新鮮黨參酵母菌固體發酵工藝優化及其有效成分、抗氧化活性研究

王燕萍 賈旭森 牛偉霞王艷崔方 胡芳弟?

（1.蘭州大學藥學院， 甘肅 蘭州730000； 2.東阿阿膠股份有限公司， 山東 聊城252000）

黨參是一種重要的藥食同源中藥，含多糖、黃酮、黨參炔苷、蒼術內酯Ⅲ等功效成分及氨基酸、蛋白質等營養成分［1］，具有健脾益肺、養血生津等功效，主要用于增強機體免疫力、改善胃腸道功能、提高學習和記憶能力等［2?3］。

發酵可改變中藥材活性成分含量及結構，常被用于其增效減毒方面［4?5］。中藥固體發酵是以中藥材為發酵基質，利用一種或多種菌種進行發酵的方法［6］，可增加其活性組分含量和活性［7?8］。

酵母菌是典型的糖菌，喜在含糖較高、偏酸性的環境中生長［9］，而新鮮黨參中富含糖分，可作為其天然營養體系。前期報道，新鮮黨參中多糖、黃酮、黨參炔苷等成分含量均高于加工后藥材［10］；預實驗表明，在不添加任何營養物質和水的情況下，酵母菌可充分利用新鮮黨參中的營養物質進行發酵并大量繁殖。因此，本實驗采用酵母菌固體發酵新鮮黨參，并對該工藝進行優化，以期為該藥材的開發利用提供新方法。

1 材料

1.1 儀器 安捷倫1260 高效液相色譜，購自美國安捷倫科技公司；UV?1700 紫外分光光度計，購自日本Shimadzu 公司；DHG9070A 電熱鼓風干燥箱，購自上海一恒科學儀器有限公司；CPA225D 電子分析天平、PH計，購自賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；無菌培養皿、接種環，購自廣州賽國生物科技有限公司；IS?RDD3 臺式恒溫振蕩器，購自美國精騏公司；H1650 高速離心機，購自湖南湘儀科技有限公司；FreeZone?6L 冷凍干燥機，購自美國Labconco 公司；LS?35LD 滅菌鍋，購自致微（廈門）儀器有限公司；破壁機，購自浙江蘇泊爾股份有限公司；750T 多功能粉碎機，購自上海市浦恒信息科技有限公司；25×16 血球計數板，購自上海市求精生化試劑儀器有限公司；S?433D氨基酸全自動分析儀、LCAK06／Na 磺酸基強酸性陽離子交換樹脂色譜柱，購自德國Sykam公司；N?WYVAP 112 型氮吹儀，購自美國Organomation 公司；S220?K 型酸度計，購自瑞士Mettler?Toledo 公司。

1.2 試劑與藥物 新鮮黨參采自甘肅省臨洮縣，經甘肅省中醫藥大學附屬醫院楊錫倉主任藥師鑒定為桔梗科植物黨參Codonopsis pilosula（Franch.）Nannf 的新鮮根。高活性干酵母菌（釀酒酵母屬）Saccharomyces cerevisiae，購自安琪酵母股份有限公司。蛋白胨、酵母膏，購自北京奧博星生物技術有限公司；瓊脂，購自北京索萊寶科技有限公司；葡萄糖（批號110833?200302），購自中國食品藥品檢定研究院。蘆丁對照品（批號05?1001），購自上海中藥標準化研究中心；氨基酸對照品（包括丙氨酸Ala、精氨酸Arg、天冬氨酸Asp、半胱氨酸Cys、谷氨酸Glu、甘氨酸Gly、組氨酸His、異亮氨酸Ile、亮氨酸Leu、賴氨酸Lys、蛋氨酸Met、苯丙氨酸Phe、脯氨酸Pro、絲氨酸Ser、蘇氨酸Thr、酪氨酸Tyr、纈氨酸Val，批號SLBM6769V），購自美國Sigma?Aldrich 公司。茚三酮、色譜純甲醇，購自天津市富宇精細化工有限公司；其他試劑均為分析純；水為超純水。

2 方法

2.1 酵母菌固體發酵工藝建立

2.1.1 培養基制備 YEPD 固體培養基配方為蛋白胨2%、酵母膏1%、葡萄糖1%、瓊脂2%，pH自然，在120 ℃下高壓蒸汽滅菌20 min；YEPD 液體培養基配方為蛋白胨2%、酵母膏1%、葡萄糖1%，pH 自然，在120 ℃下高壓蒸汽滅菌20 min。

