CypA/CD147及MMP-2在人慢性牙周炎牙齦組織中CD68+細胞上表達的研究*

余施雷，李娟，楊婷，黃世光△

（1杭州牙科醫院，浙江 杭州 310000；2暨南大學口腔醫學院，廣東 廣州 510632）

牙周炎（periodontitis）是牙周病（periodontal diseases）的主要疾病類型之一，這是一種緩慢進展的發生在牙周軟硬組織上的炎癥性破壞性疾病，最終結局是牙齒病理性松動脫落，喪失咀嚼功能。CD68是單核/巨噬細胞的可靠標記，研究報道在慢性牙周炎中觀察到CD68+細胞的表達均較單純牙齦炎患者增多；而侵襲性牙周炎組織中其表達量又多于慢性牙周炎組織［1-3］。

親環素A（cyclophilin A，CypA）是由單核/巨噬細胞、活化血小板及內皮細胞等分泌的促炎細胞因子，可促進各種細胞類型的炎癥反應［1，4］；還可促進白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-6及腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等分泌，加重炎癥反應［5］。目前研究顯示，CypA可在慢性牙周炎患者牙齦組織、齦溝液（gingival crevicular fluid，GCF）及唾液中檢測到，且其表達水平高于健康牙齦組織［6］。CD147是免疫球蛋白家族的一員，能夠在單核/巨噬細胞表面表達，并且可作為CypA的表面受體［7］。研究者在人健康及炎癥牙齦組織、GCF及唾液中檢測到CD147存在，但其表達水平在炎癥組織中較高［8］。基質金屬蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）由成纖維細胞、內皮細胞、巨噬細胞、嗜中性粒細胞和T細胞等生成，可降解明膠和IV，V，IX型等膠原纖維，其過量表達能夠促進疾病中細胞外基質的降解，在牙周軟硬組織破壞中起到關鍵作用［9-10］。

目前CypA/CD147對MMP-2的調控作用及三者在人慢性牙周炎CD68+細胞上的表達及臨床意義尚未闡明，我們推測CypA與CD147相互作用產生的結果可能是促進體外MMP-2含量增多，通過促使破骨細胞行使破壞功能、加重臨床癥狀如牙槽骨破壞等來參與人牙周炎病變的發展。本研究通過觀察CypA、CD147及MMP-2在CD68+細胞的表達情況，探討CD68+細胞CypA、CD147及MMP-2在不同程度牙周炎組織中的作用及作用機制。

材料和方法

1 實驗材料

Mouse CD68抗體（M0814，Dako Denmark A/S）；抗CypA抗體（bs-5912R，北京博奧森生物公司）；抗CD147抗體（bs-0684R，北京博奧森生物公司）；抗MMP-2抗體（bs-4599R，北京博奧森生物公司）；CY3（山羊抗鼠）（GB21301，武漢賽維爾生物科技有限公司）；FITC（山羊抗兔）（GB22303，武漢賽維爾生物科技有限公司）；DAPI（G1012，武漢賽維爾生物科技有限公司）；BSA（G5001，武漢賽維爾生物科技有限公司）；Ⅱ抗試劑盒（Dako Denmark A/S）；DAB顯色試劑盒（ZLI-9019，北京中杉金橋生物技術有限公司）。普通光學顯微鏡（Leica）；熒光顯微鏡和成像系統（Nikon）。

2 方法

2.1 病例選擇選擇2019年7月～2020年6月就診于暨南大學附屬第一醫院及中山市人民醫院口腔科且自愿接受本研究的60例患者（年齡16～68歲）納入本實驗，其中男32例，平均年齡（37±14）歲；女28例，平均年齡（35±15）歲。根據Armitage等［11］牙周病分類指南為標準，評定分組項目的檢查均由同一名醫生完成，檢查包括牙齦指數（gingival index，GI）、探診深度（probing depth，PD）和附著喪失（attachment loss，AL），影像學觀察牙槽骨吸收程度。按要求分為4組，每組15例。每組患者年齡、性別差異無意義（P＞0.05）。所有選取女性患者均否認懷孕、服用長效或短效避孕藥病史，少數患者或患有心血管或其他系統性疾病，并且至少三個月內未服用抗生素治療。研究方案經暨南大學附屬第一醫院及中山市人民醫院倫理委員會批準同意。告知每位患者實驗內容并簽署知情同意書。在進行牙周治療前，獲取牙齦組織標本。

