草甘膦銨鹽誘導谷子雄性不育的轉錄組分析

郭瑞鋒，任月梅*，楊忠，劉貴山，任廣兵，張綬，朱文娟

（1.山西農業大學高寒區作物研究所，山西大同 037008；2.五寨縣農業農村局，山西忻州 036200）

谷子作為北方種植的主要雜糧作物，不僅具有抗旱、節水、耐貧瘠等特點，還是環境友好型作物。近年來,小米價格不斷提升，農業機械化水平越來越高，農民種植谷子的積極性空前高漲。由于高產、優質且適合加工的品種極其有限，需要不斷創制出新材料以滿足市場需求。而谷子雜種優勢利用比較緩慢，目前，谷子雜交種生產還沒有三系配套，主要利用兩系法及高度雄性不育系和溫光敏不育系育種[1]。目前，谷子的不育材料是受核基因控制的核雄性不育材料，在雜交制種時易出現不育株與可育株田間混雜，不易鑒別、雜種不純等問題[2]。利用溫光敏不育系育種，制種成本較高，因此在生產實踐上應用還比較窄。常規種的培育通常采用人工去雄、溫湯去雄[3]、太陽能殺雄[4]等方法，受環境和人為因素影響較大，存在雜交效率低等問題?；瘜W殺雄為谷子育種提供了新的方法。關于化學殺雄劑方面的研究在小麥、水稻、油菜、糜子等作物上有相關報道[5-8]，本課題組進行了谷子化學殺雄劑的篩選[9]，但化學試劑誘導谷子雄性不育的機理研究鮮有報道。

轉錄組是生物體及細胞在特定時空下完整的RNA 轉錄本，代表了表型與DNA 編碼信息之間的重要聯系[10]。轉錄組學是功能基因組學研究的重要組成部分，是在全基因組水平上研究基因功能以及基因結構，揭示基因表達、轉錄調控規律以及特定生物學過程分子機理的一門學科[11]。隨著分子生物學和高通量測序技術的高速發展，轉錄組測序技術已逐漸成為轉錄組學研究中不可或缺的重要手段。

本課題組通過多年多點的化學殺雄劑篩選試驗得出草甘膦銨鹽可作為谷子適宜的化學殺雄劑[9]?；诖?，本研究以山西省忻州地區谷子主栽品種為供試材料，用3.75 mg·L-1草甘膦銨鹽殺雄后取其穗部，進行轉錄組測序分析，篩選差異表達基因，并對其進行GO 功能注釋和KEGG 代謝通路分析；同時測定有效殺雄植株體內的抗性淀粉、可溶性糖、赤霉素（gibberellin，GA）和生長 素（indole-3-acetic acid，IAA）含量，以期從生理生化和分子水平探索草甘膦銨鹽誘導谷子雄性不育的機理，為谷子雜種優勢利用奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

轉錄組測序供試材料為山西農業大學高寒區作物研究所審定品種大同27 號，生理指標測定供試材料為大同27號、大同34號和農家種大白谷均由本課題組保存。

1.2 試驗地點及材料的處理

試驗于2019—2020 年在山西省農業科學院（現山西農業大學）高寒區作物研究所毛皂試驗地進行。

于2019 年5月上旬播種，5～6 葉期定苗，日常管理同常規。試驗采用完全隨機區組設計。處理組采用化學試劑草甘膦銨鹽對大同27 號谷穗進行化學殺雄；未噴施藥劑的空白處理作為對照。處理組于抽穗始期進行噴藥，采用小型噴霧器噴施3.75 mg·L-1草甘膦銨鹽溶液，均勻噴濕花序，單穗受藥量為9～10 mL。在噴藥處理組中又分別設置噴藥后套袋自交和噴藥后套袋飽和授粉2 種方式。在抽穗后開花前，每個處理選取長勢整齊一致的10 穗進行標記，每處理2 次重復。噴藥后套袋自交處理記作S1、S2；噴藥后套袋飽和授粉處理記作P1、P2；正常生長的未噴藥對照記作CK1、CK2。