2.1.2 菌種活化 將菌種接種于YEPD 固體培養基中，活化48 h 備用。

2.1.3 液體培養擴繁 將活化菌種接種于YEPD液體搖瓶培養基中，在溫度30 ℃、轉速220 r／min條件下培養24 h，使其產生大量菌體，作為液體菌種。

2.1.4 發酵產物制備 將新鮮黨參用破壁機多次打碎至無較大顆粒，置于500 mL 錐形瓶中，在120 ℃下高壓蒸汽滅菌20 min，取出，靜置至室溫，接入酵母菌種，置于恒溫恒濕箱中避光發酵，發酵產物置于40 ℃電熱鼓風干燥箱中干燥，即得。

2.2 發酵終點確定 將酵母菌按一定比例接種在滅菌后的新鮮黨參基質中進行發酵，在不同時間點取出菌質，測定pH值，再取不同時間點發酵產物，測定浸出物含量。

2.2.1 醇浸出物、水浸出物含量測定 按照2020年版《中國藥典》四部2201 項下熱浸法［11］進行測定，其中水為蒸餾水，測定醇浸出物時以稀乙醇替代蒸餾水。

2.2.2 pH 值測定 采用PH 計測定發酵過程中菌質pH 值。

2.3 酵母菌固體發酵工藝優化 文獻［12］ 報道，酵母菌最適生長溫度為30 ℃，新鮮黨參含水量為66.6%，在此基礎上以含水量（A）、溫度（B）、加菌量（B）為影響因素，設計三因素三水平L9（33）正交試驗，具體見表1。預實驗發現，新鮮黨參發酵后指標成分黃酮、多糖、黨參炔苷含量分別增加了75.45%、46.35%、44.68%，即黃酮含量變化最明顯，故選擇其作為評價指標。

表1 因素水平Tab.1 Factors and levels

2.3.1 黃酮供試品溶液制備 精密稱取新鮮黨參、滅菌黨參適量（均相當于干藥材1.0 g）及1.0 g發酵黨參粉末，置于具塞三角瓶中，10 倍量甲醇超聲提取3次，每次30 min，濾過，合并濾液，在60 ℃下減壓蒸干，甲醇復溶并定容至10 mL 量瓶中，即得，每種樣品平行3 份。

2.3.2 含量測定 參考文獻［13］ 報道，將供試品溶液稀釋適當倍數，采用紫外可見分光光度法測定吸光度，以其為縱坐標，溶液質量濃度為橫坐標繪制標準曲線，計算含量。

2.4 發酵前后微觀結構變化研究 參考文獻［14］報道，采用掃描電子顯微鏡（SEM）進行觀察。

2.5 發酵前后有效成分含量變化研究

2.5.1 總糖、多糖、低聚糖

2.5.1.1 供試品溶液制備 精密稱取新鮮黨參、滅菌黨參適量（均相當于干藥材1.0 g）及1.0 g發酵黨參粉末，95%乙醇加熱回流提取2 次進行脫脂，每次1 h，濾過，藥渣干燥，加10 倍量水煎煮3次，每次40 min，合并濾液，在70 ℃下減壓濃縮至25 mL，作為總糖供試品溶液。取適量，加95%乙醇至終體積分數為80%，在4 ℃下靜置24 h后離心，取上清液，置于水浴鍋上蒸干，加水溶解并定容至25 mL 量瓶中，作為低聚糖供試品溶液。將沉淀用水溶解并定容至25 mL 量瓶中，作為多糖供試品溶液。上述溶液均平行制備3 份。

2.5.1.2 含量測定 參考文獻［15］ 報道，采用紫外可見分光光度法測定吸光度，以其為縱坐標，溶液質量濃度為橫坐標繪制標準曲線，計算含量。

2.5.2 三萜

2.5.2.1 供試品溶液制備 精密稱取新鮮黨參、滅菌黨參適量（均相當于干藥材1.0 g）及1.0 g發酵黨參粉末，置于250 mL 具塞三角瓶中，加100 mL 95%乙醇超聲提取3次，每次30 min，濾過，合并濾液，在60 ℃下減壓濃縮至干，30 mL氯仿溶解，飽和NaHCO3溶液萃取3次，將NaHCO3層用6 mol／L HCl 調節pH 值至3～4，最后用氯仿萃取3次，合并氯仿層，在60 ℃下減壓蒸干，用無水乙醇溶解并定容至50 mL 量瓶中，即得。

