核心鐘基因Bmal1通過JNK/caspase-3信號通路抑制缺血再灌注損傷PC12細胞的炎癥及凋亡*

曾富康，張宇星，周德生，陳瑤，劉利娟，李中△

（1湖南中醫藥大學中西醫結合心腦疾病防治湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410208；2湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙 410007）

腦梗死是一種由腦血管供血障礙導致腦缺血、缺氧和相應的神經功能缺損的常見疾病，是世界范圍內導致死亡和殘疾的主要原因［1-2］。治療急性腦梗死的原則是及時恢復缺血區的再灌注，但快速再灌注可加重腦功能損傷，即腦缺血再灌注損傷（cerebral ischemia-reperfusion injury，CIRI）［3］。由于腦組織缺血缺氧，血液再灌注導致自由基的快速形成，導致大量炎癥因子的釋放，細胞內鈣超載，最終激活凋亡基因，導致神經元細胞凋亡。研究表明，在CIRI中，c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）通路的過度激活會加劇炎癥反應和細胞凋亡［4］，而胱天蛋白酶3（caspase-3）作為caspase家族中的一個重要成員，常在細胞凋亡過程中起到關鍵作用，被廣泛用作凋亡的生物標志物［5］。

晝夜節律是自然界從單個細胞到高等生物廣泛存在的生命表象，指生物體為了適應地球上周而復始的變化，逐漸進化而形成的機體固有的節律變化，而這種節律正是在復雜的生物鐘基因及鐘控基因精密的網絡調控下，產生節律震蕩，調節著機體穩態，影響著體內生理病理過程［6］。Bmal1（brain and muscle Arnt-like 1）作為生物鐘的核心基因之一，發揮重要的調控作用。國外實驗發現，Bmal1高表達可顯著減小缺血再灌注小鼠的梗死體積，減輕腦腫脹，降低神經功能缺損評分，促進神經元存活，減少細胞凋亡［7］，但具體調控機制尚不明確。

PC12細胞來源于大鼠腎上腺髓質中的嗜鉻細胞瘤，并具有神經內分泌細胞的一般特性，常被廣泛應用于神經系統疾病的體外研究［8］，因此，我們通過慢病毒轉染建立了PC12細胞Bmal1基因沉默模型和陰性對照模型，并使用氧糖剝奪/復氧（oxygen-glucose deprivation/reoxygenation，OGD/R）誘 導 建 立CIRI的體外損傷模型，探討核心生物鐘基因Bmal1對腦缺血再灌注損傷后PC12細胞炎癥反應及凋亡的影響。

材料和方法

1 材料

1.1 細胞株大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤PC12細胞購自中國科學院上海細胞庫（貨號：TCR9）。

1.2 試劑DMEM高糖培養基（批號：WH0521E91）和DMEM無糖培養液（批號：WH0221E41）均購自武漢普諾賽生命科技有限公司；強效RIPA裂解液（批號：2021JOAC1053+）和CCK-8試 劑 盒（批 號：2021J0GF1008）購自北京普利萊基因技術有限公司；白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA試劑盒（批號分別為N20036303和N21036304）均購自武漢華美生物工程限公司；抗磷酸化JNK、caspase-3和β-actin抗體（批號分別為80024-1-RR、19677-1-AP和66009-1-Ig）均購自武漢三鷹生物技術有限公司；山羊抗兔IgGⅡ抗（批號：SY0102）購自武漢伊萊瑞特生物科技有限公司；超純總RNA提取試劑盒（批號：20200813）購自杭州新景生物試劑開發公司；逆轉錄試劑盒和擴增試劑盒（批號分別為0522011和05238502）購自蘇州近岸科技有限公司；β-actin引物由北京擎科生物有限公司合成；慢病毒si-Bmal1（序列 為5"-CACACATGGTTCCACAGCCAGTGAA-3"）和si-NC（序列為5"-TTCTCCGAACGTGTCACGTAA-3"）購自上海漢恒生物科技（上海）有限公司。

1.3 儀器三氣培養箱和Heraeus Fresco 17型超速冷凍離心機（Thermo Fisher Scientific）；SW-CJ-1FD超凈工作臺（蘇州蘇凈儀器自控設備有限公司）；Cytation 3型多功能酶標儀（BioTek）；Axio Vert A1倒置顯微鏡（ZEISS）；ChemiDocTMXRS+化學發光凝膠成像分析儀、Gel Doc XR+凝膠成像系統、Mini-PROTEAN Tetra型電泳槽和Mini Trans-Blot型轉印槽（Bio-Rad）；CytoFLEX AW39253流式細胞儀（Beckman）。