2.2 實驗分組健康對照組（15例）：牙周健康的正畸牙或智齒。GI=0，PD≤3 mm，AL=0，X線觀察牙槽骨無明顯吸收。

輕度慢性牙周炎組（15例）：種植手術拔除的需行冠延長術或牙周翻瓣術的患牙。GI=1，PD≤4 mm，AL=1～2 mm，X線觀察牙槽骨吸收小于根長1/3。

中度慢性牙周炎組（15例）：需行牙周手術采用內斜切口患牙。GI=2～3，PD=（4～6）mm，AL=（3～5）mm，X線觀察牙槽骨吸收1/3≤根長＜1/2。

重度慢性牙周炎組（15例）：無法保留或預后差的需拔除的患牙。GI=3，PD＞6 mm，AL≥5 mm，X線觀察牙槽骨吸收1/2≤根長＜2/3。

2.3 組織標本采集、處理牙齦組織標本置于10%中性福爾馬林固定液中浸泡24～48 h，制作5μm厚度的連續切片。HE染色后的由兩名病理醫師在光鏡下盲法觀察組織學表達情況后評分，參照Huang等［12］牙齦炎癥程度評分標準（0～3分），取兩人評分均值。

2.4 CD68-CypA、CD68-CD147及CD68-MMP-2雙陽性細胞免疫熒光雙染色CD68陽性信號在胞質及胞膜呈現紅光，CypA、CD147以及MMP-2陽性信號在胞質及胞膜呈現綠光，DAPI核染紫外激發為藍色，同一視野下CD68-CypA、CD68-CD147以及CD68-MMP-2陽性重疊后呈見黃光。切片于400倍鏡下隨機選取5個視野（0.0768 mm2/視野），對每個視野DAPI陽性及表達CD68-CypA、CD68-CD147或CD68-MMP-2雙陽性細胞進行計數取均值，根據所測面積計算單位面積雙陽性細胞密度（cells/mm2）。

3 統計學處理

采用SPSS 25.0 Statistics進行統計分析，數據表示為均數±標準差（mean±SD），設α=0.05為檢驗水準。

（1）牙齦評分數據選擇多獨立樣本比較（Kruskal-WallisH檢驗）分析各組評分是否存在差異性；當P＜0.05時，再對4個組別樣本進行兩兩比較檢驗各個組別間的差異性。

（2）4組標本的CD68-CypA、CD68-CD147、CD68-MMP-2雙陽性細胞密度樣本均數間差別的比較采用One-way ANOVA（本實驗數據采用Levene法檢驗后顯示方差不齊，選取Tamahane"s T2法）。

（3）采用Pearson分析各組CD68-CypA、CD68-CD147、CD68-MMP-2雙陽性細胞密度與慢性牙周炎炎癥程度評分間關系。

（4）采用Pearson分析各組CD68-CypA、CD68-CD147雙陽性細胞密度與CD68-MMP2雙陽性細胞密度間關系。

結 果

1 各組HE染色結果

健康組：結構無明顯異常，多為膠原纖維分布，上皮及固有層內未觀察到明顯炎癥細胞浸潤。輕度組：溝內上皮下方少量炎癥細胞浸潤，膠原纖維變性。中度組：溝內上皮下方炎癥細胞浸潤多于輕度，漿細胞增多，纖維結締組織增生，膠原纖維變性。重度組：上皮釘突伸長至結締組織，見大量炎癥細胞浸潤，淋巴細胞、漿細胞、巨噬細胞散在分布，膠原纖維水解變性（見圖1A）。

各組炎癥評分比較見圖1B、C，統計分析顯示：與健康組的牙齦組織炎癥程度評分相比，慢性牙周炎組牙齦組織的評分顯著升高（P=0.000）；不同炎癥程度牙周炎組間的評分亦存在顯著差異（P＜0.01），評分隨炎癥程度加重而增加。

Figure 1.Histology of human tissues in the 4 groups.A：HE staining（scale bars=50μm），collagen fibers were mostly distributed in healthy group and inflammatory cell gradually increased in periodontitis groups；B：inflammation score distribution；C：comparison of inflammation score.Mean±SD.n=15.**P＜0.01 vs healthy group；##P＜0.01 vs slight group；△△P＜0.01 vs moderate group.圖1 各組病理學結果

2 CD68-CypA DIF染色結果

各組標本組織中CD68-CypA雙陽性細胞染色結果見圖2A。健康組中CD68-CypA雙陽性細胞幾乎無表達，細胞上特異性黃色重疊熒光幾乎未觀察到；輕度組中CD68-CypA雙陽性表達細胞數量稍有增加，見少量細胞上有特異性黃色重疊熒光表達；中度組中存在許多CD68-CypA雙陽性細胞，見較多細胞上有特異性黃色重疊熒光表達；重度組中見大量CD68-CypA雙陽性細胞，大量細胞上有特異性黃色重疊熒光表達。