1.3 生理指標的測定

于谷子成熟期，分別采集未噴藥的正常生長植株和噴施草甘膦銨鹽后的套袋自交、套袋飽和授粉谷穗各3 個，應用酶聯免疫分析試劑盒（上海酶聯生物），采用雙抗體夾心法分別測定谷穗樣品中的抗性淀粉、可溶性糖、赤霉素、生長素的含量[12]。

1.4 轉錄組測序

1.4.1 RNA 的提取 通過Oligo (dT) 磁珠（百邁格生物）富集總RNA 中帶有polyA 結構的mRNA，采用離子打斷的方式，將RNA 打斷為200～300 bp 片段。以RNA 為模板，用6 堿基隨機引物和逆轉錄酶合成cDNA 第一鏈，并以第一鏈cDNA為模板進行第二鏈cDNA的合成。

1.4.2 文庫構建、檢測和轉錄組測序 RNA 進行抽提、純化后構建文庫。建庫之后，采用第二代測序技術（next-generation sequencing，NGS）基 于Illumina HiSeq 測序平臺進行雙末端（paired-end，PE）測序，由上海派森諾基因科技有限公司完成。

1.5 數據分析

1.5.1 參考基因組 使用Tophat 2 軟件，以xiaomi基因組 為參考 基因組(http:∕∕sky.sxau.edu.cn∕MDSi.htm)，參考Ensembl、GO、KEGG 數據庫進行基因組注釋。

1.5.2 有參轉錄組分析 將原始數據過濾后得到的高質量序列（clean data）比對到該物種的參考基因組上。根據比對結果，計算每個基因的表達量[13]。在此基礎上，進一步對樣品進行表達差異分析[13]和富集分析?；虮磉_量采用RPKM（reads per kilo bases per million reads）值。采用DESeq 軟件對基因表達進行差異分析，將差異表達倍數≥2 且P值＜0.05 的基因定為差異表達基因（differentially expressed gene,DEG)。

2 結果與分析

2.1 轉錄組測序數據評估

對測試數據中包含的一些帶接頭、低質量的reads進行過濾，并將測得的reads與參考基因組進行比對，結果（表1）表明，高質量序列堿基數達到6 G以上，且高質量序列的占比和高質量序列堿基占比均超過98%。Q20堿基識別準確率在99%以上的堿基占比大于95.96%；Q30 堿基識別準確率在99.9%以上的堿基占比大于90.48%。比對上參考基因組的序列占總數的73.23%以上。由此表明，測序數據質量較好，參考基因組選擇較合適。

表1 原始數據統計Table 1 Raw data statistics

2.2 差異表達基因篩選

差異表達基因篩選結果如表2 所示。草甘膦銨鹽處理后套袋自交組（S1）和未處理對照組（CK1）間的差異表達基因為797 個，其中上調表達基因296 個，占37.14%；下調表達基因501 個，占62.86%。草甘膦銨鹽處理后套袋飽和授粉組（P1）和未處理對照組（CK1）間的差異表達基因為3 072個，其中上調表達基因1 513個，占49.25%；下調表達基因1 559 個，占50.75%。草甘膦銨鹽處理后套袋自交組（S1）和套袋后飽和授粉組（P1）間的差異表達基因為169 個，其中上調表達基因56 個，占33.14% ；下調表達基因113 個，占66.86%。

表2 差異表達基因數量Table 2 Number of differentially expressed genes

2.3 差異表達基因的GO分析

S1 處理較對照相比，有645 個差異表達基因獲得GO 功能分類，包括405 個下調表達基因和240 個上調表達基因（圖1 與表3）。在分子功能分類中，參與水解酶活性的差異表達基因共199 個；作用于糖基鍵的顯著富集基因共37 個，其中下調31 個，上調6 個；水解O 糖基化合物的顯著富集基因共34 個，其中下調基因29 個，上調基因5 個；參與氧化還原酶活性的顯著差異表達基因共29 個，其中18 個下調表達，11 個上調表達；與鐵離子結合的差異表達基因共30 個，其中19 個上調表達，11 個下調表達。在生物過程分類中，參與二糖生物合成過程的差異表達基因為8 個，均為下調表達；與激素代謝過程有關的差異表達基因為13 個，其中11 個下調表達；與激素生物合成過程有關的差異表達基因為4 個，其中2 個下調表達。在細胞組分分類中，主要涉及細胞壁（26 個）、外部封裝結構（26 個）、植物型細胞壁（11 個）等。各功能分類中的差異表達基因數量均為下調基因大于上調基因，尤其是生物工程分類中富集到的與二糖生物合成過程、海藻糖生物合成過程、海藻糖代謝、低聚糖生物合成過程有關的差異基因均為下調表達。

