電子眼、電子鼻和電子舌鑒別不同品種、不同產(chǎn)地生地黃

李建軍 常筱沛 馬靜瀟 賀敬穎 董世可楊梅

（1.河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 河南 新鄉(xiāng)453007； 2.天津埃文森科技有限公司， 天津300384）

地黃為玄參科地黃屬Rehmannia glutinosaLibosch.的多年生草本植物［1］，主產(chǎn)于河南、山西等地，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品。地黃以河南道地產(chǎn)區(qū)“古懷慶府”產(chǎn)者最佳，所產(chǎn)地黃稱懷地黃，屬“四大懷藥”之一。地黃藥材根據(jù)炮制方法的不同分為鮮地黃、生地黃和熟地黃。鮮地黃秋季采挖，呈紡錘形或條形；生地黃為地黃緩緩烘培至八成干所得，多為不規(guī)則團(tuán)塊狀；熟地黃為地黃加工炮制而成，多為不規(guī)則塊片［1?2］。

目前，對生地黃的真?zhèn)蝺?yōu)劣評價(jià)往往以傳統(tǒng)的經(jīng)驗(yàn)鑒別為主，主觀性較強(qiáng)，描述模糊，缺乏客觀的量化指標(biāo)。現(xiàn)在多種現(xiàn)代化技術(shù)分析手段在地黃的鑒別研究中得到應(yīng)用，如HPLC 多成分測定法、DNA 條形碼技術(shù)、電感耦合等離子體質(zhì)譜法等［3?7］。這些方法雖能對地黃進(jìn)行準(zhǔn)確分析鑒別，但普遍存在耗時(shí)長、預(yù)處理復(fù)雜、成本高等缺點(diǎn)。故采用電子眼、電子鼻、電子舌技術(shù)，運(yùn)用主成分分析方法對地黃顏色、氣味、滋味進(jìn)行區(qū)分鑒別，擬建立更為客觀準(zhǔn)確，能快速識(shí)別的方法，為地黃藥材的鑒別、質(zhì)量評價(jià)及其產(chǎn)業(yè)持續(xù)發(fā)展提供新思路。

1 材料

在懷區(qū)收集目前種植和流通量最大的9 種地黃主栽品種，編號1～9，于2019 年4 月種植在溫縣農(nóng)科所地黃資源圃中，常規(guī)田間管理；不同產(chǎn)地“北京3 號”地黃分別種植在河南、山西、陜西、甘肅，編號10～13，詳見表1。均于2019 年12 月采收，經(jīng)河南師范大學(xué)李發(fā)啟教授鑒定為玄參科地黃屬地黃Rehmannia glutinosaLibosch.。將所得鮮地黃參照文獻(xiàn)［8］ 報(bào)道的生地黃加工技術(shù)方法，置于58 ℃鼓風(fēng)干燥箱中，烘焙置完全透心，發(fā)汗12 h，制備成生地黃。

表1 生地黃來源Tab.1 Sources of raw R.glutinosa

IRIS VA400 電子眼系統(tǒng)（法國Alpha MOS 公司）；Heracles NEO 電子鼻系統(tǒng)（法國Alpha MOS公司）；ASTREE Ⅱ電子舌系統(tǒng)（法國Alpha MOS公司）；電子天平（瑞士Meteler?Toledo 公司）；ZRD?A5110 鼓風(fēng)干燥箱（上海智城分析儀器制造有限公司）；低溫磨粉機(jī)（德國海蒂詩公司）。

正構(gòu)烷烴標(biāo)準(zhǔn)溶液（nC6～Nc16）（法國Alpha MOS 公司）；蒸餾水（廣州屈臣氏食品飲料有限公司）；0.1 mol／L HCl 溶液（法國Alpha MOS 公司）。

2 方法

2.1 生地黃電子眼分析 電子眼是以仿生學(xué)為基礎(chǔ)的一種能對復(fù)雜非均質(zhì)樣品視覺信息進(jìn)行分析、識(shí)別的檢測儀器，模擬人眼對樣品的感知，主要應(yīng)用于飲料、食品的色彩分布等研究［9］。將生地黃樣品放置白板紙上，每個(gè)品種包含3 個(gè)批次，電子眼開機(jī)后穩(wěn)定15 min 使光源無偏差，待燈綠開始使用。校正鏡頭曝光度和焦距等數(shù)值，使用24 色色彩校正板進(jìn)行校正，光圈采用5 mm，光源使用D65，打開頂部光源以消除背景。校正后拍照，每個(gè)樣品選取至少5 個(gè)不同部位進(jìn)行成像分析處理。

