生防細菌蠟樣芽孢桿菌BCCY-22發酵條件優化

趙 月，楊亞楠，李雅華，趙洪海，咸洪泉

（青島農業大學生命科學學院，山東 青島 266000）

0 引言

【研究意義】蠟樣芽孢桿菌是一種革蘭氏陽性內生芽孢桿菌，常見于土壤和植物中[1]，其中有些蠟樣芽孢桿菌可作為生防菌用于防治植物病蟲害，發酵條件研究是其開發和應用前提和基礎，具有重要意義。【前人研究進展】蠟樣芽孢桿菌細胞63 ℃處理2 min死亡率達99.30%[2]，而游離芽孢在70 ℃處理30 min條件下才能將其殺死[3]，蠟樣芽孢桿菌產生的芽孢在高溫、寒冷等極端環境下具有很強的抗逆性[4]，有利于制劑化，提高制劑的穩定性。蠟樣芽孢桿菌能有效防治植物病害，例如蠟樣芽孢桿菌強化的生物有機肥可防控細菌引起的煙草青枯病[5]，蠟狀芽孢桿菌可抑制植物病原真菌引發的棉花黃萎病并激活天然免疫[6]，防治鐮刀菌引起的玉米穗腐和根腐病[7]；蠟樣芽孢桿菌還可以防治多種線蟲病害[8-11]，同時促進植物生長[12]，對部分抗生素也可產生一定的耐受性[13]。因此蠟樣芽孢桿菌是一種具有很好開發前景的生防菌。生防菌開發利用的前提條件是發酵培養，不同生防菌株最適培養條件不同[14]，響應面法是一種高效的微生物發酵培養條件優化方法，可以使用較少的實驗數據精準推算出目標值的優化條件[15]。例如Zhang等[16]對谷物孢囊線蟲生防菌Trichoderma longibrachiatumT6進行響應面發酵優化，在初始 pH 為6.06、接種量為1.62 mL、孵育時間為7.15 h的條件下發酵培養濾液獲得了最高的殺線蟲活性。【本研究切入點】本課題組前期篩選出1株對多種植物線蟲病害具有良好生防作用的蠟樣芽孢 桿 菌 BCCY-22（Bacillus cereusBCCY-22）， 可有效防治小麥孢囊線蟲、花生根結線蟲和甜瓜根結線蟲等線蟲病害[17]，具有良好開發前景，然而其發酵培養條件有待深入探討。【擬解決的關鍵問題】本研究探討pH、培養溫度、接種量、裝瓶量等對生防菌BCCY-22生長的影響，在單因素試驗基礎上，進行發酵參數響應面優化，篩選BCCY-22菌發酵的最佳條件，旨在為BCCY-22菌株的發酵培養和開發利用提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

蠟樣芽孢桿菌BCCY-22（Bacillus cereusBCCY-22）由青島農業大學微生物實驗室分離鑒定保存。牛肉膏蛋白胨液體培養基（NA）：牛肉膏5 g·L-1；蛋白胨 10 g·L-1；氯化鈉 5 g·L-1，pH 調至 7.2～7.6。

1.2 試驗方法

1.2.1 BCCY-22菌株生長曲線測定 將冰箱保存的斜面菌株，NA平板劃線活化，挑取一環接種到含有100 mL牛肉膏蛋白胨液體培養基的500 mL錐形瓶中，32.5 ℃，140 r·min-1培養，4 h取樣 1次，將樣品菌液稀釋8倍后，以牛肉膏蛋白胨液體培養基為對照，采用比濁法測定菌液600 nm波長處的吸光值（Optical Density 600，OD600）。將 OD600值以為縱坐標，培養時間為橫坐標，繪制生長曲線。

