有重要影響。【本研究切入點】目前對優(yōu)良觀賞海棠品種選育多集中于砧木選擇、種質資源利用、繁殖方式等研究上，而對海棠果實胚胎敗育分析研究鮮見。觀賞海棠是自由授粉植物，通常采用實生選種方式優(yōu)勢育種。紅珠寶（M.Red Jewel）與凱爾斯（M.Kelsey） 是觀賞海棠中重要的觀果品種，花期一致，果實果量大，但凱爾斯落果量大，種子敗育率高，無法保證種子的正常發(fā)育，影響了在生產(chǎn)上對其進行雜交育種選優(yōu)的進程。【擬解決的關鍵問題】本文分別以低敗育率的紅珠寶（M.Red Jewel）和高敗育率的凱爾斯（M.Kelsey）為試驗材料，對比不同敗育程度的觀賞海棠品種果實生長規(guī)律并挖掘其中影響胚珠發(fā)育的重要內源激素，為進一步探討觀賞海棠胚胎敗育原因奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗地位于江蘇省揚州市江都區(qū)仙女鎮(zhèn)國家海棠種質資源圃（E 119°55′，N 32°42′），屬北亞熱帶季風氣候，四季分明，年均降水量約為1 000 mm，無霜期長達320 d，年平均氣溫14.9 ℃左右。試驗地土壤質地為砂壤土，地勢平坦且立地條件一致，土層肥沃，灌排條件良好。

1.2 試驗方法

1.2.1 果實生長曲線的測定 試驗于2019年春季進行，以6年生低敗育率紅珠寶與高敗育率凱爾斯為試驗材料，2個品種各選取10株生長一致、健康的單株作為取材樣株，并隨機選擇花期一致的50個花序掛牌標記。于海棠末花期后（花柱授粉結束）、子房開始膨大時（2019年4月12日），采用游標卡尺測量橫縱經(jīng)（mm），前期每隔5 d測量，連續(xù)測量8次，后期每隔10 d測量1次，到果實不再膨大時停止測量，每個品種連續(xù)測量15次。

1.2.2 果實發(fā)育掛果率與敗育率的測定 紅珠寶與凱爾斯果實發(fā)育掛果率、敗育率的測定與果實果徑測量同期進行，前期每隔5 d采集拍攝，后期每隔15 d到25 d采集拍攝，各品種共連續(xù)測定12次。根據(jù)掛牌標記的50朵花序分別統(tǒng)計出花朵數(shù)與掛果數(shù)，計算掛果率。掛果率/%=坐果數(shù)/花朵數(shù)×100[19]。

觀察記錄各品種所有果實內部胚珠發(fā)育狀態(tài)。果實心室里的胚珠或胚完全消失或嚴重褐化、變黑、組織軟化、明顯萎縮皺縮、干癟壞死，即為敗育胚珠；胚珠或胚飽滿圓潤、濕脆、乳白色、內部透明晶亮、無褐化則為發(fā)育正常胚珠[20]，在生長一致的健康單株上每個海棠品種隨機選擇50個發(fā)育的果實，計算敗育率。敗育率/%=敗育胚珠數(shù)/胚珠數(shù)×100。

1.2.3 種子內源激素的測定 紅珠寶與凱爾斯種子內源激素的測定與果實敗育率的測定同期進行。分別從紅珠寶與凱爾斯果實敗育率的12個測定時期中選取7個時期取樣，分別為授粉后的第1、13、19、31、43、54、76 天。樣品經(jīng)液氮冷凍后去除外果皮和中果皮的種子進行測定。采用酶聯(lián)免疫吸附檢測法（ELISA）測定種子內源赤霉素（GA3）、脫落酸（ABA）、細胞分裂素（CTK）、吲哚乙酸（IAA）的含量，試劑盒由南京森貝伽生物科技有限公司提供。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Office 2016與SPSS 26軟件進行數(shù)據(jù)處理與方差分析。