2.2 生地黃電子鼻分析 電子鼻是一種能客觀全面對復(fù)雜氣味進(jìn)行快速定性和定量分析的電子系統(tǒng)，可模擬人的嗅覺，通過信號處理系統(tǒng)對樣品的氣味進(jìn)行分析，主要應(yīng)用于煙酒、茶葉、化工、食品、環(huán)境等檢測［10?12］。將生地黃樣品用組織搗碎機(jī)進(jìn)行打粉，過5 號篩，稱量1.0 g 地黃粉末置于20 mL 的電子鼻專用頂空瓶中，使用PTFE 隔墊嚴(yán)密隔絕氣味，待分析樣品置于自動(dòng)進(jìn)樣器上［13?14］。校準(zhǔn)液為正構(gòu)烷烴標(biāo)準(zhǔn)溶液（nC6～Nc16）。

2.3 生地黃電子舌分析 電子舌是一種能識(shí)別、分析樣品滋味成分的檢測儀器，能判別出樣品之間味覺的差異，主要應(yīng)用于茶葉、調(diào)味品、酒水等食品味道的評價(jià)［13?16］。本研究分析采用第6 套傳感器 系統(tǒng)，包 括 AHS、PKS、CTS、NMS、CPS、ANS、SCS 共7 根傳感器。選擇Ag／AgCl 作為參比電極，通過軟件對信號值的分析，能夠在0 到12的刻度上比較不同樣品間的各種滋味的相對強(qiáng)度。將生地黃樣品粉碎，過5 號篩，稱取2 g 粉末于燒杯中，加入50 mL 60 ℃蒸餾水，超聲處理30 min，靜置1 h，濾紙過濾后取25 mL 置于電子舌專用燒杯中待測，重復(fù)3次，每檢測1 個(gè)樣品后對傳感器進(jìn)行1 次徹底清洗。樣品采集時(shí)間為120 s，每次分析時(shí)間為180 s。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用Alpha soft 軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，利用主成分分析（PAC）法，通過對原始數(shù)據(jù)向量進(jìn)行線性變換，對多個(gè)數(shù)據(jù)進(jìn)行降維處理，轉(zhuǎn)化為少數(shù)綜合指標(biāo)。

3 結(jié)果

3.1 生地黃電子眼分析結(jié)果

3.1.1 懷區(qū)不同主栽品種生地黃鑒別 對懷區(qū)9種樣品進(jìn)行電子眼的PCA 分析，由圖1 可知，第一主成分（PC1）與第二主成分（PC2）之和達(dá)到了86.722%，代表了樣品絕大部分信息，其識(shí)別指數(shù)為99，識(shí)別指數(shù)框?yàn)榫G色，說明各個(gè)樣品之間在顏色上存在差異。在主成分分析圖中，樣品間的相對距離越近，則樣品整體顏色越接近。“金九”與“85?5”樣品間的相對距離最近，顏色最相近；“噸王”和“懷豐”分別分布在單獨(dú)的區(qū)域且與其他品種相對距離較遠(yuǎn)，顏色差別較大。各樣品整體顏色差異較大，使用電子眼能迅速區(qū)分懷區(qū)不同主栽品種生地黃。

圖1 懷區(qū)不同主栽品種生地黃電子眼主成分分析圖Fig.1 Principal component analysis diagrams of electronic eye for different main plants of R.glutinosa in Henan

3.1.2 同一品種不同產(chǎn)地生地黃鑒別 對不同產(chǎn)地“北京3 號”樣品進(jìn)行電子眼的PCA 分析，由圖2 可知，PC1 與PC2 之和達(dá)到了98.966%，其識(shí)別指數(shù)為100。河南溫縣與山西、陜西、甘肅所產(chǎn)“北京3 號”樣品間相對距離均較遠(yuǎn)，各樣品整體顏色差異較大。其中河南溫縣與山西所產(chǎn)“北京3 號”分別分布在PCA 圖中不同區(qū)域；陜西與甘肅所產(chǎn)“北京3 號”分布在相同區(qū)域，相對距離較近。同一品種不同產(chǎn)區(qū)生地黃的顏色差異與土壤壞境條件有關(guān)，土壤環(huán)境條件越近差異越小，土壤環(huán)境條件越遠(yuǎn)差異越大。

圖2 不同產(chǎn)地“北京3 號”生地黃電子眼主成分分析圖Fig.2 Principal component analysis diagrams of electronic eye for R.glutinosa of ＂ Beijing No.3＂ from different habitats

3.2 生地黃電子鼻分析結(jié)果

3.2.1 懷區(qū)不同主栽品種生地黃鑒別 由圖3 可知，PC1 與PC2 的貢獻(xiàn)率之和達(dá)到了91.644%，其識(shí)別指數(shù)達(dá)到96，說明基于氣味上的差異能有效區(qū)分這9 種懷地黃樣品。在主成分分析圖中，樣品間的相對距離越近，則樣品整體氣味越接近，“師大地黃1 號”與“師大地黃2 號”樣品的相對距離最近，氣味差別較小；懷地黃主栽品種“懷豐”分布在左側(cè)區(qū)域，其它樣品分布在右側(cè)區(qū)域，且各品種間存在一定相對距離，說明“懷豐”氣味與其它樣品差異較大。

