溶磷內生菌的篩選鑒定及其對薏苡生長發育的影響

普鳳雅，谷書杰，何永宏，陳崧林，楊志清,3,4*

（1.云南農業大學農學與生物技術學院，云南 昆明 650201；2.云南農業大學植物保護學院，云南 昆明650201；3.云南農業大學云南省藥用植物生物學重點實驗室，云南 昆明 650201；4.云南農業大學西南中藥材種質創新與利用國家地方聯合工程研究中心，云南 昆明 650201）

0 引言

【研究意義】薏苡(Coix lacryma- jobiL.)屬于禾本科(Gramineae)，玉蜀黍族(Maydeae)薏苡屬 (CoixL.)植物，是中國傳統的藥食兼用作物[1]。薏苡長期以傳統的種植方式栽培，管理較為粗放，化肥農藥投入量大，土壤環境遭到破壞，導致磷素利用率嚴重下降，不符合綠色生產[2]。微生物對土壤磷的轉化和有效性影響很大[3]，解磷微生物能夠將植物難以吸收利用的磷轉化為可吸收利用的形態，提高磷元素利用率，從而促進植物生長發育[4-5]。【前人研究進展】20世紀50年代我國逐漸對解磷菌的應用開始進行研究，先后從東北黑土和灰化土中篩選出解磷能力較強的芽孢桿菌、極毛桿菌等[6]。近年來，通過篩選具有解磷功能的菌株來提高作物栽培過程中磷元素的利用率，促進作物生長已成為目前研究的熱點。陸藍翔等[7]從樟樹組織中分離篩選到4株菌具有解無機磷能力，2株菌具有解有機磷能力；盧志紅等[8]研究表明內生細菌SRW具有較強的增磷能力，能夠促進鴨跖草生長發育；蔡紅丹等[9]研究表明解磷菌P2的使用能夠提高水稻種子的萌發，促進根系生長。【本研究切入點】目前對薏苡內生菌的研究鮮見報道，尤其是薏苡溶磷內生細菌。因此，有必要篩選薏苡溶磷內生菌并探究內生菌對薏苡生長的影響，以便深入了解薏苡生長發育過程中內生菌的作用。【擬解決的關鍵問題】通過分離文薏2號根、莖、葉內生細菌，篩選薏苡溶磷內生菌，并分別以植酸鈣和Ca3(PO4)2作為唯一有機磷源和無機磷源，初步探究其溶解有機磷和無機磷能力，通過盆栽試驗探究溶磷內生菌對薏苡的促生長作用，為薏苡溶磷內生菌的開發應用提供理論依據和優良菌株。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

文薏2號（2015年通過國家小宗糧豆作物品種鑒定委員會鑒定[10]）由云南省文山州農業科學院提供。2020年7月，盆栽試驗在云南農業大學后山標本園大棚內進行，播種25 d后，進行內生菌分離。

1.2 培養基

LB 培養基：10 g·L-1胰蛋白胨，5 g·L-1酵母提取物，10 g·L-1氯化鈉，蒸餾水 1 000 mL，pH值7.0；固體培養基在液體LB培養基的基礎上加入20 g·L-1瓊脂粉。

無機磷培養基：10 g·L-1葡萄糖，5 g·L-1Ca3(PO4)2，0.1 g·L-1(NH4)2SO4，5 g·L-1MgCl2?6H2O，0.25 g·L-1MgSO4?7H2O，0.2 g·L-1KCl ，蒸餾水 1 000 mL，pH值為7.0～7.5，固體培養基在液體培養基的基礎上加入 15.0～18.0 g·L-1瓊脂粉。

有機磷培養基：10 g·L-1葡萄糖，0.3 g·L-1NaCl，0.03 g·L-1FeSO4， 0.03 g·L-1MnSO4?H2O， 0.5 g·L-1(NH4)2SO4， 0.3 g·L-1KCl， 0.3 g·L-1MgSO4?7H2O，2 g·L-1植酸鈣，蒸餾水 1 000 mL，pH 值為 7.0～7.5，固體培養基在液體培養基的基礎上加入15～18 g·L-1瓊脂粉。

