尿酸對果蠅生長發育及壽命等的影響及機制*

蘭榕榆，白雪，王景濤，尹相林，3，王嘉淇，3，張睿迪，秦思宇，關寶生，3△，邱洪斌，3△

（1佳木斯大學公共衛生學院，黑龍江 佳木斯 154007；2佳木斯大學基礎醫學院，黑龍江 佳木斯 154007；3黑龍江省痛風研究重點實驗室，黑龍江 佳木 斯154007）

尿酸（uric Acid，UA）是人體內嘌呤代謝的終產物，當體內UA水平長時間超過正常生理濃度則會引起高尿酸血癥（hyperuricemia，HUA），并有一定幾率發展為痛風，從某種意義來講痛風也可以看作是機體的持續高尿酸狀態（或者也可稱之為尿酸化狀態）。UA在體內表現出促氧化和抗氧化的雙重作用，在正常生理濃度時表現為顯著的抗氧化活性，有助于維持機體健康［1］。然而，UA在較低或較高濃度時則表現為促氧化活性，這一過程可能與氧化應激和炎癥的發生發展密切相關［2-5］。果蠅作為人類疾病研究的經典模式生物，體積小，生命周期相對較短，因此可以大量生產且易于使用。果蠅在器官和基因水平上與人類表現出高度的同源性，75%的人類疾病基因在果蠅中具有保守的同源物［6］。同時，果蠅體內具有尿酸代謝的相關途徑。在果蠅體內，攝入的嘌呤在黃嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XOD）的作用下轉變為UA，后者在尿酸氧化酶（urate oxidase，UOD）的作用下分解為尿囊素經馬氏管排出體外，同時，部分UA存于真皮細胞內供機體正常代謝之需［7］。本研究通過構建果蠅的HUA模型，觀察高嘌呤飲食對果蠅蛹化、羽化、攀爬能力、產卵量和壽命的影響，探討高濃度UA降低果蠅壽命的可能機制，為深入研究UA的生理功能提供參考資料。

材料和方法

1 果蠅品系及飼養條件

w1118野生型黑腹果蠅（佳木斯大學）培養于標準的玉米粉培養基中，培養溫度為（25.0±0.5）℃，濕度為（40.0±0.5）%、光照明暗周期為12 h［7-8］。

2 實驗試劑

腺嘌呤購于北京索萊寶生物科技有限公司；酵母購于英聯馬利；ELISA試劑盒購于北京誠林生物科技有限公司。

3 實驗分組

根據前期預實驗，本次實驗共設4個組別，分別為對照組、低濃度干預組、中濃度干預組和高濃度干預組［7］。對照組以標準培養基飼喂，各干預組培養基在標準培養基中分別加入1 g/L（低濃度干預組）、2 g/L（中濃度干預組）和3 g/L（高濃度干預組）的腺嘌呤，制備好的培養基統一裝入果蠅管中備用，培養基厚度約1.0 cm。

4 實驗方法

4.1 高尿酸血癥果蠅模型的制備收集羽化后8 h內果蠅1 000只，雌雄各半，每組250只。雌雄果蠅各5管，每管25只，隨機分為4個實驗組，每3 d更換一次新鮮培養基。

4.2 成蟲體內UA及其相關酶及氧化應激水平的檢測每組雌雄果蠅各取1管培養7 d后（預實驗確定0.3%嘌呤濃度干預下果蠅的平均壽命在7 d左右），將果蠅按重量（g）：蒸餾水（mL）=1∶9的比例，用玻璃勻漿器制成組織勻漿，離心后取上清液，用ELISA試劑盒檢測各實驗組果蠅體內UA、UOD、XOD的水平，以及氧化應激相關指標丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、一氧化氮（nitrogen monoxide，NO）水平和總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）。

4.3 成蟲的壽命實驗每組雌雄果蠅各取4管，用于觀察果蠅生存情況。每天定時記錄果蠅死亡數量，直至果蠅全部死亡，計算果蠅的平均壽命。

4.4 成蟲的產卵量實驗挑選羽化后8 h內的果蠅，將一只雄性果蠅和一只雌性果蠅，加入不同組別的培養基中。在每對果蠅轉移到新鮮食物上24 h后開始測定，每日下午17點定時清點，大約時間周期為成年后的前30 d。每種飲食和性別至少放置10對果蠅，再進行獨立重復實驗。

4.5成蟲的攀爬能力實驗收集羽化后8 h內雌雄果蠅各60只，隨機分配至各組，每組15只，培養7 d后，在沒有麻醉的情況下，將果蠅轉移到干凈的空管中，管口裝有棉花塞，每管25只果蠅。待果蠅適應3 min后，輕輕地將其拍打到管底，待其自發向上攀爬。記錄20 s內成功向上攀爬過5 cm刻度及以上的果蠅數量。實驗重復3次計算平均值。