圖3 懷區(qū)不同主栽品種生地黃電子鼻主成分分析圖Fig.3 Principal component analysis diagrams of electronic nose for different main plants of R.glutinosa in Henan

3.2.2 同一品種不同產(chǎn)地生地黃鑒別 由圖4 可知，PC1 與PC2 的貢獻(xiàn)率之和達(dá)到了95.057%，其識(shí)別指數(shù)達(dá)到99，說明基于氣味上的差異能有效區(qū)分不同產(chǎn)地地黃樣品。河南溫縣與甘肅所產(chǎn)“北京3 號”各單獨(dú)分布在一個(gè)區(qū)域，與其他產(chǎn)區(qū)氣味差別較大；山西與陜西所產(chǎn)“北京3 號”氣味差別較小，這是由于各產(chǎn)區(qū)不同氣候環(huán)境條件的差異造成的。利用AroChemBases 數(shù)據(jù)庫對篩選出的差異較大的色譜峰進(jìn)行定性可知，生地黃氣味差異可能由于乙醛、乙醇、2，3?丁烷、乙腈、己醛等揮發(fā)性氣體含量差異引起，說明使用電子鼻能迅速區(qū)分同一品種不同產(chǎn)地生地黃，揮發(fā)性成分的差異可作為判別生地黃質(zhì)量優(yōu)劣的參考依據(jù)之一。

圖4 不同產(chǎn)地“北京3 號”生地黃電子鼻主成分分析圖Fig.4 Principal component analysis diagrams of electronic nose for R.glutinosa of ＂ Beijing No.3＂ from different habitats

3.3 生地黃電子舌分析結(jié)果

3.3.1 懷區(qū)不同主栽品種生地黃鑒別 懷區(qū)9 種不同主栽品種懷地黃RSD 分別為0.42%、1.35%、0.56%、0.34%、0.42%、0.22%、0.22%，樣品3次重復(fù)間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差都比較小，說明樣品在重復(fù)測試過程中電子舌儀器的穩(wěn)定性、重現(xiàn)性好。由圖5 可知，PC1 與 PC2 的貢獻(xiàn)率之和達(dá)到了95.060%，其識(shí)別指數(shù)為93，說明這9 種生地黃樣品滋味能夠快速地通過電子舌很好區(qū)分開來。在主成分分析圖中，樣品間的相對距離越近，則樣品整體滋味越接近，其中“金九”與“85?5”樣品的相對距離最近，滋味差別最小；“噸王”與“沁懷”的相對距離最遠(yuǎn)，滋味差別最大。

圖5 懷區(qū)不同主栽品種生地黃電子舌主成分分析圖Fig.5 Principal component analysis diagrams of electronic tongue for different main plants of R.glutinosa in Henan

從圖6 中能更直觀地看出樣品間在滋味上有差別，不同主栽品種懷地黃在不同傳感器上信號反應(yīng)強(qiáng)度存在差異，其中“噸王”在酸味傳感器上相對強(qiáng)度最強(qiáng)，“師大地黃1 號”在咸味傳感器上相對強(qiáng)度最強(qiáng)，“懷豐”在鮮味傳感器上相對強(qiáng)度最強(qiáng)。

圖6 懷區(qū)不同主栽品種生地黃滋味雷達(dá)圖Fig.6 Radar chart for the taste of different main plants of R.glutinosa in Henan

3.3.2 同一品種不同產(chǎn)地生地黃鑒別 不同產(chǎn)地“北京3 號”生地黃樣品RSD 分別為0.20%、0.79%、0.39%、0.28%、0.20%、0.17%、0.15%，說明樣品在重復(fù)測試過程中電子舌儀器的穩(wěn)定性、重現(xiàn)性好。由圖7 可知，PC1 與PC2 的貢獻(xiàn)率之和達(dá)到了99.221%，其識(shí)別指數(shù)為94，說明不同產(chǎn)地地黃樣品滋味能夠快速地通過電子舌很好區(qū)分開來，其中同一生地黃品種“北京3 號”山西與甘肅所產(chǎn)樣品滋味差別最大，且各產(chǎn)地“北京3號”生地黃間存在一定距離。

圖7 不同產(chǎn)地“北京3 號”生地黃電子舌主成分分析圖Fig.7 Principal component analysis diagrams of electronic tongue for R.glutinosa of “Beijing No.3”from different habitats