1.3 薏苡內生細菌分離和純化

內生菌的分離純化參考Cardoso等[11]的方法略有修改。播種25 d后，從薏苡植株上剪取健康的根、莖及葉組織各1 g，隨后使用自來水沖洗3 min去除表面多余的雜質，濾紙吸干表面水分。然后用75 %乙醇浸泡2 min；再用1 %次氯酸鈉消毒根組織5 min，莖、葉組織3 min；最后用無菌水漂洗6次，除去殘留消毒劑并用無菌濾紙將其吸干。將消毒好的植物組織樣品放入無菌研缽中并向其內加入9 mL無菌水，研磨至呈勻漿狀，靜置5 min，取上清液稀釋10-2倍，涂布在LB平板上，置于35 ℃下培養2 d。挑取長出的菌株進行純化，直至板上菌落顏色和形態基本一致，純化的菌株用40 %甘油保存至-20 ℃冰箱備用。同時吸取最后一次漂洗的無菌水100 μL涂布于LB平板，同等條件下培養，檢驗表面消毒是否徹底。

1.4 溶磷內生細菌的篩選

定性測定：從冰箱中取出保存的內生細菌，室溫下讓其呈熔融狀態。在超凈臺上用接種環蘸取少許菌液，參照郭藝鵬等[12]的方法分別點接于有機磷和無機磷固體平板上，每個菌株重復3次。30 ℃培養5 d，觀察有無溶磷圈生成，測定溶磷圈直徑（D）、菌落直徑（d）。根據可溶性指數（D/d）大小初步確定菌株的溶磷能力。定量測定：采用鉬銻抗比色法[13]測定其磷含量。

1.5 溶磷菌分泌磷酸酶活性測定

磷酸酶活性測定參照趙為容等[14]的方法。分別將菌株R24、L21接種于100 mL有機磷和無機磷培養基中，于 30 °C，160 r·min-1震蕩培養，以相應的不接菌的培養基為空白對照，試驗重復3次，每隔24 h取1 mL進行磷酸酶活性測定。

1.6 溶磷細菌對薏苡生長發育的影響

菌懸液制備：將菌體于35 ℃下培養28 h，然后8 000 r·min-1離心收集菌體，無菌水重懸，調節菌懸液濃度為107cfu·mL-1用于后續試驗。

試驗采用隨機區組設計，設置4個處理，分別為 T1、T2、T3、T4（CK），每個處理 5次重復，共20盆。T1：澆L21重懸菌液；T2：澆R24重懸菌液；T3：澆R24和L21等比例混合重懸菌液；T4：澆無菌水（CK）。

挑選籽粒外觀飽滿無病蟲危害的健康薏苡種子，表面消毒處理后播種于育苗盤內，10 d后選擇長勢一致的苗移栽至高17 cm、外口徑25 cm的花盆里。采用灌根法，每盆灌入400 mL上述菌懸液，置于溫室大棚中培養，對照用無菌水。在薏苡的生長過程中，于灌根菌液后，每隔15 d測量薏苡株高、莖粗、葉面積、分蘗數、葉片數，并用葉綠素測定儀測定葉綠素含量。

1.7 菌株生理生化測定和16S rDNA序列分析

將篩選獲得的菌株劃線接種在LB固體培養基上，35 °C 培養24 h后，根據《伯杰細菌鑒定手冊》和《常見細菌系統鑒定手冊》對菌株進行形態學和生理生化測定。用生工生物工程（上海）有限公司研制的試劑盒提取細菌DNA，采用通用引物27 F（5′-3′：AGTTTGATCMTGGCTCAG）和1492 R（5′-3′：GG TTACCTTGTTACGACTT)進行PCR擴增。送至生工生物工程（上海）有限公司測序，獲得菌株的16S rDNA序列。將所測序列在GenBank中進行blast同源性搜索，然后將菌相似性較高的序列用MAGE-X軟件中的鄰接法（Neighbor-joining method）構建系統發育樹。

1.8 數據分析與處理

采用 Excel 2010 和SPSS 25.0對數據進行記錄、整理、統計和分析。

2 結果與分析

2.1 不同菌株降解有機磷能力測定

2.1.1 定性測定 將菌株點接于有機磷固體培養基中，培養5 d后，觀察有無透明圈，結果如表1所示，在固體平板上，菌株R24的溶磷圈直徑（D）與菌落直徑（d）之比最大，為（2.15 ± 0.13），顯著大于其余菌株（P＜0.05）。