2 方法

2.1 細胞培養將PC12細胞放入含有3～4 mL完全培養基（89%高糖DMEM+10%胎牛血清+1%青霉素-鏈霉素混合液）的25T培養瓶中，置于37 °C的三氣培養箱（95%O2和5%CO2）中培養，取對數生長期的細胞用于隨后實驗。

2.2 PC12細胞OGD/R處理用無糖DMEM替代培養基，然后在5%CO2和95%N2的條件下放置4 h，后再棄去無糖培養基加入高糖培養基并放入含5%CO2的培養箱復氧24 h建立OGD/R模型［9］。

2.3 慢病毒轉染及si-Bmal1穩轉株建立將PC12細胞作為懸浮液，接種于每孔（6～8）×104的6孔板中24～36 h。當其密度達到40%～50%時，根據MOI=50分別加入合適體積含si-Bmal1和si-NC的慢病毒培養基，24 h后，更換一次培養基。轉染72 h后，通過綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的表達來檢測轉染效率，建立si-Bmal1穩轉株，未處理的PC12細胞作為空白對照組。采用Western blot和RTqPCR檢測si-Bmal1沉默效率。感染復數（multiplicity of infection，MOI）=病毒滴度（TU/mL）×病毒體積（mL）/細胞個數。

2.4 CCK-8法檢測細胞活力采用CCK-8法檢測細胞活力。（1）將細胞分為Bmal1沉默組、陰性對照組及空白組，每組以每孔2×107/L接種于96孔板上。每組重復5個孔，放入三氣培養箱中培養24、48、72和96 h。每孔加入10μL CCK-8溶液，在37℃下孵育2 h，使用酶標儀讀取450 nm處吸光度（A），根據時間和相應的值繪制細胞活力曲線。（2）分組同前，將PC12細胞以每孔2×107/L接種于96孔板，每組重復5個孔。經OGD/R處理后，每孔加入10μL CCK-8溶液，在37℃下孵育2 h，用酶標儀讀取450 nm處A值，并計算細胞活力。細胞活力（%）=（A實驗孔-A空白孔）/（A對照孔-A空白孔）×100%。

2.5 Western blot法檢測JNK/caspase-3信號通路相關蛋白的表達量收集各組細胞，加入RIPA蛋白裂解液、磷酸酶抑制劑，冰上裂解，提取細胞總蛋白，采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白質量濃度，配制成2 g/L的蛋白體系，蛋白樣品經凝膠電泳，轉至PVDF膜，5%牛奶室溫封閉60 min，分別加入p-JNK（1∶5 000）、caspase-3（1∶2 000）和β-actin（1∶8 000）Ⅰ抗，4℃孵育過夜；加入山羊抗兔IgG抗體（1∶8 000），37℃孵育60 min；采用ECL高效化學發光試劑盒顯影，并用ImageJ軟件進行定量分析。

2.6 RT-qPCR檢測Bmal1及JNK/caspase-3信號通路mRNA的表達水平按照超純總RNA提取試劑盒說明書提取細胞總RNA并使用逆轉錄試劑盒合成cDNA，最后使用擴增試劑盒進行RT-qPCR。反應條件設置為：95℃預變性30 s；95℃5 s，58℃30 s，40個循環；熔解曲線分析65～95℃，每0.5℃1個循環檢測熒光信號。采用2-ΔΔCt法進行相對定量分析，以β-actin為內參照。引物序列見表1。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1.Sequences of the primers for RT-qPCR

2.7 ELISA法檢測細胞上清液中炎癥因子水平采用ELISA法檢測各組細胞上清液中IL-1β和IL-6的水平。使用酶標儀讀取樣品在450 nm處的A值。根據標準曲線計算各樣本內炎癥因子的含量。

2.8 流式細胞術及TUNEL染色法檢測各組細胞凋亡率每組的PC12細胞以每孔5×108/L的速度接種在24孔板的載玻片上，用OGD/R處理進行建模。（1）根據凋亡檢測試劑盒的說明進行實驗。在熒光顯微鏡每個樣本隨機選取3個視野，使用ImageJ 5.0軟件計數細胞總數目和TUNEL陽性細胞數，計算TUNEL陽性率。TUNEL陽性率（%）=TUNEL陽性細胞數目/細胞總數目×10%。（2）收集各組PC12細胞，用PBS調節濃度至3×108/L，然后在1 mL細胞懸液中加入200μL Annexin V-APC染色液，再加入20μL碘化丙啶染色液并混合，用流式細胞儀檢測。凋亡指數（%）=凋亡細胞數量/檢測到的細胞總數×100%。

