基于非靶向代謝組學研究做青工序對肉桂茶代謝產物的影響

林馥茗，孫威江

（1.福建農林大學園藝學院，福建 福州 350002；2.福建農林大學安溪茶學院，福建 泉州 362000；3.福建省茶產業工程技術研究中心，福建 福州 350002）

0 引言

【研究意義】肉桂是福建閩北烏龍茶的代表，因其濃郁的花果香而深受消費者的喜愛，而烏龍茶加工過程中的做青工序是形成其品質特征的關鍵工序。逆境脅迫能夠促進物質間的轉化，并誘導生成次生代謝產物。茶葉加工也是一種人為干預性脅迫，尤其在做青環節發生了復雜的代謝變化，從而產生并積累大量的芳香物質等次生代謝產物，為此研究做青對烏龍茶品質形成的作用機制，可為烏龍茶生產提供理論參考。代謝組學是研究生物體在受到外界刺激等條件下，其代謝產物的變化情況及代謝途徑，以闡述生物體對應刺激的響應機制[1-2]。運用代謝組學分析技術可以獲得大量的生化數據，通過代謝組學分析技術探究加工工藝對茶葉品質的影響機制已成為研究熱點。【前人研究進展】代謝組學分析技術能夠深入了解茶葉在加工過程中發生的化學變化，已在紅茶、綠茶、烏龍茶、白茶及黑茶方面均有相關研究[3-7]。Fraser等[8]利用LC-MS檢測技術分析烏龍茶加工過程中代謝物的變化，結果表明在殺青階段會導致主要生物化學物質發生改變，如類黃酮、核苷、櫻草糖苷；做青過程中只有少量物質被標記，氨基酸和茉莉酸以及相關代謝物有顯著的增加。Chen等[9]在鐵觀音烏龍茶加工過程中，檢測到揮發性物質及非揮發性代謝物，如黃酮醇苷、氨基酸、萜烯類化合物等。Liu等[10]分析烏龍茶制作過程中揮發性和酚類化合物的動態變化，黃酮醇、酚酸和黃嘌呤生物堿的變化相對穩定，醛、酮、雜環化合物則主要是在烘焙過程中形成。通過代謝組學鑒別茶樹品種[11-12]、產地[13-14]、年份[15-16]及品質評價[17-19]等均有報道，能夠為指導茶葉加工生產提供理論基礎?！颈狙芯壳腥朦c】目前多數研究主要集中在茶葉加工過程中次生代謝途徑及相關產物的變化，對初生代謝產物研究較少，而這些物質在植物中對環境脅迫防御適應起重要作用，同時也影響下游次生代謝物質的合成?！緮M解決的關鍵問題】為此本研究通過GC-TOF-MS非靶向代謝組學檢測技術，對做青前后及對照樣品中糖類、有機酸等代謝產物的影響，篩選鑒定差異代謝物并探討可能影響的代謝通路，為深入了解烏龍茶品質形成的機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選取同一片長勢一致的無性系肉桂茶園，采摘春季中開面3、4葉茶梢為試驗材料，且取自同一采摘批次的鮮葉，試驗地點為武夷星茶業有限公司九龍山基地。

1.2 樣品收集

為盡可能保證樣品的代表性，本試驗按照“看青做青”的原則，按照武夷巖茶的制作工藝（鮮葉→曬青→做青→殺青→揉捻→干燥），采用手工搖青的方式制作樣品。取20 kg鮮葉經適度曬青后平均分為2組，一組進行手工搖青，具體操作如下：第1次搖青10轉，第2次搖青20轉，第3次搖青40轉，第4次搖青60轉，第5次搖青80轉，第6次搖青120轉，第7次搖青300轉，中間晾青1 h，做青時間歷時8 h左右；同時在相同環境條件下另一組茶青為對照組，即無搖青的攤放處理（攤青），攤放時間與做青時間一致；做青間溫度23～25 ℃，相對濕度60%～70%。待做青結束后2組茶青經殺青、揉捻、烘干后制成毛茶，處理組與對照組除做青工序外，其余工藝參數均一致，試驗重復3次。本試驗分別對曬青葉（SYM）、做青葉（LY7M）及對照組攤青葉（CK7M）進行隨機取樣，取茶梢駐芽第2葉，用液氮迅速冷卻固定，置于-80 ℃超低溫冰箱保存備用。

1.3 試劑與設備

本試驗的主要試劑包括：核糖醇（≥99%，SIGMA）、甲氧銨鹽（AR，TCI）、吡啶（HPLC，Adamas）、甲醇（HPLC，Adamas）、飽和脂肪酸甲酯（Dr.Ehrenstorfer）、BSTFA（with 1% TMCS，V/V，REGIS Technologies）、純水等。本試驗所用儀器與設備主要有真空干燥儀（TNG-T98，太倉市華美生化儀器廠）、超聲儀（PS-60AL，深圳市雷德邦電子有限公司）、研磨儀（JXFSTPRP-24，上海凈信科技有限公司）、固相微萃取頭（65UM PDMS/DVB，上海安譜實驗科技股份有限公司）、多功能進樣器（MPS，德國Gerstel公司）、離心機（Heraeus Fresco17，賽默飛）、色譜柱（DB-5MS 30 m×250 μm×0.25 μm，美國LECO公司）、質譜儀（PEGASUS HT，美國LECO公司）、氣相色譜（7890A，Agilent）、超低溫冰箱（Forma 900 series，賽默飛）等。