表1 菌株降解有機磷能力的比較Table 1 Organic phosphate degrading ability of strains

2.1.2 定量測定 菌株在液體培養基中培養5 d后，測定上清液可溶性磷的含量，結果（圖1）發現不同菌株間存在顯著差異（P＜0.05）。其中，R24菌株可溶性磷含量最大，為37.20 mg·L-1，顯著大于除R29以外的其他供試菌株（P＜0.05），分離自根部的R29菌株可溶性磷含量次之，為30.03 mg·L-1。

2.2 不同菌株降解無機磷能力的測定

2.2.1 定性測定 將菌株點接至無機磷固體培養基中，培養5 d后觀察有無透明圈。各供試菌株的溶無機磷能力存在一定差異，分離自葉片的L21菌株的溶磷圈最大，溶磷圈直徑（D）與菌落直徑（d）之比為（2.01 ± 0.25），顯著大于其余菌株（P＜0.05）（表2）。

表2 菌株降解無機磷的能力比較Table 2 Inorganic phosphate degrading ability of strains

2.2.2 定量測定 菌株在液體培養基中培養5 d后，測定上清液可溶性磷含量。測定結果如圖2所示。L21菌株可溶性磷含量最大，為62.93 mg·L-1，顯著大于其余供試菌株（P＜0.05），分離自根部的R5菌株可溶性磷含量最小，為1.99 mg·L-1。

2.3 在有機磷培養基中溶磷菌株分泌磷酸酶的動態變化

在有機磷培養基中，2株解磷細菌培養6 d后，發酵液酸性磷酸酶和堿性磷酸酶的活性分別如圖3-a、b所示，隨著培養時間的增加，菌株分泌磷酸酶活性呈現先上升后降低的趨勢。培養4 d后，菌株R24的酸性磷酸酶活性達到最大值；培養5 d后，菌株L21的酸性磷酸酶活性達到最大值。兩菌株相比，R24分泌酸性磷酸酶活性的峰值比L21高出10.37%。R24和L21分泌堿性磷酸酶的能力均在培養第5天時達到最大值，其中R24比L21高出72.58%。測定發酵液每天的pH值發現，兩菌株培養后，其發酵液的pH值均低于空白處理，R24的pH低于L21（圖3-c）。說明在有機磷培養基中，菌株R24分泌酸性磷酸酶和堿性磷酸酶活性均高于L21，有利于其分解難溶性有機磷，此結果與2.1中該菌株溶解有機磷能力最高一致。

2.4 在無機磷培養基中溶磷菌株分泌磷酸酶的動態變化

在無機磷培養基中，2株解磷菌培養6 d后，發酵液酸性磷酸酶和堿性磷酸酶的活性如圖4-a、b所示，隨著培養時間的增加，菌株分泌磷酸酶活性呈現的趨勢為先上升后下降。R24分泌酸性磷酸酶活性在培養第4天時達到最大值，而L21在培養5 d時達到最大值，L21的酸性磷酸酶活性最大值比R24高出27.30%；R24分泌堿性磷酸酶活性在培養第5天達到最大值，而L21在培養4 d達到最大值，L21堿性磷酸酶活性最大值比R24高出116.84%。測定發酵液每天的pH可知，兩菌株培養后，發酵液的pH均低于空白處理，L21發酵液的pH低于R24（圖4-c）。說明在無機磷培養基中，L21分泌的酸性磷酸酶和堿性磷酸酶活性高于R24，有利于該菌株分解難溶性無機磷，此結果與2.2中的該菌株溶解無機磷能力相同。

2.5 不同溶磷菌株處理對薏苡農藝性狀的影響

由表3可知，在培養60 d后，T1、T2和T3處理下的薏苡株高、莖粗、分蘗數和葉面積均大于對照CK。其中，株高和分蘗數與CK達到顯著水平(P＜0.05)。T1、T2和T3處理對薏苡的葉片生長影響較小，與CK相比未達到顯著水平（P＞0.05）。在培養30 d后，薏苡葉片葉綠素相對含量達到最大值，T1、T2和T3處理分別比CK增加19.74%、12.85%、7.98%。總之在培養60 d后，T1、T2和T3處理對薏苡的生長發育均有一定的促進作用（圖5）。