4.6 幼蟲蛹化率和羽化率的檢測取正常培養基培養的羽化后4～5 d的成蟲按雌雄比5∶1的比例進行雜交，以瓊脂培養基加少許酵母培養。12 h后收卵400只，隨機分配至各組，每組100只，各組干預方式同前。重復實驗3次，分別記錄幼蟲的蛹化和羽化情況，并計算蛹化率和羽化率。

5 統計學處理

采用SPSS 19.0軟件進行統計分析，計量資料用均數±標準差（mean±SD）表示。羽化率和蛹化率的比較采用χ2檢驗，其余各實驗組數據的比較采用單因素方差分析進行統計處理，兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 各實驗組果蠅體內UA及相關酶水平的變化

隨著培養基中腺嘌呤濃度的升高，雌雄果蠅體內UA、UOD和XOD水平逐漸升高，與對照組比較有顯著差異（P＜0.01）。在低濃度干預組與中濃度干預組中，雄果蠅的UA水平顯著高于同組中雌果蠅（P＜0.01）；而在高濃度組中，雄果蠅的UA水平則顯著低于雌果蠅（P＜0.01）。見圖1A。

在低濃度干預組與中濃度干預組中，同組中雄性和雌性果蠅體內的UOD水平無顯著差異；高濃度干預組中雄果蠅體內的UOD水平顯著低于同組中雌果蠅（P＜0.05），見圖1B。對照組中雄果蠅體內的XOD水平顯著低于同組中雌果蠅（P＜0.01）；但在低濃度干預組中，同組中雄性和雌性果蠅體內的XOD水平無顯著差異；在中濃度干預組中，雄果蠅體內的XOD水平顯著低于雌果蠅（P＜0.01）；高濃度干預組中雄果蠅體內的XOD水平顯著高于雌果蠅（P＜0.01），見圖1C。

Figure 1.UA，XOD and UOD levels in female and male Drosophila.Mean±SD.n=25.**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs female group.圖1 各實驗組雌、雄性果蠅體內UA、XOD和UOD的水平

2 尿酸對果蠅成蟲平均壽命的影響

在確定果蠅體內UA水平隨培養基中腺嘌呤濃度的升高而逐漸升高后，我們對不同UA水平果蠅成蟲壽命的變化情況進行了研究。與對照組比較，各干預組果蠅平均壽命顯著縮短（P＜0.01）。在中濃度干預組和高濃度干預組中，雄果蠅的平均壽命顯著低于同一干預組雌果蠅（P＜0.01），見圖2、3。

3 尿酸對果蠅成蟲產卵量的影響

在確定UA水平增加會縮短果蠅成蟲壽命之后，我們對不同UA水平果蠅產卵量的變化情況進行了研究。與對照組比較，中濃度干預組和高濃度干預組中果蠅的產卵量顯著減少（P＜0.01）。與低濃度干預組比較，中濃度干預組和高濃度干預組中果蠅的產卵量顯著減少（P＜0.01）。見表1。

表1 各實驗組果蠅產卵量的變化情況Table 1.Eggs production of Drosophila in each group（Mean±SD.n=10）

4 尿酸對果蠅成蟲攀爬能力的影響

除了對果蠅成蟲的產卵量進行研究，我們還對不同UA水平果蠅攀爬能力的變化情況進行了研究。與對照組比較，中濃度干預組和高濃度干預組中雌性果蠅的攀爬能力顯著降低（P＜0.01）。與對照組比較，各干預組中雄性果蠅的攀爬能力顯著降低（P＜0.01）。對照組中雄果蠅的攀爬能力與雌果蠅無顯著差異；但在低濃度干預組中，雄果蠅的攀爬能力顯著低于雌果蠅（P＜0.05）；中濃度干預組中雄果蠅的攀爬能力與雌果蠅無顯著差異；高濃度干預組中雄果蠅的攀爬能力顯著低于雌果蠅（P＜0.01）。見表2。

表2 各實驗組雌、雄性果蠅的攀爬上線率及Z評分法標化數據表Table 2.Climbing rate and Z-score of Drosophila in each group（Mean±SD）

Figure 2.Average life span of female and male Drosophila in each group.Mean±SD.n=100.**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs female group.圖2 各實驗組雌、雄性果蠅的平均壽命

5 尿酸對果蠅幼蟲蛹化率及羽化率的影響

另外，我們對經不同濃度腺嘌呤干預的果蠅所產卵的孵化情況進行了觀察，深入研究了UA對果蠅幼蟲蛹化和羽化的影響。結果顯示，中濃度干預組與高濃度干預組中果蠅幼蟲的蛹化率與羽化率均為0，低濃度干預組果蠅蛹化率和羽化率顯著低于對照組（P＜0.01）。見表3、4。