圖1 差異表達基因GO富集分析Fig.1 Go enriched analysis of differentially expressed gene

表3 差異表達基因顯著富集的GO分類Table 3 GO classification for the significant enrichment of differentially expressed genes

2.4 樣品差異表達基因的KEGG分析

通過KEGG 富集分析，共建立了138 條通路，圖2列出了P值最小的前20條，差異表達基因數量以點的大小來表示，不同的P值以顏色區分。與未處理對照相比，草甘膦銨鹽處理后谷穗差異表達基因中涉及植物激素信號轉導（plant hormone signal transduction）的最多，為19 個，其 中，Si3G17190-生長素反應蛋白IAA18、Si2G22440-蛋白質TIFY10c、Si9G15750-轉錄因子PIF1、Si1G34880-促分裂原激活的蛋白激酶激酶5、Si1G25820-生長素反應蛋白SAUR36的基因上調表達，Si3G37640-轉錄因子PIF4、Si2G37490-可能的吲哚-3-乙酸-酰胺基合成酶GH3.8、DELLA蛋白（GA）等14個編碼基因下調表達；其次是淀粉和蔗糖代謝途徑(starch and sucrose metabolism)，為16個，其中，Si7G17790-i7 葡萄糖苷酶18、Si9G12460-i9 葡萄糖苷酶7、Si7G19410-i7果糖呋喃糖苷酶1、Si1G18670-1,4-α-葡聚糖支化酶2,葉綠體∕淀粉體、Si3G11180-己糖激酶-7等14個編碼基因下調表達。

圖2 差異表達基因KEGG 富集散點圖Fig.2 Scatter plot of differential gene KEGG enrichment

另一方面，二萜生物合成（diterpenoid biosynthesis）（7 個）、淀粉和蔗糖代謝（starch and sucrose metabolism）（16 個）、植物激素信號轉 導（plant hormone signal transduction）（19 個）、氰氨基 酸代謝（cyanoamino acid metabolism）（3 個）的P值最小，說明這些通路的富集程度較高。

2.5 草甘膦銨鹽處理后谷穗淀粉和可溶性糖含量的變化

由圖3 可知，大同27 號、大同34、大白谷在草甘膦銨鹽處理后，淀粉含量降低，其中，自交組的淀粉含量平均為42.16 mg·g-1，3 個品種均顯著低于對照；草甘膦銨鹽處理后可溶性糖含量較對照也有所降低，但差異不顯著。這與差異表達基因的KEGG 富集分析結果一致，淀粉和可溶性糖代謝途徑相關基因下調表達，可能引起糖代謝的紊亂，影響營養物質向小孢子的運輸，從而導致雄性不育。

圖3 草甘膦銨鹽處理后谷穗的淀粉和可溶性糖含量Fig.3 Contents of spike starch and soluble sugar after glyphosate ammonium treatment

2.6 草甘膦銨處理后谷穗中植物激素GA和IAA含量的變化

由圖4 可知，在草甘膦銨鹽處理后，大同27 號、大同34 和大白谷谷穗中的GA 含量顯著降低，其中，自交組平均為495.2 pmol·g-1，授粉組平均為513.7 pmol·g-1。這與差異表達基因的KEGG富集分析結果一致，下游調控育性的基因表達量下調，導致GA 含量降低，使絨氈層異常伸長，花粉壁形成受阻，從而影響花粉育性。

在草甘膦銨鹽處理后，除大白谷套袋自交組外，處理組谷穗中IAA 含量較對照顯著增加（圖4）。其中，3 個品種CK 組的IAA 含量平均為0.063 μmol·g-1，自交組平均為0.099 μmol·g-1,授粉組平均為0.110μmol·g-1。

圖4 草甘膦銨鹽處理后谷穗的GA和IAA含量Fig.4 Contents of GA and IAA in grain ears after glyphosate ammonium salt treatment

