富含γ-氨基丁酸非乳益生菌香蕉發酵飲料工藝研究

莫小群，王 雅，陳顯玲*，農秀麗，盧麗婷，楊福川，蘇 龍,2

（1.廣西科技師范學院食品與生化工程學院，廣西來賓 546199；2.廣西糖資源工程技術研究中心，廣西來賓 546199）

香蕉是一種重要的熱帶、亞熱帶水果，具有較高的營養和藥用價值[1]。廣西作為我國香蕉的主產區，2020 年香蕉產量達337.61 萬t，居全國第2 位[2]。香蕉質地柔軟，主要以鮮食為主，可常年供應，但市場價格波動大、容易腐爛，嚴重打擊了農民種植香蕉的積極性。隨著香蕉產量的逐年增加，鮮食過剩的狀況越來越嚴重，因此，香蕉的深加工是香蕉產業可持續發展的必由之路。香蕉的深加工產品主要有香蕉片[3-4]、香蕉粉[5]、香蕉酒[6-7]、香蕉醋[8]、香蕉飲料[9]、香蕉酸奶[10]、香蕉面膜[11]等。目前香蕉益生菌發酵飲料主要以益生菌乳飲料為主，關于香蕉益生菌發酵非乳飲料的相關報道較少，主要是針對成品香蕉乳酸飲料口感等問題進行研究改進[12-14]，沒有涉及益生菌飲料中γ-氨基丁酸含量和活菌數的優化問題。

γ-氨基丁酸（γ-amino butyric acid，GABA），化學名為4-氨基丁酸，廣泛分布于動植物體內。植物如豆屬、中草藥等的種子、根莖和組織液中都含有γ-氨基丁酸，是一種非蛋白質組成的氨基酸[15]。γ-氨基丁酸屬強神經抑制性氨基酸，具有降血壓[16]、預防糖尿病[17]、免疫調節[18]、減緩癲癇病[19]、增強腦活力[20]、改善肝腎功能[21-22]等功效。目前，GABA 的制備主要以微生物發酵法為主，包括植物乳桿 菌（Lactobacillus plantarum）[23]、發 酵 乳 桿 菌（L.fermentum）[24]、對雙歧桿菌（Bifidobacterium）[25]、副干酪乳桿菌（L.paracasei）[26]等。林楊等[27]利用戊糖乳桿菌為發酵菌株，通過條件的優化得到一款GABA 含量為1.98 g/L的乳酸菌飲品。韓嘯[28]以短乳桿菌DL1-11 為出發菌株，通過發酵條件的優化，得到一種GABA 含量是優化前2.37 倍的功能性發酵乳。目前，對富含GABA 的香蕉非乳發酵飲料相關研究較少。

本試驗以廣西本地的香蕉為材料制作非乳益生菌香蕉發酵飲料，以飲料中GABA 含量和活菌數為評價指標，進行工藝條件的優化，旨在豐富香蕉深加工產品類型，為香蕉產業精深加工提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

香蕉為市售廣西‘浦北矮香蕉’；植物乳桿菌（L.plantarum）GDMCC 1.1516、發酵乳桿菌（L.fermentum）GDMCC 1.1796、短乳桿菌（L.breris）GDMCC 1.1800、干酪乳桿菌（L.casei）GDMCC 1.80，廣東省微生物菌種保藏中心；保加利亞乳桿菌（L.bulgaricus）CCTCC CB 20082294，中國典型培養物保藏中心；果膠酶（30 000 U/g），南寧龐博生物工程有限公司；一級白砂糖，廣西來賓湘桂糖業有限公司；MRS 肉湯培養基，廣東環凱微生物科技有限公司；L-谷氨酸鈉（食品級），河北百味生物科技有限公司。

硼酸、苯酚、次氯酸鈉、無水乙醇，均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司；γ-氨基丁酸（GABA）標準品，合肥博美生物科技有限責任公司。

UV1050 紫外可見分光光度計，上海天美科學儀器有限公司；HH-s 數顯恒溫水浴鍋，江蘇省金壇市醫療儀器廠；PHS-3E pH 計，上海儀電科學儀器股份有限公司；ZSD-1090 型生化培養箱，上海智城分析儀器制造有限公司；A11EC 多功能打漿機，九陽股份有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 香蕉發酵飲料工藝流程

