創傷后神經元自噬水平下降及谷氨酸介導的凋亡增多可導致創傷后癲癇易患性增加*

王潔，柴曉洋，李昱晨，陸克義

（1山西醫科大學第一醫院神經內科，山西 太原 030001；2首都醫科大學附屬北京潞河醫院，北京 101149；3山西醫科大學第一醫院核醫學科，山西 太原 030001）

創傷后癲癇（post-traumatic epilepsy，PTE）是患者在創傷性腦損傷（traumatic brain injury，TBI）一周之后出現的癲癇發作［1］，其潛伏期由數周至數年不等。在TBI患者中PTE的發病率為1.9%～30%［2］。臨床上，基于一些評價標準，如格拉斯哥昏迷評分、顱骨損傷程度、神經影像檢查結果等，可將TBI分為輕度、中度及重度，輕型TBI占TBI的90%以上［3］。輕型TBI后發生PTE危害巨大，然而臨床研究發現，腦電圖［4］、腦磁圖［5］等均無法作為預測PTE發生的有效檢查手段，故尚不知如何預測及預防PTE的發生，明確輕型TBI后PET的發病機制對于早期預測并預防其發生顯得尤為重要。

目前認為，PTE是一種非刺激性、由腦組織功能缺損而誘發的癲癇發作形式。一些研究表明，TBI后引發的興奮性遞質釋放增多、神經細胞丟失［6］及血腦屏障破壞均可增加PTE發生的風險。這些證據提示在PTE潛伏期內發生的神經生物學改變是引起PTE的重要原因。

谷氨酸（glutamate，Glu）是中樞興奮性神經遞質，大腦皮質含量最高。Glu過多可引起活性氧過量生成和/或細胞內抗氧化防御系統受損，使腦細胞過度興奮、自由基產生增多，并進而導致腦細胞損傷，引起癲癇、癡呆等疾病［7］。Glu可通過誘導腦細胞線粒體釋放活性氧，進而導致細胞損傷。有研究發現，通過調節神經元氧化應激損傷［8］、保護線粒體膜電位［9］，可以減弱Glu所介導的細胞毒性作用，發揮神經保護作用。

本研究制備輕型TBI后PTE模型，觀察在PTE潛伏期內，皮層組織谷氨酸、凋亡及自噬水平變化。探討PTE潛伏期內的病理生理改變，為研究PTE的發生機制提供依據。

材料和方法

1 實驗材料

1.1 實驗動物雄性SD大鼠，體重180～220 g，由山西醫科大學實驗動物中心提供，動物合格證編號為：SCXK（晉）2019-0004。大鼠在室溫（25℃）下進行12 h的光照/黑暗循環飼養，適時喂水、喂食。本研究獲得山西醫科大學倫理委員會批準。

1.2 主要試劑兔抗大鼠微管相關蛋白1輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）、beclin-1和β-actin抗體（Cell Signaling Technology）；生物素標記的山羊抗兔IgG、生物素標記的馬抗小鼠IgG和辣根過氧化物酶標記的鏈親和素（北京中衫生物技術有限公司）；caspase ELISA試劑盒為Invitrogen產品；雷帕霉素（rapamycin，Rapa）為LC Laboratories產品；其他試劑均為國產分析純。

2 方法

2.1 輕型TBI后PTE模型制備用10%水合氯醛（3 mL/kg）腹腔注射麻醉大鼠后，將其置入Noble-Collip創傷儀中（直徑約30.5 cm），以每分鐘40轉，轉動5 min。創傷組大鼠隨鼓轉動，每轉1圈跌落1次，sham組大鼠固定于創傷儀內壁，只隨創傷儀轉動，不由高處跌落。觀察造模后大鼠飲食活動情況，觀察并記錄TBI后7～90 d內發生癇性發作大鼠的數量及其發作形式。對于發生癇性發作的大鼠通過腦電圖觀察并記錄其腦電波情況，確認發生癇性發作。TBI后4 d將4μL的100 mmol/L FeCl2水溶液注射至成年SD大鼠感覺運動皮層（硬膜下1.2 mm），注射速度為1μL/min。對照組注射生理鹽水。觀察并記錄TBI后7～90 d內發生癇性發作大鼠的數量及其發作形式。對于發生癇性發作的大鼠通過腦電圖觀察并記錄其腦電波情況，確認發生癇性發作。

2.2 癲癇記錄觀察并記錄大鼠創傷前（30 min）、后（7～90 d）大鼠的行為學變化。用數字攝像機持續監測大鼠的行為。根據Racine［10］制定的分級標準判定癲癇發作：0級（無任何癲癇發作）、Ⅰ級（凝視發作）、Ⅱ級（出現規律性點頭、伴或不伴面部抽動）、Ⅲ級（一側前肢震顫）、Ⅳ級（站立、雙前肢震顫及持續性點頭）、Ⅴ級（前肢震顫加重，失去平衡跌倒而出現全身強直-陣攣性發作）和Ⅵ級（發作衰竭導致死亡）。PTE發生率=發生癇性發作的大鼠數/每組大鼠數×100%。