2.5.2.2 含量測定 參考文獻［16］ 報道，將供試品溶液稀釋適當倍數，采用紫外可見分光光度法測定吸光度，以其為縱坐標，溶液質量濃度為橫坐標繪制標準曲線，計算含量。

2.5.3 黨參炔苷

2.5.3.1 供試品溶液制備 精密稱取新鮮黨參、滅菌黨參適量（均相當于干藥材1.0 g）及1.0 g發酵黨參粉末，加10 倍量甲醇回流提取3次，每次40 min，濾過，濾液濃縮后定容至10 mL 量瓶中，即得。

2.5.3.2 含量測定 參考文獻［13］ 報道，將供試品溶液稀釋適當倍數，采用HPLC 法測定。

2.5.3.3 色譜條件參考文獻 ［13］ 報道，DiamonsiL C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相乙腈?水（26∶74）；體積流量1 mL／min；柱溫30 ℃；檢測波長267 nm；進樣量10 μL。

2.5.4 氨基酸

2.5.4.1 供試品溶液制備 精密稱取適量新鮮黨參（相當于干藥材0.5 g）、滅菌黨參（相當于干藥材1.0 g）及1.0 g 發酵黨參粉末，置于水解管中，加入6 mol／L 鹽酸10 mL，再加入1%苯酚溶液3滴，將水解管置于－20 ℃冰箱中冷凍5 min 后通氮氣封口，置于110 ℃烘箱中水解22 h，取出放冷至室溫，打開水解管，水解液過濾后吸取0.5 mL至10 mL EP 管內，氮氣吹干，殘留物用6 mL稀釋液溶解，0.22 μm 微孔濾膜過濾，即得。

2.5.4.2 含量測定 參考文獻［17］ 報道，采用HPLC 法測定。

2.5.4.3 色譜條件 LCAK 06／Na 型磺酸基強酸性陽離子交換樹脂色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動相緩沖液A、緩沖液B、再生液C；衍生化試劑茚三酮；體積流量A 泵（洗脫泵）0.45 mL／min，M 泵（衍生泵）0.25 mL／min；檢測波長440 nm（脯氨酸）、570 nm（其余氨基酸）；進樣量50 μL。

2.6 發酵前后抗氧化活性變化研究

2.6.1 供試品溶液制備 取 “2.5.1.1”項下95%乙醇提取物，在60 ℃下減壓濃縮至25 mL，即得。

2.6.2 清除率測定

2.6.2.1 DPPH 自由基 參考文獻［18］ 報道，取稀釋5 倍后的供試品溶液、80 μg／mL DPPH 溶液各1 mL，搖勻，避光反應30 min，以蒸餾水為空白調零，在517 nm 波長處測定吸光度A1；以稀乙醇代替供試品溶液，同法測定吸光度A0，計算清除率，公式為清除率＝（1－A1／A0）×100%，重復3次，取平均值。

2.6.2.2 超氧陰離子自由基 參考文獻［19］報道，取供試品溶液1 mL，加 入 Tris?HCl 緩沖液（16 mmol／L，pH 8.0）、NADH?2Na（338 mmol／L）、PMS（30 mmol／L）、NBT（72 mmol／L）各1 mL，混勻后室溫反應5 min，以蒸餾水為空白調零，在560 nm 波長處測定吸光度A1，以稀乙醇代替供試品溶液，同法測定吸光度A0，計算清除率，公式為清除率＝（1－A1／A0）×100%，重復3次，取平均值。

2.6.2.3 羥自由基 參考文獻［20?21］ 報道，取供試品溶液0.2 mL，依次加入反應液（20 mmol／L pH 7.4 的磷酸鹽緩沖液、2.67 mmol／L 脫氧核糖、100 mmol／L EDTA）0.6 mL 及0.4 mmol／L 硫酸亞鐵胺溶液、10 mmol／L 過氧化氫溶液各0.2 mL，37 ℃水浴加熱15 min，再加入1% 硫代巴比妥酸（TBA）溶液、2% 三氯乙酸（TCA）溶液各1 mL終止反應，沸水浴加熱15 mim 后冷卻至室溫，以蒸餾水為空白調零，在532 nm 波長處測定吸光度A1；以稀乙醇代替供試品溶液，同法測定吸光度A0，計算清除率，公式為清除率＝（1－A1／A0）×100%，重復3次，取平均值。