3 討論

本研究通過草甘膦銨鹽誘導谷子雄性不育的轉錄組學分析發現，谷穗對草甘膦銨鹽處理的響應基因顯著富集于植物激素信號轉導通路和淀粉、蔗糖代謝途徑，說明草甘膦銨鹽誘導谷子雄性不育可能主要是由于差異表達基因對以上2 個生物代謝過程調控引起的。

研究表明，小麥、水稻、棉花等農作物雄性不育與其內源激素的失調密切相關[14-16]。本研究基于KEGG 富集分析發現，涉及植物激素信號轉導途徑的差異表達基因最多，為19 個，其中Si3G17190-生長素反應蛋白IAA18、Si2G22440-蛋白 質TIFY10c、Si9G15750-轉錄因 子PIF1、Si1G34880-促分裂原激活的蛋白激酶激酶5、Si1G25820-生長素反應蛋白SAUR36 的編碼基因上調表達；Si3G37640-轉錄因子PIF4、Si2G37490-可能的吲哚-3-乙酸-酰胺基合成酶GH3.8、DELLA蛋白（GA）等14個編碼基因下調表達，這些差異表達基因的表達可能導致谷子內源激素平衡失調。

張凱等[17]研究發現，化學殺雄劑2號處理后水稻花藥GA3含量顯著低于對照。本研究采用草甘膦銨鹽處理谷穗后，3 個谷子品種的GA 含量均較對照顯著降低。由此推測GA 含量的降低可能是影響花粉育性的因子之一[18]，由于DELLA 蛋白（GA）的下調表達，GA含量降低導致絨氈層異常伸長，花粉壁形成受阻，從而影響花粉育性。本研究還發現，草甘膦銨鹽處理谷穗后，IAA 的含量較對照顯著增加，由此推斷IAA 水平的失衡也是引起植物雄性不育的原因之一。丁澤琴[19]研究表明茄子不育系的花藥中IAA 含量高于可育系。Horner 等[20]研究表明，IAA 的高水平累積可誘導乙烯代謝，從而導致植物雄性不育。張愛民等[21]研究表明，無論是小麥核質互作雄性不育還是化學雜交劑誘導的小麥雄性不育都與IAA含量有關。

本研究表明，草甘膦銨鹽處理谷穗后，涉及淀粉和蔗糖代謝途徑的差異表達基因也較多，為16 個，其 中Si7G17790-β -葡萄糖苷酶18、Si9G12460-β-葡萄糖苷酶7、Si7G19410-β-果糖呋喃糖苷酶1、Si1G18670-1,4-α-葡聚糖支化酶2,葉綠體∕淀粉體、Si3G11180-己糖激酶-7 等14 個基因顯著下調表達；同時，大同27、大同34 和大白谷3 個品種在草甘膦銨鹽處理后套袋自交的谷穗中淀粉和可溶性糖含量較對照顯著降低。糖含量的高低可能是決定花粉育性的關鍵因素[22]，在植物小孢子發育早期，花藥生長快速、代謝活躍，且是花器官中庫強度最高的部位，大量的糖被運輸到花藥中以支持小孢子的早期發育[23]，如果這時遇到非生物脅迫，如化學殺雄劑處理等，花藥的淀粉和可溶性糖含量顯著降低，花粉粒數量減少，活性降低，從而導致雄性不育，與前人研究結果一致[24]。Li 等[25]用單嘧磺隆鈉誘導甘藍型油菜，發現影響其碳水化合物和脂質代謝，可溶性糖含量降低。郝媛媛[26]通過分析測定BAU-9403 誘導的小麥雄性不育株籽粒的蔗糖、淀粉、可溶性糖含量等指標，發現化學殺雄劑誘導的植株其籽粒對碳水化合物的轉化和利用能力較差，且淀粉累積速率也明顯低于正常株。GO分析得出，在細胞組分功能分類中，較多的差異表達基因顯著富集到細胞壁、外部封裝結構、植物型細胞壁等組分結構。推測草甘膦銨鹽處理谷穗后可能影響胞外信號分子及糖類等物質從細胞膜到液泡的運輸，同時引起激素合成與代謝的改變，從而導致谷穗雄性不育[27]。