2.9 免疫熒光檢測關鍵蛋白JNK核內表達情況將各組PC12細胞用PBS清洗3次，4%多聚甲醛固定20 min，0.5%Triton X-100通透15 min，5%BSA室溫封閉60 min，加入PBS稀釋的Ⅰ抗（JNK 1∶500），4℃孵育過夜，PBS清洗3次，后加入PBS稀釋的熒光兔Ⅱ抗（1∶500），37℃孵育1 h，PBS清洗后，加入DAPI進行染色，最后抗熒光淬滅劑封片，在熒光顯微鏡下拍照。

3 統計學處理

采用GraphPad Prism 8.0.2進行統計及畫圖，計量資料以均數±標準差（mean±SD）表示。組間比較若符合正態性與方差齊性時，采用單因素方差分析，若不符合正態性時，采用Kruskal-Wallis秩和檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 轉染驗證

如圖1所示，在熒光顯微鏡下可觀察到si-Bmal1組及si-NC組PC12細胞中GFP發出的熒光，blank組則無熒光蛋白表達，表明轉染模型建立成功，確認轉染效率＞90%；如圖2所示，與si-NC組相比，si-Bmal1組PC12細胞中Bmal1的mRNA及蛋白表達水平均顯著下降（P＜0.05）。

Figure 1.Results of fluorescence expression after lentiviral transfection of circadian clock gene Bmal1.圖1 生物鐘基因Bmal1慢病毒轉染熒光表達結果

Figure 2.Validation of transfection efficiency of circadian clock gene Bmal1 silencing.A：the protein expression of Bmal1 detected by Western blot；B：the mRNA expression of Bmal1 detected by RT-qPCR.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs si-NC group.圖2 生物鐘基因Bmal1沉默轉染效率驗證

2 沉默生物鐘基因Bmal1對PC12細胞活力及OGD/R后細胞活力的影響

如圖3所示，在48 h、72 h和96 h時，與si-NC組相比si-Bmal1組細胞活力下降（P＜0.05）；與si-NC組相比，si-Bmal1組在OGD/R后細胞活力抑制程度顯著增加（P＜0.01），提示沉默生物鐘基因Bmal1基因可能會抑制細胞活力及加重OGD損傷。

Figure 3.Effects of circadian clock gene Bmal1 silencing on PC12 cell viability at different time points（A）and after OGD/R（B）.Mean±SD.n=5.*P＜0.05，**P＜0.01 vs si-NC group.圖3 沉默生物鐘基因Bmal1對PC12細胞活力及OGD/R后細胞活力的影響

3 沉默生物鐘基因Bmal1對JNK/caspase-3信號通路相關蛋白的影響

如圖4所示，與blank組相比，OGD/R組p-JNK及cleaved caspase-3蛋白水平顯著上升（P＜0.01）；與si-NC組相比，si-Bmal1組p-JNK及cleaved caspase-3蛋白水平進一步升高（P＜0.05或P＜0.01），提示沉默Bmal1基因會促進JNK蛋白磷酸化和caspase-3蛋白活化。

Figure 4.Effects of circadian clock gene Bmal1 silencing on JNK/caspase-3 signaling pathway-related protein expression.Mean±SD.n=4.##P＜0.01 vs blank group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs si-NC group.圖4 沉默生物鐘基因Bmal1對JNK/caspase-3信號通路相關蛋白表達的影響

4 沉默生物鐘基因Bmal1對JNK/caspase-3信號通路mRNA表達的影響

如圖5所示，和blank組相比，OGD/R組JNK及caspase-3 mRNA表達水平顯著上升（P＜0.01）；與si-NC組相比，si-Bmal1組JNK及caspase-3 mRNA表達水平進一步升高（P＜0.05），提示沉默Bmal1基因會促進JNK及caspase-3的mRNA表達。