從圖8 中能更直觀地看出樣品間在滋味上有差別，其中河南溫縣產(chǎn)“北京3 號”生地黃在酸味傳感器上相對強(qiáng)度最強(qiáng)，山西產(chǎn)“北京3 號”生地黃在咸味傳感器上相對強(qiáng)度最強(qiáng)，陜西產(chǎn)“北京3 號”生地黃在鮮味傳感器上相對強(qiáng)度最強(qiáng)，甘肅產(chǎn)“北京3 號”生地黃在咸味傳感器上相對強(qiáng)度較強(qiáng)。

圖8 不同產(chǎn)地“北京3 號”生地黃滋味雷達(dá)圖Fig.8 Radar chart for the taste of R.glutinosa of“Beijing No.3”from different habitats

3.4 擬合分析

3.4.1 懷區(qū)不同主栽品種生地黃 將懷區(qū)9 種不同主栽品種樣品的電子眼、電子鼻和電子舌數(shù)據(jù)整合在一起，數(shù)據(jù)歸一化處理后進(jìn)行擬合分析，結(jié)果見圖9，其中PC1 與PC2 之和達(dá)到了65.588%，其區(qū)分指數(shù)為94，說明各個(gè)樣品之間在顏色、氣味和滋味整體上存在差異。樣品間距離越遠(yuǎn)，整體感官差別越大，其中“懷豐”“噸王”“沁懷”分別分布在圖中不同區(qū)域，相對距離較遠(yuǎn)，與本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)的“懷豐”“噸王”“沁懷”遺傳背景、形態(tài)特征、指標(biāo)成分含量差異較大相符合；“北京3 號”“85?5”“金九”“星科”“師大地黃1號”“師大地黃2 號”相對距離較近，與“北京3號”“85?5”“金九”“星科”“師大地黃1 號”“師大地黃2 號”遺傳背景相近相符合。

圖9 懷區(qū)不同主栽品種生地黃擬合主成分分析圖Fig.9 Principal component analysis diagram for different main plants of R.glutinosa in Henan

3.4.2 同一品種不同產(chǎn)地生地黃 圖10 中PC1與PC2 之和達(dá)到了67.67%，其區(qū)分指數(shù)為91，說明各個(gè)樣品之間在顏色、氣味和滋味整體上存在差異。河南溫縣、山西、陜西、甘肅所產(chǎn)“北京3號”分別分布在主成分分析圖的4 個(gè)區(qū)域，且相對距離較遠(yuǎn)，差異明顯，不同產(chǎn)區(qū)的生態(tài)因子造成不同產(chǎn)區(qū)生地黃整體感觀差異。

圖10 不同產(chǎn)地“北京3 號”生地黃擬合主成分分析圖Fig.10 Principal component analysis diagram for R.glutinosa of “ Beijing No.3 ” from different habitats

4 討論

當(dāng)前地黃藥材市場存在因地黃品種更新?lián)Q代過快，品種之間品質(zhì)參差不齊，品種混雜退化嚴(yán)重，非道地產(chǎn)區(qū)地黃藥材充斥市場，藥材鑒別和質(zhì)量評價(jià)體系缺乏快捷精準(zhǔn)檢測方法和手段。而中藥的顏色、氣味、滋味是評價(jià)藥材質(zhì)量優(yōu)劣、鑒別真?zhèn)渭捌洚a(chǎn)地的重要依據(jù)［17?18］。本研究采用電子眼、電子鼻和電子舌技術(shù)首次對不同品種、不同產(chǎn)地的生地黃在顏色、氣味、滋味上測定分析和比較。電子眼、電子鼻、電子舌均可以有效地將道地產(chǎn)區(qū)不同主栽品種生地黃或同一品種不同產(chǎn)地生地黃迅速區(qū)分開來；生地黃的顏色差異與遺傳背景和土壤環(huán)境條件有關(guān)；氣味成分的差異和滋味（酸味、咸味、鮮味）的綜合評判可以作為地黃藥材質(zhì)量優(yōu)劣評價(jià)的參考依據(jù)。電子眼、電子鼻、電子舌的擬合應(yīng)用可以有效地將道地產(chǎn)區(qū)不同主栽品種生地黃或同一品種不同產(chǎn)地生地黃迅速區(qū)分開來，生地黃顏色、氣味、滋味可作為地黃藥材質(zhì)量優(yōu)劣的參考依據(jù)。

電子眼、電子鼻、電子舌技術(shù)對藥材的鑒別研究在通關(guān)藤真?zhèn)危?1］、南北五味子區(qū)分［13］等中應(yīng)用。該技術(shù)在藥材上的應(yīng)用提高了判別樣品的可操作性，能使樣品分析速度更快捷、精準(zhǔn)，具有樣品無需過多加工處理，過程無污染，數(shù)據(jù)分析結(jié)果更加客觀準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)。電子眼、電子鼻及電子舌技術(shù)已趨于成熟，是中藥質(zhì)量評價(jià)的新嘗試，能準(zhǔn)確判別藥材的顏色、氣味和滋味，具有十分廣闊的應(yīng)用前景。