參考蘇龍等[29]的工藝進行改進。新鮮香蕉→挑選→去皮、切塊→打漿→護色→酶解→離心→成分調整→滅菌、冷卻→接種發酵→成品。

1.2.2 工藝操作要點

（1）選材、打漿、護色

挑選無病蟲害的新鮮香蕉，剝皮切成5 cm 長的塊狀，以香蕉和純凈水的質量比為1∶5（g/g）混合，放入打漿機中打漿，再加入0.08%維生素C 進行護色。

（2）酶解

加入0.3%果膠酶，調整pH 至5.0，于50 ℃水浴5 h，之后在10 000 r/min 條件下離心20 min，取上清液，即得香蕉汁。

（3）成分調整

在酶解后的香蕉果汁中加入白砂糖攪拌，待白砂糖完全溶解后，用糖度計對總糖度進行調整，使香蕉汁總糖度為10%；加入碳酸氫鈉或檸檬酸調pH 至6.5。

（4）滅菌、冷卻

調整好的香蕉汁于89 ℃殺菌15 min，冷卻后于4 ℃條件下密封貯藏，備用。

（5）發酵

菌株活化：將植物乳桿菌和短乳桿菌菌株接種至10 mL MRS 液體培養基中，于35 ℃下培養24 h，按接種量10%（V/V）接種至100 mLMRS 液體培養基中，于35 ℃下培養24 h，備用。

接種發酵：取活化好的植物乳桿菌和短乳桿菌，活菌數均為7.0 lg(CFU/mL)，按體積比為1∶1，接種至殺菌冷卻后的香蕉汁中，置于恒溫培養箱中發酵，即得成品。

1.2.3 菌種的篩選

將植物乳桿菌、短乳桿菌、保加利亞乳桿菌、發酵乳桿菌、干酪乳桿菌，活菌數均為7.0 lg(CFU/mL)，按體積比為1∶1、接種量為3%分別接入調配好且滅菌的香蕉汁中，于35 ℃恒溫培養箱中發酵24 h，檢測GABA 含量和活菌數，篩選較優菌種[30]。

1.2.4 菌種比例的篩選

選擇植物乳桿菌和短乳桿菌，活菌數均為7.0 lg(CFU/mL)，植物乳桿菌∶短乳桿菌體積比設置為0∶1、1∶0、1∶1、1∶2、2∶1，進行不同比例菌種發酵試驗，接種量為3%，于35 ℃恒溫培養箱中發酵24 h，檢測GABA的含量和活菌數，篩選發酵菌種最優比例[30]。

1.2.5 香蕉飲料發酵單因素試驗

以GABA 含量和活菌數為檢測指標，考察L-谷氨酸鈉濃度（1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mg/mL）、接菌量（1%、2%、3%、4%、5%）、發酵時間（16、20、24、28、32 h）和發酵溫度（33、35、37、39、41 ℃）4 個因素對香蕉飲料發酵的影響[30]。其中發酵的初始條件為發酵溫度35 ℃、接菌量3%、發酵時間24 h。

1.2.6 響應面優化設計

在單因素試驗結果的基礎上，以GABA 產量和活菌數為響應值，根據Box-Behnken 設計原理，對接種量、發酵溫度、發酵時間進行三因素三水平響應面分析實驗，試驗設計見表1。

表1 香蕉發酵飲料響應面因素及水平表Table 1 Factors and levels of response surface design of the banana beverage

1.2.7 GABA 含量的檢測方法

γ-氨基丁酸含量的測定參考上官文菲等[31]的方法。取發酵樣品1 mL，加入1 mol/L 的NaCO3溶液0.1 mL，pH值10.0、0.2 mol/L 的硼酸鹽緩沖液0.5 mL，6%苯酚1 mL，混勻后室溫下在5 min 內加入5.2%NaClO 溶液1.0 mL，混勻，放置5～8 min。沸水浴10 min 后立刻冰水浴20 min，待溶液出現藍綠色后加入體積分數為60%的乙醇溶液2.0 mL，混勻后在冰水浴中放置30 min。以空白試劑為參比，在波長640 nm 處測定吸光度值，根據標準曲線計算得出樣品中GABA 含量。