Figure 3.Survival analysis of female and male Drosophila in each group.n=100.圖3 各實驗組雌、雄性果蠅的生存分析

表3 各實驗組果蠅幼蟲蛹化率Table 3.The pupation rate of Drosophila larvae

表4 各實驗組果蠅幼蟲羽化率Table 4.The eclosion rate of Drosophila larvae

6 尿酸對果蠅體內氧化應激相關指標的影響

在雌果蠅體內，在低濃度干預組與中濃度干預組MDA水平表現為隨體內UA濃度的升高而升高，且顯著高于對照組（P＜0.01）；而高濃度干預組MDA水平顯著低于對照組（P＜0.01）。各干預組SOD、CAT、GSH-Px及T-AOC水平顯著高于對照組（P＜0.01）；其中，高濃度干預組SOD水平顯著高于低濃度干預組，中濃度干預組與高濃度干預組CAT、GSHPx水平顯著低于低濃度干預組，中濃度干預組與高濃度干預組T-AOC顯著高于低濃度干預組（P＜0.01）。各干預組NO水平顯著低于對照組（P＜0.01）；其中，中濃度干預組與高濃度干預組NO水平顯著低于低濃度干預組（P＜0.01），見圖4。

在雄果蠅體內，各干預組MDA水平顯著高于對照組（P＜0.01）；但中濃度干預組與高濃度干預組MDA水平顯著低于低濃度干預組（P＜0.01）。各干預組SOD、CAT、GSH-Px及T-AOC水平顯著高于對照組（P＜0.01）；其中，中濃度干預組與高濃度干預組SOD、GSH-Px、T-AOC水平顯著高于低濃度干預組，中濃度干預組CAT水平顯著低于低濃度干預組，而高濃度干預組CAT水平顯著高于低濃度干預組（P＜0.01）。各干預組NO水平顯著低于對照組（P＜0.01）；其中，中濃度干預組與高濃度干預組NO水平顯著低于低濃度干預組（P＜0.01）。見圖4。

討 論

HUA的發病率逐年上升，同時伴隨著慢性腎臟病、心腦血管疾病和代謝性疾病的發生［9-10］。相關調查顯示，我國HUA的發病日趨年輕化、低齡化［11-12］。目前，HUA的發病機制尚不明確，有研究顯示HUA與氧化應激密切相關［13-16］。本研究著重探討了機體在高UA狀態下氧化-抗氧化系統的變化，機體在高UA狀態下能夠產生大量氧自由基，從而降低機體抗氧化能力，導致組織細胞損傷，而氧自由基抑制劑能阻止這一進程的發生［17］。

本研究通過高嘌呤飲食構建果蠅的HUA模型，結果顯示隨培養基中腺嘌呤濃度的升高，果蠅成蟲體內UA、UOD、XOD水平均顯著升高，提示果蠅的HUA模型構建成功。另外，課題組注意到不同性別果蠅體內UA、UOD、XOD的變化也不一樣，同組雌、雄果蠅體內上述指標存在顯著差異，提示雌果蠅與雄果蠅相比可能存在某種機制能減少UA的積累，降低高嘌呤飲食導致的機體的損傷作用。正常情況下女性的血清尿酸（serum uric acid，SUA）水平顯著低于同齡男性，且女性的SUA水平在絕經后往往會顯著增加［18］。此外，許多針對絕經后婦女或男女跨性別者的研究表明，雌激素治療可顯著降低SUA水平［19-20］。女性對男性跨性別患者的男性化激素治療可抑制雌二醇水平，并可能提高SUA水平［21］。雌激素誘導的尿酸鹽腎清除率增加被認為是SUA水平性別差異的一種機制［22］。Liu等［23］研究顯示，腎小管上皮細胞雌激素受體β低表達可能導致絕經前系統性紅斑狼瘡患者患HUA。綜上所述，有理由認為，雌果蠅相較于雄果蠅對于高UA較強的抵抗能力，其機制可能與雌果蠅擁有更高的雌激素水平密切相關。

課題組通過上述模型，對高濃度UA影響果蠅成蟲的壽命、產卵量、攀爬能力以及果蠅幼蟲蛹化和羽化的情況進行了觀察。隨著SUA水平的不斷提高，果蠅的平均壽命顯著縮短，且這種壽命縮短的情況在雄果蠅群體中表現更加顯著。然而，中濃度組果蠅體內UA與低濃度組并沒有差別，但是壽命差異顯著，可能是由于UA等指標的檢測僅在果蠅進行了7 d的嘌呤干預，而壽命的指標的檢測則對果蠅進行了終生的相應腺嘌呤濃度的長期干預，從而產生長期的蓄積作用導致中濃度組與低濃度組的壽命差異顯著。