Figure 5.Effects of circadian clock gene Bmal1 silencing on mRNA expression of JNK（A）and caspase-3（B）.Mean±SD.n=4.##P＜0.01 vs blank group；*P＜0.05 vs si-NC group.圖5 沉默生物鐘基因Bmal1對JNK和caspase-3 mRNA表達的影響

5 沉默生物鐘基因Bmal1對細胞上清液中炎癥因子水平的影響

如圖6所示，與blank組相比，OGD/R組炎癥因子IL-6及TNF-α水平顯著上升（P＜0.01）；與si-NC組相比，si-Bmal1組IL-6及TNF-α水平進一步升高（P＜0.01），提示沉默Bmal1基因會促進細胞炎癥因子IL-6及TNF-α的分泌。

Figure 6.Effects of circadian clock gene Bmal1 silencing on the levels of inflammatory factors in the cell supernatant.A：IL-6；B：TNF-α.Mean±SD.n=4.##P＜0.01 vs blank group；**P＜0.01 vs si-NC group.圖6 沉默生物鐘基因Bmal1對細胞上清液中炎癥因子水平的影響

6 沉默生物鐘基因Bmal1對細胞凋亡水平的影響

如圖7所示，與blank組相比較，OGD/R組細胞凋亡指數及TUNEL陽性率水平均顯著上升（P＜0.05或P＜0.01）；與si-NC組相比，si-Bmal1組細胞凋亡指數及TUNEL陽性率則進一步升高（P＜0.05或P＜0.01），提示沉默Bmal1基因會加重細胞凋亡。

7 沉默生物鐘基因Bmal1對JNK核內表達的影響

如圖8所示，blank組細胞JNK蛋白于胞漿及細胞核中均有分布；經OGD/R誘導刺激后，JNK蛋白在細胞核內熒光表達強度顯著升高（P＜0.01）；si-Bmal1組JNK蛋白較si-NC組相比在細胞核中熒光表達強度進一步升高（P＜0.05），提示沉默Bmal1基因會促進JNK蛋白的核內表達。

討 論

CIRI是急性腦梗死中常見的病理現象，細胞凋亡是再灌注損傷重要發病機制，也是繼發性腦功能損傷的重要原因，再灌注損傷細胞凋亡的機制可能與一系列炎癥反應和凋亡因子及信號轉導途徑有關。細胞凋亡是一種細胞死亡形式，它是因為細胞內外因素的激活，導致細胞本身自殺程序形成的病理生理過程。目前對于再灌注損傷所引發的細胞凋亡暫無特殊治療方式及藥物，因此減輕細胞凋亡或許能成為腦缺血再灌注損傷的重要干預手段。大量文獻表明，晝夜節律顯著影響腦梗死的易感性、損傷、恢復和治療反應機制［10］。晝夜節律是在細胞水平上發生的一種內源性振蕩，其周期約為24 h，通過生物鐘基因調節著細胞生長代謝，如增殖和分化等，參與了哺乳動物的各種病理生理過程的調節和維持［11］。Bmal1是生物鐘的核心基因之一。研究發現，Bmal1基因敲除可促進人原髓細胞白血病HL-60細胞的凋亡，抑制細胞增殖能力［12］；靶向敲除生物鐘核心基因Bmal1的小鼠不僅顯示出晝夜節律的完全喪失、嚴重地降低了壽命，還伴有各種早衰癥狀和認知缺陷、提高腦血管疾病的發病風險［13］。Bmal1作為生物鐘基因負反饋回路的關鍵調控元件，調節著體內的氧化應激、炎癥反應、凋亡和自噬等過程［14-16］。實驗研究表明，晝夜節律的破壞會加劇腦缺血再灌注小鼠大腦中的炎癥反應，導致缺血性中風后梗死面積增加，可能與免疫反應失調相關［17］。進一步研究發現，核心鐘基因Bmal1可直接通過E-box與其啟動子結合來控制核因子E2相關因子2（nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2）的mRNA表達以調節其活性，缺乏Bmal1的細胞中Nrf2活性顯著降低，導致炎癥細胞因子產生增加［18］。國外研究證明，敲減Bmal1基因會抑制沉默信息調節因子1（silent information regulator 1，SIRT1）的表達，從而加劇了缺氧/復氧（hypoxia and reoxygenation，H/R）刺激下人腎皮質近曲小管上皮細胞HK-2的線粒體損傷，增加細胞凋亡的程度［19］。以上文獻均說明生物鐘Bmal1基因不僅作用于缺血再灌注損傷中的單一機制，而是多重影響著缺血再灌注損傷導致的神經元凋亡、氧化應激及自噬等過程［20］，但Bmal1基因是如何調控細胞凋亡的途徑尚未確定。