表3 不同處理下盆栽薏苡農藝性狀Table 3 Agronomic traits of potted plants after treatments

2.6 溶磷菌株生理生化與16S rDNA鑒定

2.6.1 細菌的生理生化鑒定 如圖6所示，R24菌落圓形，凸起明顯，白色，表面粗糙濕潤；L21菌落圓形，凸起不明顯，白色，表面粗糙干燥，R24和L21革蘭氏染色均為陽性。菌株R24、L21的生理生化測定結果見表4，在所測定的生理生化指標中，菌株R24的甲基紅試驗、淀粉水解、硝酸鹽試驗為陰性，其余為陽性；菌株L21的檸檬酸試驗為陰性，其余為陽性。

表4 菌株的生理生化特性Table 4 Physiological and biochemical characteristics of strains

2.6.2 細菌分子鑒定 對菌株進行16S rDNA基因片段擴增，將PCR產物測序結果提交GenBank與序列相似性較高的菌株進行比對，構建系統發育樹（圖7）。結果顯示：2株細菌均為芽孢桿菌屬（Bacillus.）。其中，菌株R24與Bacillus pumilus（登錄號：NBRC 12092）處于系統發育樹的同一分支，同源性99%，鑒定為短小芽孢桿菌；菌株L21與Bacillus velezensis（登錄號：MK092676.1）處于系統發育樹的同一分支，同源性100%，鑒定為貝萊斯芽孢桿菌。

續上表

3 討論與結論

解磷菌是一類能夠將土壤中的難溶性磷轉化為可以被植物吸收利用的可溶性磷的有益微生物，在玉米[15]、小麥[16]等作物上已進行廣泛研究。目前國內很少有對薏苡進行內生菌的分離鑒定及功能的探究。本研究通過平板接菌試驗篩選得到溶解有機磷細菌8株，分別為分離自薏苡根系的R5、R24、R29、R401，分離自薏苡莖稈的S1、S4、S22，分離自薏苡葉片的L21，而R5、R24、R29、R401和L21同時具有溶解無機磷的能力。這與馬驄毓等[17]從黃芪根際中分離得到溶解無機磷菌株42株和溶解有機磷菌株33株在數量上有所差距，究其原因可能是不同的植物、分離的材料數所導致。

本研究中，分離自薏苡根系的R24對有機磷的溶解能力最強，為37.20 mg·L-1，分離自薏苡葉片的L21對無機磷的溶解能力最強，為62.93 mg·L-1；狄義寧等[18]在甘蔗中分離得到的溶磷菌D5的溶磷量。此外，R24在有機磷培養基中分泌磷酸酶的能力最強，酸性磷酸酶活性和堿性磷酸酶活性分別達9.64 μg·(mL·h)-1和 9.63 μg·(mL·h)-1；L21 在無機磷培養基中分泌磷酸酶的能力最強，酸性磷酸酶活性和堿性磷酸酶活性分別達到 11.47 μg·(mL·h)-1、10.69 μg·(mL·h)-1。溶磷內生細菌的溶無機磷和有機磷的能力各不相同，這可能是因為菌株分泌的磷酸酶、植酸酶等能力不同[19]，同時菌株溶磷能力的高低也與菌株自身的遺傳因素有關[20-21]，有待進一步深入研究。

溶磷菌對植物的生長發育具有顯著的促進作用，在本研究中，澆灌L21菌液后，與對照相比，薏苡的株高較CK增加22.07%，莖粗增加24.86%，葉面積增加53.33%，分蘗數增加83.33%。經L21和R24處理后，薏苡根系活力與CK達到顯著水平(P＜0.05)，分別較CK增加89.52%、63.76%。L21和R24的等比例混合菌液與CK相比，在株高、葉面積方面促進效果顯著，但是低于L21和R24單獨處理的效果，可能的原因是兩株菌在營養物質和生態位等方面有所競爭，這與Li等[22]研究的溶磷菌增加了玉米芽長、生物量的結果一致。總的來說L21、R24和混合菌劑處理對薏苡的生長發育均有一定的促進作用，促生長能力從大到小為：L21＞R24＞（L21+R24），可作為開發薏苡微生物肥料的優質菌種資源。