1.2.2 BCCY-22菌株發酵培養條件的優化 經本實驗室前期不同培養基發酵比較試驗，發現適宜BCCY-22菌株生長的培養基為NA液體培養基，后續優化發酵培養條件均利用NA液體培養基。

1.2.3 培養溫度的優化 接種量為1%，裝瓶量20%，發酵培養基初始pH為6.5的條件下，分別置于23.5 、28、32.5 、37、41.5 ℃的振蕩培養箱中，140 r·min-1培養3 d，每組3個重復。分光光度計以牛肉膏蛋白胨液體培養基調零為對照，分別在12、24、36、48、60、72 h測定菌液稀釋8倍后的OD600值。

1.2.4 發酵培養基初始pH的優化 利用1 mol·L-1的氫氧化鈉和鹽酸調節牛肉膏蛋白胨液體培養基的初始pH值，將pH值分別設定為5.5、6.5、7.5、8.5、9.5。在接種量1%，裝瓶量20%條件下32.5 ℃，140 r·min-1培養3 d，每組3個重復。分光光度計以牛肉膏蛋白胨液體培養基調零為對照，分別在12、24、36、48、60、72 h測定菌液稀釋8倍后的OD600值。

1.2.5 接種量的優化 設置接種量分別為1%、3%、5%、7%、9%。裝瓶量20%，發酵培養基初始pH為6.5 的條件下，32.5 ℃、140 r·min-1培養 3 d，每組3個重復。分光光度計以牛肉膏蛋白胨液體培養基調零為對照，分別在12、24、36、48、60、72 h測定菌液稀釋8倍后的OD600值。

1.2.6 裝瓶量的優化 設置裝瓶量分別為10%、20%、30%、40%、50%。接種量1%，發酵培養基初始pH為6.5的條件下， 32.5 ℃、140 r·min-1培養3 d，每組3個重復。分光光度計以牛肉膏蛋白胨液體培養基調零為對照，分別在12、24、36、48、60、72 h測定菌液稀釋8倍后OD600值。

1.2.7 發酵培養條件的響應面優化設計試驗

（1）選取對生物量影響較大的3個因素：溫度、pH、裝瓶量。

（2）利用minitab軟件，采用中心復合設計（Central composite design，CCD)進行響應面試驗優化發酵條件，中心符合序貫設計（Central composite circumscribed design）確定試驗因素和水平（表1）。

表1 試驗因素水平Table 1 Factor level of optimization experimentation

1.2.8 發酵時間的優化 在上述優化的發酵條件基礎上發酵培養，分別在 6、12、24、36、48、60、66、72 h測定菌液生物量，確定最佳的發酵時間。

1.2.9 差異顯著性分析 采用DPS v7.05軟件使用Duncan’s新復極差法進行因素多重比較分析，多個處理間的顯著性差異水平P＜0.05時為差異顯著，Excel進行數據整理并制圖。

2 結果與分析

2.1 生長曲線的測定

菌株BCCY-22在4~12 h快速增長，為對數生長期（圖1），因此選取對數生長期的菌體（10 h）作為后續試驗的種子液。

2.2 發酵條件優化結果

2.2.1 培養溫度的優化結果 在23.5～37.0 ℃，培養36 h以內，BCCY-22菌體量差異不顯著，說明BCCY-22生長適宜溫度范圍較寬；32.5 ℃培養48 h時，BCCY-22培養液OD600顯著高于其他溫度下培養液OD600，菌體量最高；隨著培養時間的增加，在37.0 ℃和41.5 ℃較高溫度培養下，菌體不穩定，數量下降（圖2）。綜合生長速率和生物量指標，BCCY-22適宜的培養溫度范圍為23～32.5 ℃。

2.2.2 發酵培養基初始pH的優化結果 菌株BCCY-22在初始pH為5.5培養基中，菌體生長緩慢，60 h時，菌體量達到最大，之后OD600值開始下降，在初始pH為6.5的培養基中，生長較快，培養48 h達到穩定期，生物量最大。培養基初始培pH值6.5和7.5，60 h內BCCY-22培養液OD600不顯著；培養基初始pH值為8.5和9.5時，培養24 h對BCCY-22生長無顯著影響（圖3）。綜合培養基初始pH對菌株BCCY-22影響，BCCY-22菌株在初始pH為6.5的培養基中生長較快，有利于獲得最大的生物量。