Figure 7.Effect of circadian clock gene Bmal1 silencing on the level of apoptosis.A：flow cytometry；B：TUNEL staining.Mean±SD.n=3.#P＜0.05，##P＜0.01 vs blank group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs si-NC group.圖7 沉默生物鐘基因Bmal1對細胞凋亡水平的影響

Figure 8.Effect of circadian clock gene Bmal1 silencing on JNK protein expression.Mean±SD.n=3.##P＜0.01 vs blank group；*P＜0.05 vs si-NC group.圖8 沉默生物鐘基因Bmal1對JNK蛋白表達的影響

JNK是絲裂素活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）家族成員之一，也被稱為應激活化蛋白激酶（stress-activated protein kinase，SAPK）。JNK通路調節多種生理病理過程，包括炎癥反應、細胞分化、細胞增殖和凋亡等［21］，是已被證實在缺血再灌注損傷中發揮重要調控作用的信號通路之一，且在缺血再灌注損傷過程中存在過度激活現象，抑制JNK通路可保護神經元免受損傷［22］。JNK在細胞質及細胞核中均有分布，受到刺激后，JNK在細胞核中迅速顯著積累，導致相應基因的表達發生改變［23］。研究顯示，腦缺血再灌注的刺激首先激活JNK信號通路，被激活的JNK又可進一步磷酸化其核底物及胞漿底物，促進神經元的凋亡。JNK激活后可通過2條途徑發揮作用：一是上調促凋亡相關蛋白和炎癥因子如Bax、FasL和TNF等的表達從而激活死亡受體凋亡通路，另一條途徑是通過調節Bcl-2家族成員的活性參與線粒體介導的細胞凋亡通路，通過這2條途徑激活的caspase-3可激活CAD（caspase-activated DNase），并可切割核DNA修復酶，從而導致核DNA不可復性的損傷，最終導致細胞凋亡［24］。我們實驗結果發現PC12細胞在OGD/R誘導后細胞活力顯著下降，JNK mRNA及p-JNK蛋白水平均上升，JNK蛋白核內表達增強，下游蛋白caspase-3被激活mRNA及蛋白表達均上調，炎癥因子TNF-α和IL-6水平升高，細胞凋亡數增加，提示OGD/R誘導會激活JNK通路，從而促進炎癥因子的釋放及細胞凋亡。

綜上所述，我們猜測Bmal1基因是否能夠通過調控JNK信號通路來減少細胞炎癥反應及凋亡損傷，因此我們通過慢病毒轉染建立PC12細胞Bmal1基因沉默模型及陰性對照模型，采用OGD/R誘導建立CIRI體外模型。結果顯示，沉默生物鐘基因Bmal1表達可顯著抑制PC12細胞的活力，這與既往的研究結果相符，但Bmal基因調控細胞增殖的機制此次實驗未能深入研究。我們還發現相較正常組及Bmal基因陰性對照組，Bmal1基因沉默會增強OGD/R對細胞活力的抑制作用，增加炎癥因子IL-6和TNF-α的分泌，促進細胞凋亡。我們通過Western blot、RT-qPCR及免疫熒光等檢測手段發現Bmal1基因沉默組在OGD/R后相較模型組及Bmal1基因陰性對照組JNK信號通路及下游caspase-3其蛋白及基因的表達水平進一步升高，炎癥因子水平IL-6和TNFα進一步增加，Bmal1基因沉默組免疫熒光JNK蛋白核內的高表達情況亦佐證了Bmal1基因對JNK/caspase-3信號通路具有調控作用。我們證實沉默核心鐘基因Bmal1會促進JNK/caspase-3信號通路過度激活從而加重腦缺血再灌注損傷后細胞炎癥反應及凋亡損傷。或許生物鐘基因可以作為一種新的治療靶點，通過調節生物鐘或它的重要組成部分來降低CIRI所引發的細胞炎癥反應及凋亡損傷。