隨著SUA水平的不斷提高，果蠅的產卵量也受到了影響，中、高濃度干預組的產卵量顯著下降。其原因可能有三：（1）生活史理論的關鍵原則之一是繁殖和生存是相互聯系的，并且它們相互權衡［24］。高濃度UA的飲食不適合果蠅生存，雌性在惡劣條件下，保存自己的卵子，戰略性地減少了對生殖的投資，有利于維持體細胞以度過饑餓期，直到資源再次變得充足。而且，大部分生物都傾向于將下一代產在優質的食物中。（2）果蠅體內UA增加提高了其氧化應激程度，雌性果蠅的生殖能力減弱。（3）雄性果蠅體內UA增加可能導致精子活力減弱［25］。

果蠅的攀爬能力也隨著SUA的提高而降低，在雄性果蠅中下降更為顯著。探究其原因，可能有二：（1）HUA導致的尿酸鹽晶體沉積在果蠅的關節處抑制運動；（2）HUA刺激機體產生炎癥反應，引起疼痛抑制了果蠅運動。與雌性果蠅相比，果蠅體內UA濃度增加對雄性果蠅攀爬能力的影響更大，可能是由于雌性果蠅的雌激素水平更高，導致其對于體內UA增加造成的不利影響有更強的抗性。

Figure 4.The changes of oxidative stress indexes of female and male Drosophila in each group.Mean±SD.n=25.**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs low-adenine group.圖4 各實驗組雌、雄果蠅氧化應激相關指標的變化情況

各干預組果蠅產卵后其蛹化率和羽化率的變化也較大，在低濃度干預組中果蠅卵的蛹化率和羽化率分別為68%和65%，中濃度干預組與高濃度干預組中果蠅卵的蛹化率與羽化率均為0，顯著低于對照組。根據成蟲的壽命等一系列觀察指標可以說明實驗組濃度選擇的合理性，然而果蠅幼蟲在中、高濃度干預組中的極低蛹化、羽化率可能是由于與成蟲相比，幼蟲或許對于高濃度UA的適應性更差。課題組將針對果蠅幼蟲進一步優化UA的干預濃度，為后期開展UA的遺傳效應研究奠定基礎。

UA的促氧化能力可能在果蠅的上述變化中起到關鍵作用。對果蠅體內氧化應激的相關指標進行檢測，結果顯示果蠅體內的NO含量隨著其體內UA水平的升高顯著降低，這可能與機體UA水平升高導致體內超氧陰離子自由基（O2-）增加有關［26-27］，O2-可以直接和NO相互作用，增加過氧亞硝基陰離子（ONOO-）的形成［16］，其中ONOO-作為一種較強的氧化劑，造成內皮型一氧化氮合酶解偶聯，同時增強血管內皮細胞中NADPH氧化酶活性，抑制NO的生成與釋放，最終導致了體內氧化水平與抗氧化水平失衡，加重氧化應激損傷［28-30］。當培養基中腺嘌呤濃度在0.2%及以下時，雌雄果蠅體內的MDA水平逐漸升高，提示其體內自由基生成增多，進而加重機體的氧化損傷程度。但隨著果蠅機體UA濃度的進一步升高，雌果蠅體內的MDA水平與對照組比顯著降低。MDA作為自由基脂質過氧化的醛類產物，其含量能反映體內自由基的多少，從而間接推斷自由基對機體的損傷程度，我們的結果提示雌果蠅尚能代償這一濃度UA對機體的影響，筆者認為可能與雌果蠅體內的雌激素有關。另外，課題組對果蠅體內總抗氧化能力這一評價機體抗氧化系統的綜合性指標［31］，以及SOD、GSH-Px、CAT共同組成的抗氧化酶系統進行了實驗觀察。結果顯示，各干預組果蠅體內SOD、CAT、GSH-Px及T-AOC水平隨著體內UA水平的升高而升高，且顯著高于對照組。研究結果提示，隨著果蠅體內UA水平的升高，其體內自由基的生成不斷增加，導致果蠅體內的氧化-抗氧化系統失衡，最終表現為對果蠅壽命的抑制，也進一步明確了氧化應激在代謝紊亂和衰老中的重要作用［32-34］。

綜上所述，本研究進一步揭示了高尿酸血癥與氧化應激的關系，為臨床更好的治療和預防高尿酸血癥提供了參考資料。另外，也進一步證明在臨床上對痛風和高尿酸血癥患者進行尿酸達標治療是非常必要的，可以在一定程度上減輕體內氧自由基的蓄積，避免氧化損傷、以及其他代謝性疾病、心血管疾病的發生和發展［29，35-36］。