2.2.3 接種量的優化結果 接種量對菌體生長有一定影響，在24 h內，接種量為3%時BCCY-22的菌體數量顯著高于其他處理組；培養至36 h，BCCY-22的菌體數量接種量為3%和1%差異不顯著，但顯著高于其他處理組（圖4）。綜合考慮生長速率和生物量指標，接種量以3%為宜。

2.2.4 裝瓶量的優化結果 在所有的處理組中，當裝瓶量為10%時，培養12 h的菌體數量顯著高于其他處理組；培養24 h時，裝瓶量為10%和20%兩者之間的菌體數量差異不顯著，但是顯著高于其他處理組，此時菌體數量最多；說明裝瓶量少，有利于菌體數量的快速增加（圖5），BCCY-22菌株對氧的需求較高。

2.3 發酵條件響應面試驗設計優化結果分析

響應面試驗結果見表2，利用統計軟件Minitab對試驗數據進行二次多項回歸擬合。多項式模型方程擬合的性質由確定系數R2（R-Sq）表達，其統計學上的顯著性由F檢驗確定。通過的RSREG（響應面回歸）過程進行數據分析，建立二次響應面回歸模型。結果表明，R-Sq=86.48%，R-Sq（預測）=11.52%，R-Sq（調整）=74.31%，說明經過調整后該模型能解釋74.31%的變化。表3為二次多項式回歸方差分析表，回歸、線性以及平方的P值小于0.05，模型失擬檢驗的P值大于0.05，說明回歸模型正確，不需要對回歸模型做出調整。表4為二次多項式回歸系數及其顯著性檢測結果，模型方程A、C、A2、C2、A與C、A與B以及B與C項的P值大于0.05，B、B2的P值分別為0.000、0.003，說明在這3個因素中，溫度以及裝瓶量對OD600值影響不顯著，培養基的初始pH對生物量影響顯著，并且3個因素之間交互作用不明顯。

表2 中心復合設計及試驗結果Table 2 Design and results of experiment

表3 二次多項式回歸方差分析Table 3 Quadratic polynomial regression variance test results

表4 二次多項式回歸系數及其顯著性檢驗Table 4 Quadratic polynomial regression coefficient and significance test

可以用以下回歸方程表示三個因素與生物量之間的關系：Y=-4.248 9+0.186 9A+0.804 9B+0.015 7C-0.003 1A2-0.044 7B2-0.000 2C2-0.007 0AB-0.000 2AC-0.000 3BC，其中A代表溫度、B代表培養基的初始pH、C代表裝瓶量。

pH、溫度的交互作用對OD600的響應曲面見圖6、7，當溫度一定的時，pH為2～6時，隨著pH的增加，生物量也隨之增加，變化較明顯；pH為6～8時，生物量變化不明顯。當pH一定時，溫度對生物量的影響不明顯。

溫度、裝瓶量的交互作用對OD600的響應曲面見圖8，當裝瓶量一定時，隨著溫度的上升，生物量增加，但是當溫度超過25 ℃左右時，生物量開始下降。當溫度一定時，隨著裝瓶量的增加，生物量增加，裝瓶量超過40%左右后，生物量隨著裝瓶量的增大而減小。溫度、裝瓶量的交互作用對OD600的等值線見圖9，當裝瓶量為40%時，溫度在20～26 ℃時，生物量可以達到0.8以上。

pH、裝瓶量的交互作用對OD600的響應曲面見圖10，當pH一定時，裝瓶量對生物量影響不明顯時。當裝瓶量一定時，隨著pH的上升，生物量增加，但是超過一定的pH時，生物量開始下降。pH、裝瓶量的交互作用對OD600的等值線見圖11，相較于裝瓶量，培養基的初始pH對生物量影響明顯。