2.3 電極植入和視頻腦電圖記錄將發作癲癇的大鼠稱重，用水合氯醛（400 mg/kg，腹腔注射）麻醉。將大鼠固定于立體定位儀上，用鑷子輕輕拉出舌頭，防止呼吸道阻塞，兩側對稱，調整齒桿-2.3 mm固定，使顱骨處于同一水平面。用單面刀片剃去頭部毛，用碘伏消毒頭部皮膚。依次切開皮膚、皮下組織及骨膜，鈍性分離骨膜以暴露顱骨。3%H2O2燒灼止血并消毒顱骨表面，清晰暴露前、后囟。用顱骨鉆鉆透顱骨，小心打2個孔。將兩個腦電記錄電極置于顱骨孔中，輕輕接觸皮層。使用牙科水泥覆蓋并固定電極在顱骨上，無線發射端置于肩背側。縫合皮膚，將動物放回鼠籠，置溫暖安靜處，直至清醒。用于記錄腦電信號。

2.4 Western blot將創傷后大鼠海馬組織在冰浴環境中用酶解緩沖液溶解，超聲勻漿后離心，SDSPAGE分離蛋白，將蛋白轉至PVDF膜上，經封閉、與Ⅰ抗孵育、與相應Ⅱ抗孵育后，檢測免疫印跡。配制化學發光液，通過全自動曝光儀顯像，用ImageJ軟件分析條帶灰度值。以β-actin為內參照，得出目的蛋白相對表達量。

2.5 ELISA法取創傷后大鼠海馬組織50 mg組織置于培養皿中，手術剪剪碎，加入200μL預冷的裂解液工作液，冰上用玻璃勻漿器勻漿。將勻漿好的樣本轉移到1.5 mL的離心管中，冰浴放置5 min裂解，12 000 r/min在4°C下離心10～15 min，小心地吸取上清轉移至新的EP管中，并置于冰上待用。取少量樣本用Bradford法測定蛋白濃度，按照試劑盒流程測定caspase-3及caspase-9酶活性。

2.6 高效液相色譜將已經過濾并脫氣的流動相注入儲液罐；用流動相沖洗金屬過濾器，然后將過濾器浸入儲液罐的流動相中；依次啟動高效液相色譜儀：泵→檢測器→高效液相色譜軟件→設置軟件參數；啟動泵，運行5 min，結束后關閉所有排氣閥；以固定的速率（1 mL/min）運行流動相，走基線，直到基線平穩；基線平穩后，在軟件中設置樣品的運行參數；將固定體積的樣品溶液注入進樣閥，然后在軟件中啟動注入命令，進樣器中的樣品溶液就隨流動相進入色譜柱；通過軟件監視各項讀數，當檢測器檢測到樣品所有峰值，停止運行并設置新的進樣。

4 統計學處理

采用SPSS 21.0軟件進行統計分析。數據以均數±標準差（mean±SD）表示。兩組間均數比較用兩樣本t檢驗，多組之間的比較采用單因素方差分析，率的比較采用卡方檢驗或Fisher檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 TBI后大鼠PTE易患性增加

TBI后大鼠7～90 d內PTE的發生率為11.2%，與sham組相比差異有統計學意義（P＜0.01），提示PTE模型制備成功。

為觀察TBI之后大鼠對不良刺激的敏感性，在造模后第4天予大鼠皮層注射明顯低于致癇劑量的FeCl2，結果顯示TBI+FeCl2組73.2%大鼠出現復雜部分性發作，同期sham+FeCl2組無1例大鼠出現癇性發作，TBI+FeCl2組與TBI組及sham+FeCl2組相比均有顯著差異（P＜0.01），見圖1。

Figure 1.Incidence of post-traumatic epilepsy（PTE）of the rats in sham，TBI，TBI+FeCl2，sham+FeCl2 and zVAD+TBI+FeCl2 groups.Mean±SD.n=6.**P＜0.01 vs sham group；##P＜0.01 vs TBI group；△△P＜0.01 vs TBI+FeCl2 group.圖1 各組大鼠PTE的發生率

2 神經細胞凋亡是TBI后PTE易患性增加的可能原因之一

TBI后給予FeCl2檢測到大鼠海馬神經細胞凋亡明顯增多，caspase-3及caspase-9活性升高，與sham+FeCl2組相比差異有統計學意義（P＜0.01），見圖2。

為觀察凋亡對PTE的影響，預先給予凋亡抑制劑zVAD-FMK（zVAD），結果顯示zVAD+TBI+FeCl2組PTE發生率下降至32.6%，與TBI+FeCl2組相比差異有統計學意義（P＜0.01），見圖1。