1.2.8 活菌數的檢測方法

活菌數的檢測參考國標GB 4789.35—2016 進行。

1.3 數據處理

作圖和數據處理采用Orgin 8.5 軟件，響應面設計和分析采用Design-Expert 8.0.6 Trial 軟件。

2 結果與分析

2.1 菌種選擇

由圖1 可知，接種發酵24 h 后，單一菌種發酵產GABA 的能力由強到弱的排序為短乳桿菌、植物乳桿菌、干酪乳桿菌、發酵乳桿菌、保加利亞乳桿菌。活菌數由多至少的排序為植物乳桿菌、短乳桿菌、發酵乳桿菌、保加利亞乳桿菌、干酪乳桿菌。從產GABA 能力和活菌數來看，短乳桿菌和植物乳桿菌能力比其它菌株要強，故選用植物乳桿菌和短乳桿菌混合進行后續實驗優化。

圖1 不同菌種對GABA 含量和活菌數的影響Fig.1 Effects of different strains on GABA content and viable counts

2.2 菌種比例選擇

由圖2 可知，植物乳桿菌∶短乳桿菌比例為2∶1 或1∶2 混合發酵24 h 與單一菌種發酵相比，GABA 產量有所提高，活菌數沒有明顯增加。但植物乳桿菌和短乳桿菌比例為1∶1 時，GABA 產量有明顯的增加，活菌數也比單一菌種發酵多；可能是由于植物乳桿菌和短乳桿菌在生長過程中互相影響，共同促進發酵的進行，這與楊天予等[30]和康三江等[32]的研究結果相似。因此，選擇植物乳桿菌和短乳桿菌比例為1∶1 進行后續實驗。

圖2 菌種比例對GABA 含量和活菌數的影響Fig.2 Effects of strain ratio on GABA content and viable counts

2.3 單因素實驗結果

2.3.1L-谷氨酸鈉濃度對發酵的影響

由圖3 可知，隨著底物L-谷氨酸鈉濃度的增加，GABA 的含量快速增加，在底物L-谷氨酸鈉濃度為2.5 mg/mL 時，GABA 的含量達到最大值，為0.583 mg/mL；當底物濃度繼續增加時，GABA 的含量不再增加，分析其原因可能是因為此時的菌體已達到最大GABA 轉化率。故選擇2.5 mg/mL 的L-谷氨酸鈉作為發酵培養基底物添加量。從結果可知，底物濃度對GABA 含量的影響不大，故不作為后續響應面優化的因素。

圖3 L-谷氨酸鈉濃度對GABA 含量的影響Fig.3 Effects of sodium hydrogen glutamate concentration on GABA content

2.3.2 接種量對發酵的影響

由圖4 可知，隨著接種量的增加，GABA 含量和活菌數不斷增加；當接種量為4%時，GABA 含量和活菌數達到最大值，隨著接種量的繼續增加，GABA 含量和活菌數都呈下降趨勢。這是由于接種量增加，發酵前期菌株快速生長繁殖，營養成分消耗過快，發酵代謝產物GABA 和乳酸含量也相應增加，發酵液pH 降低，導致發酵后期營養成分匱乏，菌體生長代謝被抑制。故選擇接種量為4%進行后續實驗。

圖4 接種量對GABA 含量和活菌數的影響Fig.4 Effects of inoculum size on GABA content and viable counts

2.3.3 發酵溫度對發酵的影響

根據菌種保藏機構推薦，植物乳桿菌和短乳桿菌最適生長溫度為37 ℃，設計混合菌種發酵溫度優化。由圖5（見上頁）可知，在33～41 ℃之間，GABA 含量和活菌數均呈先增加后減小的趨勢。當溫度為39 ℃時，GABA 含量和活菌數均達到最大值，分別為0.559 mg/mL 和6.743 lg(CFU/mL)，說明39 ℃對混合菌種菌體生長和產物的分泌是最合適的，故選擇發酵溫度39 ℃。

圖5 發酵溫度對GABA 含量和活菌數的影響Fig.5 Effects of fermentation temperature on GABA content and viable counts

2.3.4 發酵時間對發酵的影響

發酵時間的長短對菌體的生長和代謝產物的分泌極為重要。由圖6 可知，發酵時間在16～24 h 范圍內，GABA 含量隨發酵時間的延長而快速增加，24～32 h 內，GABA 含量增加幅度緩慢。在16～24 h 內，活菌數隨著發酵時間的增加而直線上升，當發酵時間為24 h 時，活菌數達到最大值；隨著發酵時間的進一步延長，由于營養成分的消耗，發酵液pH 下降，菌體可能會自溶，故活菌數呈下降趨勢。綜合考慮活菌數和GABA 含量，發酵時間選擇24 h。