計算CD68-CypA雙陽性細胞密度后各組間比較（見圖2B、C），統計分析結果顯示：CD68-CypA雙陽性細胞密度在健康組及各組牙周炎牙齦組織中存在顯著差異（F=308.892，P＜0.01），各個組別間比較結果為：輕度組的雙陽性細胞密度高于健康組（P＜0.01），中度高于輕度組（P＜0.01），重度高于輕、中度組（P＜0.01）。

Figure 2.The relevant data of CD68-CypA double-positive cells.A：DIF staining（scale bars=50μm），almost no expression of double-positive cells in healthy group and the double-positive cells gradually increased in periodontitis groups；B：CD68-CypA double-positive cell density distribution；C：analyze of CD68-CypA double-positive cell density expression.Mean±SD.n=15.**P＜0.01 vs healthy group；##P＜0.01 vs slight group；△△P＜0.01 vs moderate group.圖2 CD68-CypA DIF染色結果

3 CD68-CD147 DIF染色結果

各組標本組織中CD68-CD147雙陽性細胞染色結果見圖3A。健康組中CD68-CD147雙陽性細胞幾乎無表達，細胞上特異性黃色重疊熒光幾乎未觀察到；輕度組中CD68-CD147雙陽性表達細胞數量稍有增加，見少量細胞上有特異性黃色重疊熒光；中度組中存在許多CD68-CD147雙陽性細胞，見較多細胞上特異性黃色重疊熒光表達；重度組中存在大量CD68-CD147雙陽性細胞，大量細胞上有特異性黃色重疊熒光表達。

計算CD68-CD147雙陽性細胞密度后各組間比較（見圖3B、C），統計分析結果顯示：CD68-CD147雙陽性細胞密度在健康組及各組牙周炎牙齦組織中存在顯著差異（F=403.264，P＜0.01），各個組間比較結果為：輕度組的雙陽性細胞密度高于健康組（P＜0.01）；中度高于輕度組（P＜0.01）；重度高于輕、中度組（P＜0.01）。

Figure 3.The relevant data of CD68-CD147 double-positive cells.A：DIF staining（scale bars=50μm），almost no expression of double-positive cells in healthy group and the double-positive cells gradually increased in periodontitis groups；B：CD68-CD147 double-positive cell density distribution；C：analyze of CD68-CD147 double-positive cell density expression.Mean±SD.n=15.**P＜0.01 vs healthy group；##P＜0.01 vs slight group；△△P＜0.01 vs moderate group.圖3 CD68-CD147 DIF染色結果

4 CD68-MMP-2 DIF染色結果

各組標本組織中CD68-MMP-2雙陽性細胞染色結果見圖4A。健康組中CD68-MMP-2雙陽性細胞少幾乎無表達，特異性黃色熒光幾乎未觀察到；輕度組中CD68-MMP-2雙陽性表達細胞數量稍有增加，見少量細胞上有特異性黃色重疊熒光表達；中度組中存在許多CD68-MMP-2雙陽性細胞，見較多細胞上有特異性黃色重疊熒光陽性表達；重度組中存在大量CD68-MMP-2雙陽性細胞，大量細胞上有特異性黃色重疊熒光表達。

計算CD68-MMP-2雙陽性細胞密度后各組間比較（見圖4B、C），統計分析結果顯示：CD68-MMP-2雙陽性細胞密度在健康組及各組牙周炎牙齦組織中存在顯著差異（F=254.419，P＜0.01），各個組間比較結果為：輕度組雙陽性細胞密度高于健康組（P＜0.01）；中度高于輕度組（P＜0.01）；重度高于輕、中度組（P＜0.01）。

Figure 4.The relevant data of CD68-MMP-2 double-positive cells.A：DIF staining（scale bars=50μm），almost no expression of double-positive cells in healthy group and the double-positive cells gradually increased in periodontitis groups；B：CD68-MMP-2 double-positive cell density distribution；C：analyze of CD68-MMP-2 double-positive cell density expression.Mean±SD.n=15.**P＜0.01 vs healthy group；##P＜0.01 vs slight group；△△P＜0.01 vs moderate group.圖4 CD68-MMP-2 DIF染色結果

5 相關性分析結果

根據Pearson相關分析結果可得，CD68-CypA雙陽性細胞的相關系數：r=0.959，P=0.000；CD68-CD147雙陽性細胞的相關系數：r=0.948，P=0.000，CD68-MMP-2雙陽性細胞的相關系數：r=0.945，P=0.000（圖5）；表明CD68-CypA雙陽性細胞、CD68-CD147雙陽性細胞及CD68-MMP-2雙陽性細胞密度和牙周炎炎癥程度呈正相關。