2 結果與分析

2.1 紅珠寶和凱爾斯果實生長規(guī)律

由圖1-A與圖1-B可以看出，紅珠寶和凱爾斯授粉后1～126 d果實橫縱徑逐漸增大，紅珠寶和凱爾斯在授粉后1～43 d果實生長迅速（4月12日至5月24日），在授粉后43 ~126 d果實均有一個較緩慢的生長過程（5月24日至8月15日），在授粉126 d后果實停止生長；授粉后1～13 d，紅珠寶與凱爾斯的果實橫縱徑大小無明顯差異；在13 d后大小差異顯著（P＜0.05），紅珠寶的果實橫縱徑明顯小于同期凱爾斯（P＜0.05）。由圖1-C可以看出，紅珠寶與凱爾斯的掛果率均呈下降趨勢，在授粉后1～13 d掛果率急速下降，在授粉54 d后趨于穩(wěn)定，紅珠寶與凱爾斯的果實掛果率有顯著差異（P＜0.05），紅珠寶的掛果率顯著高于同期的凱爾斯的果實（P＜0.05）。紅珠寶的掛果率在授粉后54 d仍然處于較高水平（81%），凱爾斯的掛果率在授粉后54 d處于極低水平（4.7%）。圖1-D可以看出紅珠寶的種子胚胎敗育率在授粉后1～54 d呈上升趨勢，在坐果54～87 d急速下降，凱爾斯的種子胚胎敗育率總體呈上升趨勢，在授粉后54～87 d趨于穩(wěn)定，紅珠寶種子內胚胎敗育率在授粉54 d后與凱爾斯有顯著差異（P＜0.05）。

2.2 果實生長發(fā)育過程中種子內源激素含量變化

從圖2-A可以看出，紅珠寶的種子內源GA3含量變化呈“N”形變化，在授粉后1～13 d，紅珠寶的種子內源GA3含量緩慢升高，凱爾斯的種子內源GA3急速下降，兩者差異顯著（P＜0.05），在授粉后31～43 d，紅珠寶的種子內源GA3含量急速下降，凱爾斯的種子內源GA3急速上升，兩者差異顯著（P＜0.05）；在授粉后1～43 d，紅珠寶的種子內源GA3含量顯著高于凱爾斯（P＜0.05），在授粉后43～76 d，紅珠寶的種子內源GA3含量顯著低于凱爾斯（P＜0.05）。

從圖2-B可以看出，紅珠寶的種子內源ABA含量變化呈“N”形變化，在授粉后43 d達到最高值1.625 9 pmol·g-1，隨后急劇下降至最低點 1.202 1 pmol·g-1。在授粉后1～13 d，紅珠寶的種子內源ABA含量顯著高于凱爾斯，在授粉后43～76 d，紅珠寶的種子內源ABA含量顯著低于凱爾斯（P＜0.05）。

從圖2-C可以看出，在授粉后1～13 d，紅珠寶的種子內源CTK含量急速下降，凱爾斯的種子內源CTK急速上升，兩者差異顯著（P＜0.05），在授粉后31～54 d，紅珠寶的種子內源CTK含量急速下降后上升，凱爾斯的種子內源CTK急速上升后下降，兩者差異顯著（P＜0.05）；在授粉后1～19 d，紅珠寶的種子內源CTK含量顯著低于凱爾斯（P＜0.05），在授粉后19～54 d，紅珠寶的種子內源CTK含量顯著高于凱爾斯（P＜0.05）。

從圖2-D可以看出，紅珠寶與凱爾斯的種子內源IAA含量變化均呈上升-下降-上升-下降的周期性變化趨勢，在授粉后31～43 d，紅珠寶的種子內源IAA含量急速下降，凱爾斯的種子內源IAA急速上升，二者有顯著差異（P＜0.05）；在坐果1～31 d，紅珠寶的種子內源IAA含量顯著高于凱爾斯（P＜0.05），在授粉后43～54 d，紅珠寶的種子內源IAA含量顯著低于凱爾斯（P＜0.05）。

2.3 果實生長發(fā)育過程中種子內源激素平衡關系

從圖3-A與圖3-B可以看出，紅珠寶與凱爾斯種子內源激素IAA/ABA比值總體均呈“N”形變化，授粉后54～76 d，紅珠寶種子內源激素IAA/ABA、GA3/ABA比值顯著低于凱爾斯（P＜0.05），從圖3-B與圖3-C可以看出，授粉后1～13 d，紅珠寶種子內源激素GA3/ABA 比值逐漸上升，CTK/ABA比值逐漸下降，而凱爾斯種子內源激素GA3/ABA 比值逐漸下降，CTK/ABA比值迅速上升，兩者差異顯著（P＜0.05），從圖3-C還可以看出，授粉后54～76 d，紅珠寶種子內源激素CTK/ABA比值逐漸下降，而凱爾斯種子內源激素CTK/ABA 比值迅速上升，兩者差異顯著（P＜0.05），從圖3-D可以看出，授粉后13～19 d，紅珠寶種子內源激素（IAA+CTK）/ABA比值緩慢上升，而凱爾斯種子內源激素（IAA+CTK）/ABA比值迅速下降，兩者差異顯著（P＜0.05）；從圖3-E可以看出，授粉后31～43 d，紅珠寶種子內源激素（GA3+IAA+CTK）/ABA比值迅速下降，而凱爾斯種子內源激素（GA3+IAA+CTK）/ABA比值逐漸上升，兩者差異顯著（P＜0.05）。