圖6 發酵時間對GABA 含量和活菌數的影響Fig.6 Effects of fermentation time on GABA content and viable counts

2.4 響應面實驗結果

2.4.1 回歸方程

實驗方案及實驗結果見表2，回歸模型方差分析見表3。

表2 響應面實驗方案及結果Table 2 Response surface design arrangement and experimental results

對表3 中數據進行回歸擬合，分別得到自變量與GABA 含量（Y1）和活菌數（Y2）的二次多項回歸方程為Y1=0.69+0.063A-0.024B+0.028C+2.5×10-4AB+0.015AC-0.030BC-0.031A2 -0.025B2-0.034C2。Y2=9.52+0.22A-0.28B-0.54C-0.44AB-0.021AC-0.69BC-0.82A2-0.83B2+0.04C2。

對該模型進行方差分析，結果如表3 所示，該回歸模型P1＜0.000 1、P2=0.000 2，方程模型達到極顯著，失擬項P1=0.220 1＞0.05、P2=0.066 7＞0.05，差異不顯著；該回歸模型的總決定系數=0.982 4=0.968 0；調整決定系數變異系數CV1=1.92、CV2=2.82；以上參數均說明該模型擬合程度好，實驗誤差小，故該回歸方程模型成立，可以用此模型對香蕉飲料發酵條件進行分析及預測。

2.4.2 響應面分析

由表3 可知，影響GABA 含量的因素按主次順序排列：接種量（A）＞時間（C）＞溫度（B），其中模型一次項接種量（A）、發酵溫度（B）和發酵時間（C）極顯著；二次項A2、B2、C2均處于極顯著水平；交互項BC 極顯著，AB、AC均不顯著。影響活菌數的因素按主次順序排列：時間（C）＞溫度（B）＞接種量（A），其中模型一次項發酵時間（C）極顯著，接種量（A）、發酵溫度（B）顯著；二次項A2、B2均處于極顯著水平，C2不顯著；交互項AB、BC 極顯著，AC不顯著。

表3 擬合二次多項式模型的方差分析Table 3 The fitted quadratic polynomial model of ANOVA

經Design-Expert 8.0.6 Trial 優化，通過對回歸模型求解方程得出香蕉飲料發酵的最佳條件為接種量4.62%，發酵溫度35.33 ℃，發酵時間24 h，在此條件下香蕉飲料的GABA 含量和活菌數預測值分別為0.746 mg/mL 和9.282 lg(CFU/mL)。

2.4.3 驗證試驗

在回歸模型求解方程的基礎上，考慮實際操作的可行性，修正得出香蕉飲料發酵的最佳條件為接種量5%，發酵溫度36 ℃，發酵時間24 h。進行3 組平行試驗，所得香蕉飲料中GABA 含量均值為0.783 mg/mL，活菌數均值為10.146 lg(CFU/mL)，與理論預測值的相對誤差為4.96%和9.30%，說明運用響應面法優化得到的模型參數準確可靠，能真實地反應各因素對香蕉飲料發酵的影響。

3 結論

本文通過單因素和響應面實驗對發酵型非乳益生菌香蕉飲料的條件進行了優化，確定了發酵型非乳益生菌香蕉飲料的最佳工藝條件為植物乳桿菌∶短乳桿菌=1∶1（按體積比），活菌數均為7.0 lg(CFU/mL)，接種量5%，發酵溫度36 ℃，發酵時間24 h，L-谷氨酸鈉添加量2.5 mg/mL。此條件下香蕉飲料的GABA 含量和活菌數均達到較高值，GABA 含量為0.783 mg/mL，活菌數均值為10.146 lg(CFU/mL)，大于T/CNFIA 131—2021 標準中活菌數的要求，成品飲料具有一定的香蕉氣味和滋味，無雜質。但本文以GABA 含量和活菌數為響應值進行工藝優化，對飲料的口感沒有充分考慮，導致發酵出來的香蕉飲料在口感上有所欠缺，如飲料香蕉香味不夠、顏色偏暗、酸味稍重，可能的原因是香蕉飲料在發酵過程中香蕉香氣分解，護色不夠，產生的乳酸偏多。下一步的實驗計劃以口感結合GABA 含量和活菌數對發酵型非乳香蕉飲料進行進一步的優化，以期獲得口感合適、GABA 含量和活菌數量滿足要求的新型香蕉發酵飲料，為廣西香蕉深加工產業發展提供技術支持。