根據Pearson相關分析結果可得，各組中CD68-CypA雙陽性表達水平與CD68-MMP-2呈正相關（r=0.933，P=0.000）；CD68-CD147雙陽性表達與CD68-MMP-2雙陽性表達呈正相關（r=0.954，P=0.000），見圖6；表明CD68-CypA和CD68-CD147雙陽性表達均與CD68-MMP2雙陽性表達水平呈正相關。

討 論

牙周炎的病理特征是牙齒周圍支持組織的破壞，雖然目前關于牙周炎的免疫應答機制已經各方面反復進行的研究，但在引起牙周組織感染的細胞因子以及相關的免疫機制仍未明確。在本研究中，以CD68+作為單核/巨噬細胞的標記物，通過免疫熒光染色法觀察到CD68+的表達水平在炎癥牙齦組織中增多，對比各組間數據可見其表達量隨炎癥程度升高而顯著增多，與國內外的研究結果基本相符［1-3］。該結果提示，單核/巨噬細胞的表達水平可以反映出慢性牙周炎的炎癥程度以及牙周組織臨床破壞的程度，其量化標準具有一定的參照意義，再次印證單核/巨噬細胞的表達是判斷牙周炎癥的其中一項指標。

Figure 5.The Pearson analysis of CD68-CypA，CD68-CD147 and CD68-MMP-2 double-positive cell density and the severity of periodontitis.Pearson correlation of CD68-CypA double-positive cell density is r=0.959，P=0.000；CD68-CD147 double-positive cell density is r=0.948，P=0.000；CD68-MMP-2 double-positive cell density is r=0.945，P=0.000.圖5 Pearson相關性分析

Figure 6.The Pearson analysis of CD68-CypA，CD68-CD147 and CD68-MMP-2 double-positive cell density and the severity of periodontitis.Pearson correlation of CD68-CypA double-positive cell density and CD68-MMP-2 double-positive cell density is r=0.933，P=0.000；CD68-CD147 double-positive cell density and CD68-MMP-2 double-positive cell density is r=0.954，P=0.000.圖6 CD68-CypA、CD68-CD147雙陽性表達與CD68-MMP-2雙陽性水平呈正相關

CypA作為促炎細胞因子，不僅可以促進炎癥反應，還可加重炎癥反應［4-5］。在人慢性牙周炎牙齦組織上觀察到CypA和CD147的表達高于健康牙齦，且與CD68+細胞定位高度重合［8，13-16］。在本研究中，我們觀察到CypA的表達與牙周炎的炎癥程度正相關，驗證了CypA在牙周炎癥組織中的重要作用［15-16］。本研究通過免疫雙熒光染色觀察到CD68與CypA、CD68與CD147共定位，牙周炎組中雙陽性細胞密度高于健康組，且計算得到其雙陽性細胞密度與牙周炎癥程度呈正比，間接提示CypA和CD147可能通過趨化單核/巨噬細胞參與牙周炎病程，這與目前的研究報道相符［6，15-17］。

機體在正常生理狀態下，MMPs低水平表達以維持組織內穩態；當病理情況下，其表達水平與激活狀態增高，在牙周炎中表現為降解破壞牙周組織細胞外基質，MMP-2是參與組織動態平衡與重塑的MMPs之一，具有一定的促炎作用［18-19］。在本研究中，觀察到MMP-2在健康牙齦組織中可有少量表達，炎癥組織中表達增多；CD68-MMP-2雙陽性細胞表達量與牙周炎癥水平呈正相關。結合本實驗中CypA、CD147和MMP-2在炎癥組織中的表達情況，提示CypA及CD147可能對MMP-2存在正向調控作用，在CypA/CD147復合體的作用下牙周炎癥加重，并且可能對MMP-2表達有促進作用，但具體機制還需進一步研究。

綜上所述，我們通過DIF法觀察到CD68-CypA雙陽性細胞、CD68-CD147雙陽性細胞及CD68-MMP-2雙陽性細胞在人健康及慢性牙周炎牙齦組織中均有不同程度表達，提示在CD68+細胞上CypA、CD147可能對MMP-2的表達有促進作用，且CD68-CypA、CD68-CD147及CD68-MMP-2雙陽性細胞可能參與牙周組織的降解破壞，并在與其他細胞因子協助下加重牙周炎癥的進展，因此調控MMP-2的水平有望成為防治牙周炎的潛在研究方向，然而由于CypA/CD147相互作用復雜，對于其相互作用及對MMP-2的調控的具體機制尚需深入探究。