3 結果

3.1 發酵終點確定 發酵過程中會產生酒精，對酵母菌有毒害作用，酵母菌呼吸產物積累使pH 值發生改變而不再適宜其生長，故pH 值可作為判斷發酵終點的指標。由圖1 可知，pH 值在48 h 后趨于穩定，可認為發酵達到終點。

圖1 不同發酵時間pH 值變化Fig.1 pH value changes at different fermentation time

另外，酵母菌呼吸時會消耗營養物質，導致后者不足，很難維持前者代謝需求，從而使反應速率降低或停止，故水浸出物、醇浸出物含量也可作為判斷發酵終點的指標。由圖2 可知，醇浸出物、水浸出物含量在48 h 后趨于穩定，故確定發酵時間為48 h。

圖2 不同發酵時間醇浸出物（A）、水浸出物（B）含量變化Fig.2 Content changes of alcohol extract（A）and water extract（B）at different fermentation time

3.2 酵母菌固體發酵工藝優化 表2 顯示，各因素影響程度依次為B（溫度）＞C（加菌量）＞A（含水量）。方差分析見表3，可知因素B有顯著影響（P＜0.05），而A、C無顯著影響（P＞0.05），綜合考慮工藝的操作性及成本，最終確定最優工藝為A1B2C2，即發酵溫度30 ℃，含水量66%，加菌量10%。

表2 試驗設計與結果（n＝3）Tab.2 Design and results of tests（n＝3）

表3 方差分析Tab.3 Analysis of variance

按照上述優化工藝制備3 批樣品，測得黃酮含量分別為1.23%、1.22%、1.18%，平均值為1.21%，RSD 為2.19%，表明該工藝穩定可行。

3.3 發酵前后微觀結構變化 圖3 顯示，發酵可使新鮮黨參的致密組織變成了疏松多孔的結構。

圖3 各樣品SEM 圖Fig.3 SEM images of various samples

3.4 發酵前后有效成分含量變化 表4 顯示，與新鮮黨參比較，發酵黨參中低聚糖、總糖含量分別降低7.56%、35.95%，前者含量降低的原因是酵母菌以其為糖源進行生長代謝活動，進而使后者含量降低；黃酮、多糖、三萜、黨參炔苷、總氨基酸含量分別升高70.27%、47.92%、128.00%、41.38%、69.90%；除了胱氨酸外，其余16 種氨基酸含量均升高，其中12 種增加率在60%以上，同時藥用氨基酸（Glu、Asp、Arg、Gly、Phe、Tyr、Met、Leu、Lys）、人體必需氨基酸（Thr、Val、Met、Phe、Lys、Ile、Leu）含量分別升高66.39%、74.16%。

表4 發酵前后有效成分含量變化（n＝3）Tab.4 Content changes of effective constituents before and after fermentation（n＝3）

3.5 發酵前后抗氧化活性變化 圖4 顯示，發酵后DPPH、超氧陰離子、羥自由基清除活性均加強，其原因一方面為有效成分發生了轉化，具有較強的抗氧化活性；另一方面，在發酵過程中酵母菌通過自身生長代謝產生一些活性物質，可能使其抗氧化活性增加。

圖4 發酵前后對超氧陰離子自由基（A）、DPPH 自由基（B）、羥自由基（C）清除率變化Fig.4 Scavenging rate changes on superoxide anion free radical（A），DPPH free radical（B）and hydroxyl free radical（C）before and after fermentation

4 討論

本實驗首先通過發酵前后水浸出物、醇浸出物含量及發酵過程中pH 值確定發酵終點，發現三者在48 h 后趨于穩定，表明已達到了發酵終點。再以黃酮含量為指標，設計三因素三水平正交試驗對發酵工藝進行優化，最終確定為溫度30 ℃，含水量66%，加菌量10%。最后考察了有效成分含量及自由基清除活性，發現發酵后黨參黃酮、多糖、三萜、黨參炔苷、總氨基酸含量分別升高了70.27%、47.92%、128.00%、41.38%、69.90%，而總糖、低聚糖含量分別降低了7.56%、35.95%；發酵產物95%乙醇提取物對DPPH、超氧陰離子、羥自由基的清除活性較高。新鮮黨參通過酵母菌發酵后，多糖含量增加，總糖、低聚糖含量降低，可為開發適用于糖尿病患者的特醫食品提供一定思路。