Figure 2.The activity of caspase-3 and caspase-9 in sham，TBI，sham+FeCl2，TBI+FeCl2，riluzole+TBI+FeCl2 groups.Mean±SD.n=6.**P＜0.01 vs sham group；##P＜0.01 vs sham+FeCl2 group；△△P＜0.01 vs TBI+FeCl2 group.圖2 各組大鼠caspase-3和caspase-9活性

3 PTE潛伏期內腦組織中Glu生成增多可引起神經細胞凋亡水平升高

與sham+FeCl2組相比，TBI+FeCl2組 腦 內Glu含量顯著增多（P＜0.01），見圖3。為進一步明確Glu升高對凋亡的影響，預先給予Glu釋放抑制劑riluzole，結果顯示caspase-3和caspase-9活性均顯著降低（P＜0.01），見圖2。

4 PTE潛伏期內穩定線粒體膜及清除自由基可抑制神經細胞凋亡

與TBI+FeCl2組相比，預先給予線粒體膜穩定劑cyclosporine A可 顯 著 降 低caspase-3和caspase-9活性（P＜0.01），而給予自由基清除劑SOD后，caspase-9和caspase-3活性亦顯著下降（P＜0.05），見圖4。

5 TBI后自噬水平下降可導致神經細胞凋亡增多

與sham+FeCl2組相比，TBI+FeCl2組大腦皮層組織的LC3-II及beclin-1蛋白水平均顯著下降（P＜0.01）；預先給予自噬激動劑Rapa后，自噬水平升高，引起caspase-3水平下降，與TBI+FeCl2組相比有顯著差異（P＜0.01），見圖5。這提示上調自噬可減輕神經細胞凋亡。

Figure 3.Glutamate（Glu）content in rat brain tissues in sham，TBI，sham+FeCl2，and TBI+FeCl2 groups.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs sham group；##P＜0.01 vs sham+FeCl2 group.圖3 各組大鼠腦內Glu含量

Figure 4.Effects of stabilizing mitochondrial membrane and scavenging free radicals on the apoptosis in TBI，TBI+FeCl2，Cyclo+TBI+FeCl2 and SOD+TBI+FeCl2 groups.Mean±SD.n=6.△P＜0.05，△△P＜0.01 vs TBI+FeCl2 group.圖4 穩定線粒體膜及清除自由基對凋亡的影響

Figure 5.The protein expression of autophagy-related molecules and apoptosis-related molecules.Mean±SD.n=6.##P＜0.01 vs sham+FeCl2 group；△△P＜0.01 vs TBI+FeCl2 group.圖5 各組細胞自噬和凋亡相關蛋白的表達情況

討 論

PTE是TBI后的遲發性并發癥之一，TBI可以是由單純腦創傷引起，也可以是全身機械性創傷的局部表現。在實際生活中，TBI往往是一些柔和的以及震蕩性的輕型TBI。輕型TBI通常被稱為運動相關損傷的腦震蕩［11］，輕型TBI的發病率是重度及中度腦損傷的10倍以上。在美國，每年有超過380萬人被診斷出患有外傷性腦損傷，其常見原因包括機動車事故、運動損傷和與工作相關的事故［12］。這部分患者在全身損傷過程中，頭顱及心臟并未出現直接的損傷，然而有研究報道，其PTE發生率［13］明顯升高。目前3種最常用于研究PTE的TBI動物模型是：外側液壓沖擊損傷、重量下降沖擊加速度損傷和受控的皮質損傷。這三種動物模型均需要精確的外科開顱手術，使大腦的結構完整性遭到破壞，均為局灶性損傷，且損傷程度較重。除此之外實行開顱術（或顱骨切除術），可能會對硬腦膜產生輕微損傷或手術期間導致出血，這種損傷本身就有引起癲癇發作的可能。本研究中，我們使用Noble-Collip鼓制輕型TBI后PET模型，該模型可較好的模擬臨床上柔和的以及震蕩性的損傷過程。本研究發現，輕型TBI后大鼠7～90 d內PTE的發生率為11.2%，與既往報道相似，提示模型制備成功。

創傷后癲癇模型的局限性之一在于其PET發生率較低，尤其是輕型TBI后的PET，而非創傷后癲癇動物模型的癲癇發生率相對穩定。嚴重創傷可以直接損傷腦細胞，導致皮層神經細胞異常放電，引起早發性癲癇，而輕度創傷可以通過使神經元細胞對損傷的敏感性增高，導致PTE易患性增加。皮層下注射FeCl2是制造創傷后癲癇的經典模型，通過模擬損傷后紅細胞外滲、溶解和含鐵血黃素沉積于神經纖維網內而導致癲癇發生，其致癇效果與劑量相關，小劑量不足以引起癲癇發作［14］。本研究在TBI后第4天予大鼠皮層下注射明顯低于致癇劑量的FeCl2，期間73.2%大鼠出現復雜部分性發作，而同期對照組中無1例大鼠出現癇性發作。結果表明，輕型TBI后PET對損傷的敏感性增加，提示其潛伏期內可能存在神經生物學改變，進而導致其對輕微損傷的敏感性增加。