1.4 代謝物的提取

取樣品（50 ±1 ）mg 于 2 mL EP 管中，以體積比V（甲醇）：V（水）=3∶1加入0.45 mL 提取液和10 μL 核糖醇，渦旋30 s；再加入瓷珠，用研磨儀（45 Hz）處理4 min，超聲5 min（冰水浴），重復3次；將樣品于4 ℃、12 000 g離心15 min，取0.3 mL上清液于1.5 mL EP 管中，在真空濃縮器中干燥，向干燥后的代謝物加入90 μL 甲氧胺鹽試劑（甲氧胺鹽酸鹽，溶于吡啶20 mg·mL-1），輕輕混勻后，放入80 ℃烘箱中，孵育30 min；向每個樣品中加入100 μL BSTFA，將混合物在70 ℃孵育1.5 h，再隨機順序上機檢測。每個樣本均有6個生物學重復。

1.5 代謝物的檢測

GC- TOF-MS非靶向分析條件如下：進樣量為1 μL；隔墊吹掃流速為3 mL·min-1；分流模式為Splitless Mode；載氣為氦氣；柱箱升溫程序為50 °C保持1 min，再以 10 °C·min-1升到 310 °C，保持 5 min；柱流速為 1 mL·min-1；離子源溫度為250 °C；傳輸線溫度為280 °C；前進樣口溫度為280 °C；電離電壓為-70 eV；掃描速率為 20光譜·s-1；質量范圍為50～500 m/z；溶劑延遲為6.27 min。每個樣本均設6個生物學重復。

1.6 數據分析

使用ChromaTOF 軟件（V 4.3x，LECO）對質譜數據進行了峰提取、基線矯正、解卷積、峰積分、峰對齊等分析。使用了 LECO-Fiehn Rtx5 數據庫進行物質定性，包括質譜匹配及保留時間指數匹配。利用歸一化后的數據矩陣進行多元統計分析，并利用多元統計分析（OPLS-DA） 和單變量統計分析相結合的方法篩選差異代謝物，將差異代謝物進行代謝通路KEGG 富集分析。

2 結果與分析

2.1 樣品間代謝物統計分析結果

由于加工取樣影響因素較復雜，用無監督的主成分分析法（PCA）對組間樣品分離效果不理想（圖1），本試驗采用正交偏最小二乘判別法（OPLSDA）對樣品間進行分析，去除組內不相關差異，結果如圖2~4所示，樣品SYM與CK7M、SYM與LY7M、CK7M與LY7M間都顯示出一定分離度，說明樣品間代謝物具有差異。

2.2 樣品間差異代謝物篩選

根據多元統計分析OPLS-DA的VIP值，并結合單變量統計分析t檢驗P值篩選不同比較組間的顯著差異代謝物，以VIP≥1 且t-testP＜0.05為篩選條件確定差異顯著的代謝物；通過公共數據庫與公司自建數據庫對代謝物進行定性，鑒定出的差異代謝物如表1所示，處理間差異代謝物變化倍數＞1。與曬青葉SYM相比，對照CK7M與做青葉LY7M差異顯著的代謝物中上調者居多，分別有19個和14個，下調的產物分別有2個和0個，說明長時間的機械力和細胞失水的脅迫作用使葉片內代謝途徑發生顯著變化；與對照CK7M相比，做青葉LY7M中呈顯著上調的差異代謝物有9個，顯著下調的差異代謝物有3個。

表1 樣品間差異代謝物的篩選Table 1 Differential metabolites in samples

2.3 樣品間差異代謝物KEGG富集分析

將所得到的全部差異代謝物進行KEGG富集分析，如圖5所示，差異代謝物主要涉及到的代謝途徑有糖類代謝、氨基酸代謝、脂質代謝、其他次生代謝的生物合成、能量代謝、核苷酸代謝、其他氨基酸代謝及萜類和聚酮類化合物代謝等。

2.4 樣品間 GC-TOF-MS非靶向差異代謝物比較

通過與KEGG數據庫比對，能夠比對上通路的差異代謝物不多，通過GC檢測到的差異代謝物主要是有機酸與糖類物質，曬青葉SYM與對照攤青葉CK7M間比對上的差異代謝物是硫磺酸、琥珀酸、莽草酸、檸檬酸、蘋果酸、苯丙氨酸、蘇糖酸、肌醇、熊果苷、棉子糖；曬青葉SYM與做青葉LY7M間比對上了7個差異代謝物，分別是琥珀酸、苯丙氨酸、D-甘油酸、蘇糖酸、蘋果酸、肌醇、麥芽糖；對照攤青葉CK7M與做青葉LY7M間比對上8個差異代謝物，分別是硫磺酸、琥珀酸、檸檬酸、莽草酸、苯丙氨酸、D-甘油酸、蘇糖酸、棉子糖。