通過對回歸方程分析當培養溫度為21.33 ℃，培養基的初始pH為7.27，裝瓶量為23.13%時可得到響應最大值。為了方便操作，培養溫度取21.5 ℃、培養基的初始pH為7.3、裝瓶量為23%，在此條件下重復3次試驗，此時培養基的OD600值為0.99。通過試驗證明，在這種條件下培養，菌體培養36 h后的OD600值為0.987，為理論預測值的99.70%，說明響應面模型可靠，為BCCY-22菌株的發酵提供了理論依據。

2.4 發酵時間的優化

發酵條件優化前，細菌生長較慢，發酵42 h進入穩定期，生物量達到最大，OD600=0.768；優化發酵條件后，細菌生長迅速進入對數生長期，在36 h時達到生物量最大，OD600=1.044；進入穩定期（圖12）。所以在優化的培養條件下，發酵時間以36 h為宜。蠟樣芽孢桿菌BCCY-22優化發酵后，縮短發酵時間6 h，生物量是優化前的135.94%。

3 討論與結論

蠟樣芽孢桿菌在自然界分布廣泛，是一種兼性厭氧或好氧的革蘭氏陽性菌[18]，是土壤微生物的重要組成部分[19]，其在植物根際土壤具有快速定殖的特征，可通過抑制病原菌的侵染和定殖來進行生物防治[20]；蠟樣芽孢桿菌具有超強的抗逆性，抵御外界不良因子和較強的環境適應能力與它產生的芽孢有關，芽孢在休眠期間可在酸堿環境、高溫等環境存活[21]。目前芽孢桿菌被廣泛應用于生物防治[22]，成為目前生防菌研究的重要對象。眾多研究表明，通過對生防菌培養條件和培養基成分的優化，可提高其生物量或促進生物活性物質產生，從而提高生防效果[23,24]。朱海云等[25]對抗獼猴桃細菌性潰瘍病蠟樣芽孢桿菌MA23進行發酵條件優化，確定了蠟樣芽孢桿菌MA23最佳發酵初始pH6.5、最佳發酵溫度為30 ℃、最佳接種量為8%、最佳搖床轉速為180 r·min-1；Chen等[26]對以富硒為有機硒源的蠟樣芽孢桿菌進行發酵工藝優化研究，結果表明，最佳發酵條件為接種量7%、發酵溫度33 ℃、搖床轉速170 r·min-1；尹艷楠等[27]對蠟樣芽孢桿菌NJSZ-13菌株進行響應面發酵優化，結果表明，最佳發酵條件為溫度28 ℃、發酵初始pH值7.5、接種量為2%、裝液量30%。上述一系列研究結果表明，不同蠟樣芽孢桿菌的最佳培養條件不同。

生防細菌菌株蠟樣芽孢桿菌BCCY-22對多種農作物線蟲病害具有防治效果，本研究單因素試驗結果表明，溫度、pH和裝瓶量對蠟樣芽孢桿菌BCCY-22菌株的生物量影響較大。通過響應面試驗結果分析和試驗驗證：生防細菌BCCY-22最佳發酵條件為發酵溫度21.5 ℃、初始pH 7.3、種子液接種量3%、裝瓶量23%、發酵時間36 h；比優化前發酵時間縮短了6 h，生物量是優化前的135.94%。對比不同蠟樣芽孢桿菌最適發酵條件，蠟樣芽孢桿菌BCCY-22的發酵溫度較低，這可能由于是菌株差異造成的，BCCY-22菌株最初是以小麥孢囊線蟲病為靶標篩選的生防菌，小麥孢囊線蟲侵染植物以春季孵化的二齡幼為主[28]，此時溫度較低，蠟樣芽孢桿菌BCCY-22可在較低的溫度快速生長繁殖，可能更有利于蠟樣芽孢桿菌BCCY-22發揮其生防潛能。本研究為蠟樣芽孢桿菌BCCY-22生物防治發酵產品開發奠定基礎。