3 討論

成熟的有生命力的胚胎是植物產(chǎn)生種子的基礎。然而在一些觀賞植物的生長發(fā)育過程中，存在胚早期退化和敗育[21，22]現(xiàn)象，這對觀賞植物育種來說是一個不良的特性，降低了育種效率。觀賞海棠是重要的觀果樹種，探究胚胎敗育原因對觀賞海棠的優(yōu)良雜交育種具有重要意義。

試驗對低敗育率的紅珠寶（M.Red Jewel）和高敗育率的凱爾斯（M.Kelsey）的果實生長發(fā)育和胚胎敗育情況，及內源激素變化規(guī)律進行了初步探究。結果表明，在授粉13 d后，紅珠寶的橫縱徑生長顯著低于凱爾斯（P＜0.05），在授粉后紅珠寶的掛果率顯著高于凱爾斯（P＜0.05），而在授粉后1～13 d，二者的掛果率急速下降，在授粉54 d后，二者的掛果率均趨于穩(wěn)定。授粉后1～13 d是凱爾斯的生理落果期，大量的落果可能是由于種子內低水平的GA3、ABA與高水平的CTK，而此時IAA并不缺乏。在授粉后的發(fā)育過程中，果實的內源激素起著連續(xù)的協(xié)調作用[23]，Gustafson[24]在1936年首次證實在番茄和其他一些物種柱頭上施加人工合成的生長素能刺激未授粉子房發(fā)育形成無籽的果實，Chen等[25]研究表明果樹胚胎的敗育是多種激素間協(xié)同作用的結果。

在授粉54 d后紅珠寶的胚胎敗育率有下降趨勢，并且在授粉54 d后凱爾斯的敗育率趨于穩(wěn)定，這表明授粉后1～54 d是紅珠寶與凱爾斯胚胎敗育發(fā)生的主要時期，大量的胚敗育果實在胚胎發(fā)育完成后并未脫落，而是持續(xù)生長到果實成熟，這可能與種子中高水平的GA3含量和（GA3+IAA+CTK）/ABA比值沒有下降反而升高有關，這與賀金虎等[26]在金煌杧果上的研究有相同之處；在胚胎發(fā)育前期，低敗育率的紅珠寶種子內源激素GA3、IAA含量及GA3/ABA、（GA3+IAA+CTK）/ABA比值顯著高于高敗育率的凱爾斯（P＜0.05），在胚胎發(fā)育后期，低敗育率的紅珠寶種子內源激素GA3、ABA、IAA含量及IAA/ABA、GA3/ABA、（GA3+IAA+CTK）/ABA比值顯著低于高敗育率的凱爾斯（P＜0.05），這表明GA3和IAA在種子敗育過程中起著重要作用，保持胚早期含有較高水平的GA3和IAA ，是確保其正常發(fā)育的重要條件，這與祁業(yè)鳳等[27]對棗果實發(fā)育過程的研究和韓東花等[28]在對楸樹種子發(fā)育過程中內源激素變化上的研究一致。

4 結論

觀賞海棠的生理落果與種子內源激素含量存在相關性。授粉后1～13 d是凱爾斯的生理落果期，在生產(chǎn)上，該時期落果嚴重，是提高凱爾斯坐果率及果實觀賞價值的最佳時期；授粉后1～54 d是紅珠寶與凱爾斯胚胎敗育發(fā)生的主要時期，在胚胎發(fā)育前期，保持種子含有較高濃度的GA3和IAA能確保其正常發(fā)育，在胚胎發(fā)育后期，種子內單一激素的高低無法確保胚胎的正常發(fā)育，低濃度的GA3和IAA能確保其正常發(fā)育。