通過熱圖展示比較組間差異代謝物情況，如圖6~8所示，肉桂鮮葉經做青及攤青后，大部分代謝物含量要高于曬青葉，其中琥珀酸、檸檬酸、蘋果酸是三羧酸循環途徑的中間產物。三羧酸循環是糖、脂類和氨基酸代謝的最后共同途徑，該循環的中間體可參與到其他代謝途徑中，直接利用三羧酸循環中間產物的生物合成途徑有葡萄糖生物合成、脂類生物合成、氨基酸生物合成[20]。做青及攤青過程的機械損傷與失水作用可以增加三羧酸循環的中間產物，能夠為次生代謝產物的合成提供前體物質和化學動力。做青結束時，葉片中琥珀酸和檸檬酸含量高于對照攤青葉，莽草酸含量明顯減少。莽草酸是莽草酸途徑中的關鍵中間產物，莽草酸在酶的催化下可以生成苯丙氨酸[21]。苯丙氨酸代謝途徑是茶樹次生代謝重要的途徑之一，能夠合成苯甲醇、苯乙醇等芳香族化合物[22]。本試驗中檢測到做青葉中苯丙氨酸含量有一定程度增加。另外，在試驗中還檢測到部分糖類物質，參與蔗糖代謝和半乳糖代謝，均在做青與攤青后明顯增加，糖類物質是植物體初生代謝合成的重要物質，而環境脅迫作用能夠在一定程度上促進糖類代謝活動。

3 討論與結論

茶葉加工過程中不同程度的非生物脅迫和生物脅迫等防御作用是誘導和促進各類化合物合成的重要因素[23-25]，尤其是在烏龍茶做青過程中，因機械損傷和失水的雙重脅迫下，葉片內含物質發生了顯著變化，最終形成了烏龍茶的品質特征。Liu等[10]分析了肉桂烏龍茶加工過程中揮發性和酚類化合物的變化，在做青過程中78% 左右的黃烷醇被氧化形成茶黃素等產物，而黃酮醇、酚酸和黃嘌呤生物堿保持穩定，醛、酮和雜環化合物等主要是在烘烤過程中形成。唐邦明等[26]通過UPLC-QTOF/MS檢測技術分析了烏龍茶加工過程中代謝物的變化，篩選出的差異代謝物包括牡荊素-2-O-鼠李糖苷、14,15-脫氫還陽參油酸、3-甲基黃嘌呤、麥黃酮、7-甲基黃嘌呤、枸橘苷、葡萄糖-6-磷酸，富集到的代謝途徑主要是氨基酸合成、淀粉與蔗糖代謝、類黃酮生物合成等。本研究通過KEGG富集分析表明差異代謝物涉及的途徑主要是糖類代謝、氨基酸代謝、脂類代謝等，與前人研究基本一致。在制茶環節中，非生物脅迫作用能夠促進葉片中的多糖轉化為雙糖、單糖，隨后進入次級代謝途徑[27]；蛋白質可以水解形成氨基酸，而氨基酸類又參與氧化還原調節、信號傳導、其他次級代謝產物的合成等[28]，對茶葉風味品質的形成有重要作用。

本研究結果顯示在相同環境及時間條件下，做青工序能夠明顯增加三羧酸循環途徑的中間產物，而這些產物能夠參與糖類、氨基酸、脂類等物質合成，從而間接影響茶葉的品質。與對照相比，做青后葉片中莽草酸含量呈下調趨勢，而苯丙氨酸含量有所增加。莽草酸是合成苯丙氨酸的前體物質，苯丙氨酸則參與生成了苯甲醇、苯乙醇等芳香族化合物。莽草酸途徑連接了初生代謝與次生代謝，也是芳香族化合物合成的必經途徑。本試驗中武夷肉桂經做青后葉片中芳香族香氣物質有顯著增加（其含量是對照組的1.67～2.94倍），與前人研究結果基本一致[29-30]。芳香族化合物是烏龍茶具有花果香特征的重要物質，因此，推測做青工序能夠增強莽草酸的代謝速度，為次生代謝物質的合成提供前體物，同時也促進苯丙氨酸代謝，生成芳香族化合物，其機理有待進一步明確。

烏龍茶是福建省特色茶類，具有愉悅的花果香和醇厚、回甘的口感，做青是品質形成的重要工序。前人研究主要是關注做青過程次生代謝產物的變化，本試驗則從初生代謝角度探討做青對烏龍茶品質形成的影響；不足之處是做青過程初生代謝產物的變化尚不明確，后續可結合多組學（轉錄組、蛋白組、代謝組）聯合研究分析技術，深入研究做青對茶葉初級代謝與次級代謝的影響，明確做青對茶葉品質形成的作用機制，為茶葉加工工程基礎研究和工藝的改良提升提供可靠的理論依據。目前做青方式仍以搖青與晾青交替進行，操作較復雜且難掌握，結合前人研究結果可知做青過程中的機械作用能夠增強糖類、氨基酸、脂類、芳香物質等代謝合成，因此可采用連續慢速搖青方式對做青工序進行改良，既能促進烏龍茶品質形成，也能簡化工序、節約成本[31]。