細胞凋亡是一種由基因調控和一系列酶參與的細胞主動死亡過程，是一系列caspase級聯反應的結果［15］。caspase可通過多條途徑被活化，其中經線粒體途徑導致線粒體外膜通透化，釋放多種致凋亡因子引起caspase-9活化，最終激活凋亡效應酶即caspase-3，通過水解多種重要的蛋白而導致細胞凋亡。已有研究證實，神經保護劑可以通過減輕TBI后腦水腫及皮層細胞凋亡發揮腦保護作用［16］；通過降低caspase活性進而起到改善TBI后大鼠認知的作用［17］；通過減少TBI后繼發性神經元丟失促進神經功能恢復［18］，提示神經細胞凋亡在TBI后腦損傷過程中發揮了重要作用。本研究發現，與sham+FeCl2組相比，TBI后給予FeCl2檢測到大鼠腦內神經細胞凋亡明顯增多，caspase-3和caspase-9活性顯著升高。為進一步明確PTE易患性增加是否與神經細胞凋亡有關，我們在皮層注射小劑量FeCl2前，給予凋亡抑制劑zVAD-FMK后，caspase-3水平下降，且PTE的發生率明顯下降，提示神經細胞凋亡是TBI后PTE易患性增加的重要原因之一。在生理情況下，細胞凋亡受多種促凋亡分子和（或）抑制凋亡分子之間平衡的調控，而在病理狀況下，調控機制的失衡將導致疾病的發生。因此，闡明PTE潛伏期內促凋亡的機制，將成為預防PTE研究中非常有意義的關鍵環節。

Glu是中樞興奮性神經遞質，Glu過多可引起活性氧過量生成和/或細胞內抗氧化防御系統受損，使腦細胞過度興奮、自由基產生增多，并進而導致腦細胞損傷。有研究發現，Glu可通過誘導腦細胞線粒體釋放活性氧，導致細胞損傷，而通過抑制一氧化氮合酶活性及減少一氧化氮的生成可以減弱Glu所介導的細胞毒性作用，發揮神經保護作用［8］。以上研究提示，腦內Glu產生增多可介導神經細胞損傷。在正常情況下，大多數位于線粒體內膜上的通透性轉換孔（mitochondrial permeability transition pore，MPTP）處于關閉狀態，當機體在各種損傷因素作用下MPTP開放，線粒體膜電位下降，線粒體的通透性升高，細胞內活性氧等物質生成增多，促進細胞凋亡并導致相關器官的損傷。本研究發現，與sham+FeCl2組相比，TBI+FeCl2組檢測到大鼠腦內Glu含量和神經細胞凋亡均明顯增多，以caspase-3及caspase-9的表達增高為主。而預先給予Glu抑制劑后，caspase-3及caspase-9表達下降，提示PTE潛伏期內Glu產生增多可能通過損傷線粒體導致神經細胞凋亡增多。

在進一步探討線粒體損傷在促進凋亡中的作用機制時，我們發現預先給予線粒體膜穩定劑后，caspase-3及caspase-9明顯下降，而給予自由基清除劑后，雖然能夠降低caspase-9明顯，但只能輕度降低caspase-3，而這一現象無法用損傷線粒體釋放活性氧促凋亡的機制解釋，提示由Glu導致的線粒體損傷可能通過其他機制介導神經細胞凋亡。

正常情況下，受損傷的線粒體需要被及時清除以維持細胞的正常活動狀態。研究表明，細胞主要通過自噬選擇性地清除損傷的線粒體［19］。自噬作為真核生物細胞內基本的新陳代謝活動之一，存在于神經元、膠質細胞和細胞外基質中，在其中發揮著的雙刃劍作用［20］，在生理狀況下，自噬能起到保護神經細胞的作用，而自噬的調節失常會引起神經退行性疾病［21］及癲癇［22］。本研究中，我們檢測了PTE潛伏期內神經細胞的自噬水平，結果發現其水平明顯下降，而注射小劑量FeCl2之前預先給予自噬激動劑Rapa后，自噬水平升高，神經細胞凋亡明顯降低，提示自噬水平的降低是導致神經細胞凋亡的可能原因。

綜上所述，本研究發現PTE潛伏期內Glu釋放增多，通過引起自噬水平下降進而導致神經細胞凋亡增加，可能是輕型TBI后PTE易患性增加的機制之一。